陳 靖，柴 玲，趙夏蔭

（1.常德職業(yè)技術(shù)學院，湖南 常德 415000； 2.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西中藥質(zhì)量標準研究重點實驗室，廣西 南寧 530022； 3.中國中藥控股有限公司，廣東 佛山 528000）

蜂膠為蜜蜂科昆蟲意大利蜂ApismelliferaL.工蜂采集的植物樹脂與其上額腺、蠟腺等分泌物混合形成的具有黏性的固體膠狀物［1］，酒制蜂膠為該藥材經(jīng)粉碎、乙醇浸泡提取、干燥后的炮制品，臨床上內(nèi)治體虛早衰、高脂血癥、消渴，外治皮膚皸裂、燒燙傷［1］。蜂膠中含有黃酮、酚酸、萜烯酸、糖類、氨基酸等多種成分［2-5］，以黃酮、酚酸為主，具有抗氧化、抗炎、降血糖、抗腫瘤等生物活性［5-8］。

目前，國內(nèi)外學者關(guān)于蜂膠的研究大多為功能成分、生物活性，鮮有涉及藥動學方面［9-10］。喬松素、白楊素、高良姜素、對香豆酸、山柰酚、柚皮素為蜂膠中重要的黃酮、酚酸類物質(zhì)［10］，但其藥動學、代謝產(chǎn)物尚不明確，故闡明它們在體內(nèi)的代謝規(guī)律、鑒定其代謝產(chǎn)物對揭示蜂膠藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義。

超高效液相與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有良好的定量與定性能力［11］，可實現(xiàn)入血成分的快速識別、解析，已成為入血成分研究的首選方法［12］。本實驗采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜 （UPLC-Q Exactive Orbitrap MS） 法測定酒制蜂膠中喬松素、白楊素、高良姜素、對香豆酸、山柰酚、柚皮素的血藥濃度，開展體內(nèi)藥動學分析，并對其代謝產(chǎn)物進行鑒定，以期為該炮制品藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機制的進一步研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Q-Exactive 四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)、UltiMate 3000 超快速高效液相色譜系統(tǒng)（美國熱電公司）； Milli-Q 純水儀（美國密理博公司）； 艾本德5810R 真空濃縮儀（德國艾本德公司）； KQ2200DV 數(shù)控聲波清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司）； ME55 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試劑與藥物 喬松素（批號PCS0734）、白楊素（批號PCS0041）、高良姜素（批號PCS0429）、對香豆酸（批號PCS0296）、山姜素 （批號PCS0819）、山柰酚 （批號PCS0796）、柚皮素 （批號PCS0914）、氯霉素 （批號PCS220411） 對照品均購自成都植生化純生物技術(shù)有限公司，純度≥98%。酒制蜂膠（批號220301） 購自湖南一方天江藥業(yè)有限公司，UPLC-MS 法測得喬松素、白楊素、高良姜素、對香豆酸、山柰酚、柚皮素含量分別為16.97、41.28、35.21、4.672、3.135、21.73 mg/g （未檢測到氯霉素）。聚乙二醇400 （上海阿拉丁生物試劑有限公司）。乙腈、乙醇、甲酸均為色譜純（德國默克公司）。

1.3 動物 雌性SD 大鼠，SPF 級，體質(zhì)量（270±10） g，購自廣西醫(yī)科大學動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK （桂） 2020-0003，飼養(yǎng)溫度20 ～25 ℃，相對濕度40% ～55%。

2 方法

2.1 UPLC-Q Exactive Orbitrap MS 分析條件

2.1.1 色譜 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）； 流動相0.1% 甲酸（A） -甲醇（B），梯度洗脫（0～2 min，5%B； 2～13 min，5% ～95%B； 13 ～14 min，95% ～100% B； 14 ～16 min，100% B； 16 ～16.1 min，100% ～5% B； 16.1 ～19 min，5% B）； 體積流量0.3 mL/min； 柱溫30 ℃； 自動進樣器溫度4 ℃； 進樣量2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜 加熱型電噴霧離子源（HESI），正負離子掃描； 傳輸毛細管溫度320 ℃； 鞘氣體積流量35 psi （1 psi＝6.895 kPa）； 輔助氣體積流量10 psi，溫度350 ℃； 掃描模式Full MS/dd-MS2，范圍m/z70 ～1 050； 一、二級掃描分辨率70 000、17 500； 碰撞氣高純氮氣。各活性成分、內(nèi)標質(zhì)譜掃描模式均為負離子模式（HESI-），分子式、母離子m/z分別為C15H12O4、255.065 18 ［M-H］-（喬松素），C15H10O4、253.049 53 ［M-H］-（白楊素），C15H10O5、269.044 44 ［M-H］-（高良姜素），C9H8O3、163.038 97［M-H］-（對香豆酸），C15H10O6、285.039 36 ［M-H］-（山柰酚），C15H12O5、271.060 09 ［M-H］-（柚皮素），C11H12Cl2N2O5、321.003 95 ［M-H］-（內(nèi)標氯霉素）。

