任永寧,劉新鑫,閆巍文,姜姍姍,汪思捷,沙雨欣,王夢君,徐小洪,丁 壯,高 超,尹仁福

(吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)系人獸共患病研究教育部重點實驗室,人畜共患傳染病重癥診治全國重點實驗室,長春 130062)

H9N2亞型AIV自1992年首次在我國檢測到[1],如今已廣泛分布在全國?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示我國H9N2已經(jīng)取代H5和H7亞型,成為AIV中優(yōu)勢亞型[2-3]。研究證明H9N2亞型AIV可為新型重組的H5N1、H5N6、H5N2和H7N9等高致病性流感病毒提供基因片段,為其變異提供材料[4-5]。且近些年來,人感染H9N2禽流感的病例也愈發(fā)增多。因此,定期開展AIV的流行病學(xué)調(diào)查不可或缺。本研究在長春市周邊活禽市場展開調(diào)查,對鑒定為陽性的樣本進(jìn)行全基因組測序及系統(tǒng)發(fā)育分析,為當(dāng)前國內(nèi)H9N2亞型AIV的流行病學(xué)研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源與雞胚 本實驗所涉及的樣本收集來自2021年9月至2023年4月在長春市周邊城鄉(xiāng)活禽市場,共計170份。SPF雞胚購于濟(jì)南賽斯家禽科技有限公司,由本實驗自行孵化至10日齡胚。

1.1.2 主要試劑 Trizol LS Reagent購自Sigma公司;6×loading buffer、DL2000 Marker購自北京聚合美生物科技有限公司;NovoScript?One-Step RT-PCR Kit一步法RT-PCR試劑盒購自蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 待檢測樣品取上清液接種至10日齡SPF雞胚,置于37 ℃培養(yǎng)箱中觀察,72 h后收集雞胚尿囊液。經(jīng)HA-HI檢測后對無血凝性的樣品盲傳2代,如仍未有血凝效價則認(rèn)為AIV陰性。通過血凝抑制實驗確定分離的病毒亞型以及混合感染。血凝陽性樣本總RNA提取按照制造商的建議用Trizol Reagent 分離。使用NovoScript?One-Step RT-PCR Kit 一步法RT - PCR試劑盒鑒定AIV。結(jié)果為陽性按照有限稀釋法純化病毒并進(jìn)行全基因組測序。全基因組擴增引物信息參考霍夫曼引物[6]。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,將陽性條帶送至生工生物工程(上海) 股份有限公司測序。

1.2.2 序列比對與遺傳進(jìn)化分析 使用Lasergene11軟件進(jìn)行序列拼接及同源性分析,利用NetNGlyc 1.0預(yù)測3株分離株的HA和NA基因糖基化位點。在美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)及全球流感基因共享數(shù)據(jù)庫(Global Initiative on Sharing All Influenza Data, GISAID)中下載參考毒株,使用MEGA 7軟件設(shè)置鄰接法(Neighbor-joining, NJ, Bootstrap=1000)進(jìn)行多序列比對,對各基因片段繪制遺傳發(fā)生樹。

2 結(jié) 果

2.1 樣品的檢測與病毒的分離鑒定 本實驗所涉及的樣本收集于長春市周邊城鄉(xiāng)活禽市場共計170份,鑒定為AIV的26份,其中選取3株具有代表性H9N2毒株使用有限稀釋法連傳三代純化后進(jìn)行全基因組測序。三株AIV序列已上傳至GENEBANK,序列號為OR230154至OR230177。將其分別命名為A/chicken/Jilin/HL45/2022、A/pigeon/Jilin/HL55/2022、A/pigeon/Jilin/HL56/2022簡稱(CK/JL/45/22、PGN/JL/55/22、PGN/JL/56/22))并進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 HA基因序列及關(guān)鍵氨基酸位點分析 3株H9N2亞型分離株均來自于長春市活禽市場,HA基因ORF全長均為1683 bp,編碼560個氨基酸。其中HA的蛋白裂解位點為PSKSSR↓GLF,屬于不連續(xù)堿性氨基酸序列,未發(fā)現(xiàn)連續(xù)多堿性氨基酸的插入,符合LPAIV特征。分離株之間HA基因核苷酸同源性為99.7%～99.9%。與經(jīng)典毒株對比后,發(fā)現(xiàn)3株分離株與A/Chicken/HongKong/G9/1997的同源性最高為 87.3%～87.6%。對3株分離株HA基因受體結(jié)合位點進(jìn)行分析如表1所示,發(fā)現(xiàn)Q226L位點、Q227M(H3編號)發(fā)生突變,Q226L位點突變更傾向于結(jié)合α, 2-6唾液酸受體,導(dǎo)致親嗜性由禽類轉(zhuǎn)變?yōu)椴溉閯游?。此?分析發(fā)現(xiàn)3株分離株381位氨基酸位點存在E381K突變,先前研究表明此為一個有利于AIV氣溶膠傳播的關(guān)鍵位點[7]。對3株分離株HA蛋白的糖基化位點進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),3株分離株的HA蛋白具有8個潛在糖基化位點,在29-31、82-84、141-143、298-300、305-307、313-315、492-494、551-553位出現(xiàn)潛在糖基化位點。分離株在313位增加了一個糖基化位點,這會導(dǎo)致病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合和受體結(jié)合能力增強[8]。HA基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析如圖1所示,3株分離株HA基因均屬于BJ-94 like分支。與廈門人流感A/Fujiansiming/19/2021基因高度同源,在進(jìn)化樹屬同一分支。

