郭漢忠，徐俊杰，郭 涵， 譚才鄧，林雅琦，黃依屏，杜詠怡，劉曉玲，陳永沛，陳政儒，陳芊樺

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510300；2.佛山復(fù)星禪誠(chéng)醫(yī)院有限公司，廣東佛山 528000）

0 引言

茶樹(shù)菇是一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，具有清熱、明目、平肝等多種功效的食藥用菌，其多糖是一種特殊的生物活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫的功能[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前對(duì)于采用超聲破碎法提取茶樹(shù)菇多糖的研究多集中于子實(shí)體上，但提取時(shí)原料預(yù)處理所耗費(fèi)的時(shí)間成本過(guò)高，所得經(jīng)濟(jì)效益過(guò)低[3]。菌絲體的發(fā)酵周期較短，采用菌絲體為原料可以大大縮短其加工周期，提高提取效率，進(jìn)而提高經(jīng)濟(jì)效益。通過(guò)液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基獲得茶樹(shù)菇發(fā)酵液，優(yōu)化影響超聲破碎提取的因素，提高所提取的菌絲多糖含量，為后續(xù)批量生產(chǎn)茶樹(shù)菇多糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶樹(shù)菇母種

茶樹(shù)菇母種，廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基[4]

（1）PDA 培養(yǎng)基。馬鈴薯質(zhì)量濃度200 g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度20 g/L，氯霉素質(zhì)量濃度100 mg/L，瓊脂粉質(zhì)量濃度20 g/L，pH 值6.0。

（2）液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基。葡萄糖質(zhì)量濃度20 g/L，蛋白胨質(zhì)量濃度10 g/L，KH2PO4質(zhì)量濃度2.5 g/L，MgSO4質(zhì)量濃度1.5 g/L，pH 值6.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

配制的PDA 平板培養(yǎng)基接入茶樹(shù)菇母種后置于26 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)3～4 d，挑取鮮嫩菌絲進(jìn)行二次活化。

1.2.2 發(fā)酵液的制備

將活化后的茶樹(shù)菇菌種與適量無(wú)菌水進(jìn)行勻漿操作，吸取5 mL 菌絲勻漿液接種至100 mL 液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混勻靜置過(guò)夜，于26 ℃搖床中以轉(zhuǎn)速130 r/min 振蕩培養(yǎng)6 d。

1.2.3 茶樹(shù)菇菌絲多糖提取

將發(fā)酵液經(jīng)8 層紗布過(guò)濾，并用蒸餾水反復(fù)清洗干凈菌絲體，于50 ℃的干燥箱中烘干，磨成菌絲粉。再按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的料液比、超聲時(shí)間、超聲功率進(jìn)行超聲破碎，離心取上清液，醇沉，獲得茶樹(shù)菇菌絲多糖粗品，測(cè)多糖含量。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

以獲取的茶樹(shù)菇菌絲發(fā)酵液為基料，提取的茶樹(shù)菇菌絲多糖含量為響應(yīng)量，由料液比、超聲時(shí)間、超聲功率這3 個(gè)因素展開(kāi)探究。

茶樹(shù)菇菌絲多糖提取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 茶樹(shù)菇菌絲多糖提取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.5 正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)所得出的結(jié)果基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)。

茶樹(shù)菇菌絲多糖提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2

表2 茶樹(shù)菇菌絲多糖提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.6 菌絲多糖含量測(cè)定

菌絲多糖含量測(cè)定方法采用苯酚-硫酸法[5-6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對(duì)茶樹(shù)菇菌絲多糖提取率的影響

通過(guò)以液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基所培養(yǎng)得出的茶樹(shù)菇菌絲溶液混勻適量水分，改變其料液比，以茶樹(shù)菇菌絲多糖含量為因變量。

不同料液比對(duì)提取茶樹(shù)菇菌絲多糖的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同料液比對(duì)提取茶樹(shù)菇菌絲多糖的影響

由圖1 可知，在不同的料液比提取條件下，超聲提取所得茶樹(shù)菇菌絲多糖含量隨著料液比的變化而存在明顯差異。當(dāng)料液比為1∶40（g∶mL）時(shí)，所提取的茶樹(shù)菇菌絲多糖含量最高，當(dāng)料液比高于或低于1∶40（g∶mL）時(shí)，出現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)。提取過(guò)程中，提取液中料液比的大小可能會(huì)直接影響提取液的飽和度，進(jìn)而影響超聲破碎菌絲體的效果，導(dǎo)致胞內(nèi)多糖的流出受到不同程度的抑制。因此，在超聲破碎提取過(guò)程中，料液比的大小過(guò)高或者過(guò)低均會(huì)抑制茶樹(shù)菇菌絲多糖的提取。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，1∶40（g∶mL）為茶樹(shù)菇菌絲多糖超聲破碎提取最適料液比，此條件下提取茶樹(shù)菇菌絲多糖含量為1.89%。

2.2 超聲時(shí)間對(duì)茶樹(shù)菇菌絲多糖提取率的影響

通過(guò)以液態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基所培養(yǎng)得出的茶樹(shù)菇菌絲溶液，改變其超聲破碎提取的時(shí)間，以茶樹(shù)菇菌絲多糖含量為因變量。