2.2 分組、給藥及采血 12 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為空白組和給藥組，禁食（自由飲水） 12 h 后，空白組灌胃給予20% 乙醇-50% PEG400 混合液，給藥組按1.0 g/kg劑量灌胃給予20%乙醇-50%PEG400 溶解的酒制蜂膠混懸液，于0.033、0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、9、12、24、36 h 眼眶靜脈叢采血各約200 μL，置于EP 管中（預(yù)涂0.1% 肝素鈉抗凝液10 μL），4 ℃、6 000 r/min 離心10 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱中保存。

2.3 對照品、內(nèi)標溶液制備 精密稱取喬松素、白楊素、高良姜素、對香豆酸、山柰酚、柚皮素、氯霉素（內(nèi)標）對照品適量，甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度1.0 mg/mL的貯備液，置于-20 ℃冰箱中保存，精密量取適量（氯霉素除外），甲醇制成10.0 μg/mL 溶液，再依次稀釋至系列質(zhì)量濃度（喬松素、白楊素均分別為0.5、1、2、4、10、20、50、100、200 μg/L，高良姜素分別為0.5、1、2、4、10、20、50、100、250 μg/L，山柰酚分別為0.5、1、2、4、10、20、50、100、150 μg/L，對香豆酸分別為10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、8 000 μg/L，柚皮素分別為2、4、10、20、50、100、200、250、500 μg/L），即得對照品溶液。再用甲醇將氯霉素貯備液稀釋至1.0 μg/mL，即得內(nèi)標溶液。

2.4 血漿樣品處理 吸取血漿樣品、甲醇各50 μL，加入內(nèi)標溶液10 μL、乙腈（含0.1%甲酸） 800 μL，渦旋混勻2 min，靜置2 min，13 000 r/min 離心10 min，移取上清液至干凈EP 管中，離心濃縮至干，50 μL 甲醇復(fù)溶，13 000 r/min 離心1 min，取上清液，即得。

3 結(jié)果

3.1 方法學考察

3.1.1 專屬性試驗 取空白血漿、空白血漿＋對照品、灌胃給藥24 h 后血漿樣品適量，按“2.4” 項下方法處理，在“2.1” 項條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，血漿中雜質(zhì)及其他內(nèi)源性物質(zhì)對各活性成分、內(nèi)標無干擾，表明該方法滿足生物樣品的專屬性要求。

圖1 各活性成分UPLC-Q Exactive Orbitrap MS 圖

3.1.2 線性關(guān)系考察 吸取空白血漿、對照品溶液各50 μL，加入內(nèi)標溶液10 μL、乙腈（含0.1%甲酸） 800 μL，按“2.4” 項下方法處理，在“2.1” 項條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），對照品、內(nèi)標峰面積比值為縱坐標（Y） 進行回歸，結(jié)果見表1，可知各活性成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2＞0.99）。

表1 各活性成分線性關(guān)系

3.1.3 精密度、準確度試驗 吸取空白血漿50 μL，加入不同質(zhì)量濃度對照品溶液，得到低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，按“2.4” 項下方法處理，在“2.1” 項條件下進樣測定，結(jié)果見表2。由此可知，各活性成分日內(nèi)、日間準確度為85.10% ～112.15%，精密度RSD 均低于10%，滿足生物樣品分析要求。

表2 各活性成分精密度、準確度試驗結(jié)果（n＝6）

3.1.4 提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)試驗 取低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品各6 份，按“2.4” 項下方法處理，在“2.1”項條件下進樣測定，記錄化合物、內(nèi)標峰面積比值； 另取空白血漿適量，同法操作，記錄兩者比值； 另取甲醇代替空白血漿，同法操作，記錄兩者比值，按文獻［13］ 報道計算提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表2。由此可知，各活性成分提取回收率為87.07% ～110.97%，基質(zhì)效應(yīng)為98.60% ～114.43%，滿足生物樣品分析要求。

3.1.5 穩(wěn)定性試驗 取低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品各6份，分別考察室溫放置2 h、自動進樣器中12 h、反復(fù)凍融3 次、-80 ℃下放置21 d 的穩(wěn)定性［14］，結(jié)果見表3。由此可知，各活性成分準確度為85.44% ～113.82%，RSD 均小于11%，滿足生物樣品分析要求。

表3 各活性成分穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n＝6）

3.2 體內(nèi)藥動學研究 血藥濃度-時間曲線見圖2，再采用WinNonlin 軟件中的非房室模型計算主要藥動學參數(shù)，結(jié)果見表4。由此可知，各活性成分Tmax均在0.30 h 以內(nèi)，表明其吸收均較快；t1/2z依次為山柰酚＜對香豆酸＜喬松素＜高良姜素＜柚皮素＜白楊素； 灌胃給藥后12、24、36 h，血漿中均未檢測到山柰酚； 大多數(shù)活性成分血藥濃度-時間曲線存在“雙峰” 現(xiàn)象。