圖1 HA、NA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig 1 The phylogenetic tree based on genes of HA and NA

表1 H9N2亞型AIV分離株HA關(guān)鍵氨基酸位點分析及潛在糖基化位點分析Tab 1 Analysis of key amino acid sites and potential glycosylation sites in HA of H9N2 subtype AIV isolates

2.3 NA基因序列及關(guān)鍵氨基酸位點分析 3株H9N2分離株NA基因ORF全長均為1463 bp,編碼466個氨基酸。3株分離株核苷酸同源性為99.6%～99.9%。與經(jīng)典毒株氨基酸比對分析如表2所示,發(fā)現(xiàn)3株分離株在NA莖部62-64位都缺少三個氨基酸,這表明毒株對小鼠的毒力可能增強[9]。在紅細(xì)胞吸附位點上存在K68 N、D369S突變,而在431-433位及活性中心位均未發(fā)現(xiàn)突變現(xiàn)象。在氨基酸N70S位點發(fā)生突變,該位點突變可以產(chǎn)生對扎納米韋的耐藥性[10],而在119、274、292位中沒有出現(xiàn)對達(dá)菲有耐藥性的突變位點。3株H9N2分離株NA蛋白糖基化位點如表2所示,其均存在44、66、83、143、197、231、365、399位的糖基化位點。3株H9N2分離株的NA基因均屬于Y280-like分支,其基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析如圖1所示。

2.4 內(nèi)部基因序列及關(guān)鍵氨基酸位點分析 對3株H9N2 亞型AIV毒株內(nèi)部核苷酸同源性基因進(jìn)行分析,各基因節(jié)段同源性為: PB2:99.7%～99.8%、PB1:99.5%～99.8%、PA:99.5%～99.7%、NP:98.9%～99.3%、M:95.0%～96.2%、NS:97.6%～98.6%。3株H9N2分離株的PB2、M基因均屬于G1譜系;PB1、PA、NP、NS均屬于F-98譜系,其內(nèi)部6個基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析如圖2所示。對3株H9N2分離株的PB2蛋白關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在E627K、D701 N均未發(fā)生突變。而在V147I、A184T、I292V、R389K、A588V、T598I、L648V和T676M位點均存在突變。其中V147I突變會增加小鼠致病性、A588V突變提高了病毒在宿主體內(nèi)的適應(yīng)性并使其獲得了在哺乳動物間的傳播能力[11]。此外,對PB1蛋白關(guān)鍵氨基酸的分析發(fā)現(xiàn)PB1上發(fā)生了能增強AIV在雪貂中傳播能力的I368V突變[12]。此前有研究表明PA蛋白672L是影響H9N2亞型AIV氣溶膠傳播特性的關(guān)鍵氨基酸位點[7],本研究3株毒株P(guān)B1蛋白第672位點均不為L。M基因編碼M1和M2蛋白,在M1上第231位沒有發(fā)生與大鼠適應(yīng)性相關(guān)的D231 N突變,而在M2基因片段中發(fā)現(xiàn)S31 N點突變,該位點突變使得病毒對金剛烷胺類藥物產(chǎn)生耐藥性[13]。NS基因編碼NS1蛋白和NS2蛋白,其中NS1蛋白的第42位發(fā)生P42S的突變,這導(dǎo)致AIV對哺乳動物的致病性增強[14]。NS1 V149A突變后,則能夠使病毒在雞體內(nèi)復(fù)制,從而影響病毒對雞的致病性[15]。