不同超聲時(shí)間對(duì)提取茶樹(shù)菇菌絲多糖的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同超聲時(shí)間對(duì)提取茶樹(shù)菇菌絲多糖的影響

由圖2 可知，在不同的超聲時(shí)間下，超聲提取所得茶樹(shù)菇菌絲多糖含量隨著超聲時(shí)間的變化而存在顯著差異。當(dāng)超聲時(shí)間小于15 min 時(shí)，所提取的茶樹(shù)菇菌絲多糖含量隨著超聲時(shí)間的增加而增加；當(dāng)超聲時(shí)間高于15 min 時(shí)，出現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，提取茶樹(shù)菇菌絲多糖過(guò)程中，在一定的條件下，超聲破碎提取的時(shí)間大小與提取所得多糖含量成正比，超過(guò)一定范圍后，由于茶樹(shù)菇菌絲體破碎完全，其多糖均以擴(kuò)散到溶液中，因此超聲時(shí)間越長(zhǎng)，其提取的多糖含量沒(méi)有上升趨勢(shì)，甚至延長(zhǎng)超聲時(shí)間還有可能導(dǎo)致已提取的多糖降解為單糖。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，15 min 為茶樹(shù)菇菌絲多糖超聲破碎提取最佳超聲時(shí)間，此條件下提取茶樹(shù)菇菌絲多糖含量為1.94%。

2.3 超聲功率對(duì)茶樹(shù)菇菌絲多糖提取率的影響

通過(guò)以液態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基所培養(yǎng)得出的茶樹(shù)菇菌絲溶液，改變其超聲功率，以茶樹(shù)菇菌絲多糖含量為因變量。

不同超聲功率對(duì)提取茶樹(shù)菇菌絲多糖的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同超聲功率對(duì)提取茶樹(shù)菇菌絲多糖的影響

由圖3 可知，在不同的超聲功率下，超聲提取所得茶樹(shù)菇菌絲多糖含量隨著超聲功率的變化而存在顯著差異。當(dāng)超聲功率小于400 W 時(shí)，所提取的茶樹(shù)菇菌絲多糖含量隨著超聲功率的增加而增加；當(dāng)超聲功率高于400 W 時(shí)，出現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，提取茶樹(shù)菇菌絲多糖過(guò)程中，在一定的范圍內(nèi)，超聲破碎提取的功率大小與提取所得多糖含量成正比，超過(guò)此范圍后，由于茶樹(shù)菇菌絲體破碎完全，其多糖均已提取完畢，因此超聲功率越大，其提取的多糖含量不僅沒(méi)有上升趨勢(shì)，甚至增加超聲功率還有可能導(dǎo)致已提取的多糖轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌镔|(zhì)。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，400 W 為茶樹(shù)菇菌絲多糖超聲破碎提取最佳超聲功率，此條件下提取茶樹(shù)菇菌絲多糖含量為1.69%。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

結(jié)合所得料液比、超聲時(shí)間、超聲功率的單因素試驗(yàn)結(jié)果，以茶樹(shù)菇菌絲體超聲破碎的料液比、超聲時(shí)間、超聲功率3 個(gè)因素為自變量，提取所得茶樹(shù)菇菌絲多糖含量為因變量，設(shè)計(jì)相應(yīng)的正交試驗(yàn)，優(yōu)化茶樹(shù)菇多糖提取工藝。

茶樹(shù)菇菌絲多糖提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 茶樹(shù)菇菌絲多糖提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3 可知，料液比、超聲時(shí)間、超聲功率3 個(gè)因素對(duì)茶樹(shù)菇菌絲多糖提取的影響的大小分別為超聲功率＞料液比＞超聲時(shí)間，且最佳組合為A2B1C2，即超聲破碎提取茶樹(shù)菇菌絲多糖最佳工藝條件為料液比1∶40，超聲時(shí)間10 min，超聲功率400 W，此工藝所提取的茶樹(shù)菇菌絲多糖含量最高，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，此條件下提取茶樹(shù)菇菌絲多糖含量為2.11%，有利于后續(xù)的多糖深加工產(chǎn)品的研發(fā)。

3 結(jié)論

對(duì)茶樹(shù)菇菌絲多糖提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)料液比、超聲時(shí)間、超聲功率等因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，針對(duì)試驗(yàn)結(jié)果分析得出最佳的提取工藝為料液比1∶40（g∶mL），超聲時(shí)間10 min，超聲功率400 W，菌絲多糖含量高達(dá)2.11%。通過(guò)該研究結(jié)論，可以解決使用子實(shí)體為原料提取茶樹(shù)菇多糖所遇到的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、提取時(shí)間長(zhǎng)、提取效率不高等問(wèn)題所導(dǎo)致的其多糖產(chǎn)品深加工成本高，通過(guò)優(yōu)化工藝可以在相同的時(shí)間內(nèi)從菌絲體中提取到更多的茶樹(shù)菇多糖，能制作更經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的且有利于人體健康的茶樹(shù)菇多糖深加工產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益并存的“雙贏”價(jià)值。