圖2 各活性成分血藥濃度-時間曲線（±s，n＝6）

表4 各活性成分主要藥動學參數(shù)（±s，n＝6）

表4 各活性成分主要藥動學參數(shù)（±s，n＝6）

活性成分Tmax/hCmax/（ng·mL-1）AUC0 ～t/（ng·mL-1·h） AUC0～∞/（ng·mL-1·h）t1/2z/hMRT0 ～t/h喬松素0.25±0.00124.69±9.93179.52±24.28263.26±56.817.24±3.7913.21±1.68白楊素0.30±0.12138.30±13.53277.30±83.37328.35±117.3011.96±5.9710.57±3.47高良姜素0.25±0.00187.51±17.74430.93±153.07406.15±78.289.73±2.7013.49±5.19對香豆酸0.27±0.154 894.99±836.8021 778.14±858.4522 329.55±749.444.91±0.957.91±0.86山柰酚0.17±0.10102.65±30.7659.76±12.0772.21±9.093.39±1.341.88±0.78柚皮素0.12±0.07182.81±33.48778.35±143.65900.52±149.7410.77±1.6411.35±0.43

3.3 代謝產(chǎn)物鑒定 6 種活性成分中，除了對香豆酸為酚酸類外，其他5 種均為黃酮類。前期報道，上述成分代謝途徑包括Ⅰ相代謝反應(yīng)（羥基化、去羥基化、還原）、Ⅱ相代謝反應(yīng)（甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化）［15］。

將“2.2” 項下不同時間點采集的血漿等體積混合，按“2.4” 項下方法處理，在“2.1” 項條件下進樣測定，總離子流圖見圖3，并且發(fā)現(xiàn)15 種代謝產(chǎn)物，具體見表5。由此可知，各活性成分均發(fā)生了I、Ⅱ相代謝反應(yīng)，以后者為主。

圖3 大鼠血漿UPLC-Q Exactive Orbitrap MS 總離子流圖

表5 各活性成分代謝產(chǎn)物

以喬松素為例。M1 在正離子模式下產(chǎn)生準分子離子峰m/z433.110 05 ［M＋H］＋，其碎片離子m/z257.079 22 與母離子分子量相差176，為后者脫去一分子葡萄糖醛酸所得；m/z153.017 27、131.048 46 與喬松素對照品在正離子模式下的一致，推測可能為該成分發(fā)生葡萄糖醛酸化的代謝產(chǎn)物，即喬松素葡萄糖醛酸，分子式為C21H20O10。M2 在負離子模式下產(chǎn)生準分子離子峰m/z335.022 09 ［M＋H］-，其碎片離子m/z255.065 14 與母離子分子量相差80，為后者脫掉一分子硫酸酯所得，推測可能為喬松素發(fā)生硫酸酯化的代謝產(chǎn)物，即喬松素硫酸酯，分子式為C15H12SO7。

4 討論

體內(nèi)藥動學研究結(jié)果表明，酒制蜂膠喬松素、白楊素、高良姜素、山柰酚、柚皮素、對香豆酸達峰時間均不超過0.3 h，表明它們在大鼠體內(nèi)的吸收速度較快［16］，其中對香豆酸體內(nèi)暴露量遠大于其他成分，提示該成分主要以原型形式吸收入血，而其他5 種黃酮的原型成分最大峰濃度均不高。再鑒定上述6 種成分的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)它們發(fā)生了Ⅰ、Ⅱ相代謝反應(yīng)，推測一旦攝入體內(nèi)后可能經(jīng)歷廣泛的系統(tǒng)前代謝，在腸道、肝臟中通過甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸化等代謝途徑，其原型以極低濃度在體內(nèi)定位［17］，而結(jié)合型代謝產(chǎn)物在生理活動中往往起著重要作用［18］。另外，高良姜素葡萄糖醛酸化代謝出現(xiàn)了2 種同分異構(gòu)體的代謝物，表明經(jīng)肝臟代謝時葡萄糖醛酸化主要發(fā)生在3、7 位羥基上［19］，所鑒定到的高良姜素葡萄糖醛酸A、B 根據(jù)其極性不同，推測可能分別為高良姜素-3-Oβ-D-葡萄糖醛酸、高良姜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸［20］。同時，共鑒定出相關(guān)代謝產(chǎn)物15 個，主要為Ⅱ相代謝物，并且酒制蜂膠入血成分的藥效物質(zhì)形式還有待于進一步研究，其藥效作用機制尚需繼續(xù)在動物、細胞、分子水平進行驗證。