圖2 PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig 2 The phylogenetic tree based on genes of PB2, PB1, PA, NP, M and NS

3 討 論

H9N2亞型AIV作為全球廣泛流行的AIV之一,其對世界養(yǎng)殖業(yè)的危害日益增加,這也是相關(guān)從業(yè)者亟待解決的問題之一。本研究于2021年9月至2023年4月長春市周邊城鄉(xiāng)活禽市場采樣檢測并分離鑒定3株H9N2亞型AIV并進(jìn)行全基因組測序。補充了國內(nèi)該亞型AIV毒株的生物學(xué)信息,同時對其分子生物學(xué)特性展開分析。經(jīng)對其核苷酸序列分析,發(fā)現(xiàn)在3株分離株出現(xiàn)HA-Q226L,這表明分離株更傾向于結(jié)合α,2-6唾液酸受體結(jié)合,導(dǎo)致親嗜性由禽類轉(zhuǎn)變?yōu)椴溉閯游铩?株分離株HA基因均屬于BJ-94 like分支,與廈門人流感A/Fujiansiming/19/2021基因高度同源,在進(jìn)化樹屬同一亞分支[16]。這表明我國當(dāng)前AIV傳播迅速,傳播范圍廣泛。家禽業(yè)的從業(yè)者要加強防護(hù)措施。分子遺傳進(jìn)化分析顯示3株毒株的HA基因歸屬于BJ-94譜系中h9.4.2.5亞分支;NA基因歸屬Y280譜系;PB2、M基因均屬于G1譜系;剩余內(nèi)部基因均屬于F-98譜系,這表明本文中分離3株H9N2亞型AIV均屬于G57基因型[17]。有研究表明,自2013年以來,G57基因型AIV病毒為我國主要流行毒株[18]。3株分離株在NA莖部62-64位都缺少三個氨基酸,已經(jīng)被推測為這種缺失模式的短莖NA可能是水禽傳播到陸生家禽,并對其逐漸產(chǎn)生適應(yīng)性的一個重要分子標(biāo)記[19]。PB2 588位點作為PB2-F6 組合突變的關(guān)鍵共適應(yīng)位點,在鳥類和哺乳動物中獲得了比PB2 588位點單突變更高的AIV適應(yīng)性,這表明PB2 588位點與其他突變位點的協(xié)同作用可以進(jìn)一步增強這種共適應(yīng)性,共同適應(yīng)的出現(xiàn)不僅增加了對鳥類和哺乳動物的威脅,而且還可能導(dǎo)致鳥類之間的大流行,并跨越哺乳動物的種間障礙[20]。在針對耐藥性方面發(fā)現(xiàn)在NA在氨基酸N70S位點發(fā)生突變,該位點突變可以產(chǎn)生對扎納米韋的耐藥性[10],而在119、274、292位中沒有出現(xiàn)對達(dá)菲有耐藥性的突變位點。在M2基因片段中發(fā)現(xiàn)S31 N點突變,該位點突變使得病毒對金剛烷胺類藥物的產(chǎn)生耐藥性,而在L26F、V27A、A30V/T/S和G34E位點均未出現(xiàn)耐藥性突變位點。

H9N2亞型AIV如今已被認(rèn)為是AIV基因的主要供體,通過重組共循環(huán)的流感病毒可導(dǎo)致人畜共患重組[21]。自2013年以來, AIV已在中國造成5次連續(xù)人間流行。蒲娟等[22]發(fā)現(xiàn)H9N2在第五次大流行前發(fā)生了包含哺乳動物適應(yīng)性突變的PB2和PA基因的新的H9N2病毒亞分支被重組為共循環(huán)的H7N9病毒,形成了一種新的顯性H7N9病毒基因型。過去的研究表明活禽市場是人感染禽流感的傳播源甚至是潛在的孵化器。本次實驗結(jié)果表明在城鄉(xiāng)結(jié)合地區(qū)中仍能檢測出H9N2亞型AIV,且和不經(jīng)適應(yīng)直接感染人的禽流感毒株高度同源。因此,應(yīng)在已有成績之上繼續(xù)完善一體化的防控機制,加強城鄉(xiāng)結(jié)合地區(qū)的監(jiān)管力度,實現(xiàn)人病獸防,關(guān)口前移、在人與動物間切斷傳染源,以降低人類感染AIV的風(fēng)險。