高杰，朱雪蛟，范寶超，宋詩瑩，3，許信剛，李彬*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，江蘇 南京 210014；3. 西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)最早可追溯到1971年，首次在英國被發(fā)現(xiàn)，隨后流行于世界多個(gè)地區(qū)和國家[1]，2010年在中國首次暴發(fā)，造成的仔豬死亡率可高達(dá)90%[2-3]。

PED是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)導(dǎo)致的急性、高傳染性的病毒性腸道疾病，仔豬發(fā)病率高，死亡率高[4-5]。PEDV屬冠狀病毒科冠狀病毒屬，基因組為28 kb正鏈RNA，整個(gè)基因組至少包含了7個(gè)開放閱讀框(open reading frame，ORF)，按照5′-ORF1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3′排序[6]，其中包含了S、E、M、N 4種結(jié)構(gòu)蛋白和16種非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF3編碼了一種離子通道蛋白，被認(rèn)為是與毒力相關(guān)的輔助蛋白[7-9]，S蛋白對于PEDV至關(guān)重要，主要負(fù)責(zé)與細(xì)胞上的受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒與細(xì)胞融合，被認(rèn)為是影響致病性和組織嗜性的相關(guān)蛋白[10-12]。

干擾素(interferon，IFN)是應(yīng)對病毒性感染先天性免疫中重要的組成部分，其3種類型中(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型)，Ⅲ型IFN-λ被發(fā)現(xiàn)是IL-10細(xì)胞因子超家族成員[13-14]。人類有4種IFN-λ，分別是IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3和IFN-λ4；豬主要有IFN-λ1和IFN-λ3，IFN-λ2和IFN-λ4尚未確定[15-16]。Ⅰ型和Ⅲ型IFN的誘導(dǎo)過程和作用機(jī)制相似[17-19]，但由于特異性受體的表達(dá)高度受限，Ⅲ型IFN反應(yīng)主要局限于上皮細(xì)胞[19]。腸上皮細(xì)胞在病毒感染后主要對Ⅲ型IFNs作出抗病毒防御反應(yīng)，而腸道中的其他細(xì)胞類型依賴于I型IFN[20]。在抗PEDV感染效果上，IFN-λ1對PEDV感染的IPEC-J2細(xì)胞抗病毒活性高于豬IFN-α，且IFN-λ3較IFN-λ1有更好的抗病毒效果[21-22]。然而，病毒可以突變出多種逃逸IFN的方式，通過NSP1和N蛋白抑制IFN-λ水平[23-24]。但與之相關(guān)的報(bào)道尚不是很多。由于IPEC-J2細(xì)胞并非均質(zhì)，其中只有少數(shù)對PEDV易感[23，25]。本實(shí)驗(yàn)室IPEC-J2細(xì)胞均為PEDV不易感細(xì)胞株。MARC-145為PEDV易感細(xì)胞，是常被用作研究PEDV的宿主細(xì)胞之一[26]。因此，試驗(yàn)中用MARC-145對PEDV感染過程中的分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探索，對了解PEDV如何逃逸IFN-λ機(jī)制對PED的防治工作具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 載體、菌株、病毒和細(xì)胞

大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京Transgen公司；pGL3-Basic、pRL-TK質(zhì)粒及PEDV結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)蛋白真核表達(dá)重組質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[27]；豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)，非洲綠猴胚胎腎細(xì)胞(MARC-145)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存提供；PEDV分離株AH2012/12(登錄號：KU646831.1)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所分離、擴(kuò)增和保存[28]。

1.2 主要試劑耗材

胎牛血清購自Gibco公司；PEDV-N蛋白鼠單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室保存；GAPDH小鼠單克隆抗體，購自Protein Tech公司；HRP 標(biāo)記山羊抗鼠 IgG (H+L)購自Solarbio公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒FastPure Cell/TissueTotal RNA Isolation Kit V2，高保真酶Phanta Max MasterMix，逆轉(zhuǎn)錄酶HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit和熒光定量試劑SYBR Green ChamQ SYBR qPCR Master Mix，均購自諾唯贊公司；F12/DMEM培養(yǎng)基，DMEM高糖培養(yǎng)基，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectimineTM3000，限制性核酸內(nèi)切酶SacⅠ、HindⅢ、XhoⅠ，購自Thermo Fisher公司；Poly(I：C)HMW購自InvivoGen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)Dual-Luciferase?Reporter Assay System購自Promega公司；T4 DNA連接酶購自ABclonal公司；質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit I，膠回收試劑盒Gel Extraction Kit，購自O(shè)mega公司；RIPA蛋白裂解液，全黑96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，購自Beyotime公司。引物和質(zhì)粒測序服務(wù)委托Sangon公司合成和提供。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

在GenBank中查找pIFN-λ1(Gene ID：100217388)、pIFN-λ3(Gene ID：100310828)、PEDV AH2012/12的N基因(GenBank登錄號：KU646831.1)和GAPDH 基因(GenBank登錄號：XM_007967342.2)，根據(jù)序列使用SnapGene設(shè)計(jì)定量檢測引物。使用在線啟動子預(yù)測軟件Promoter-2.0(Promoter-2.0-Services-DTU Health Tech)分析預(yù)測pIFN-λ1和pIFN-λ3啟動子區(qū)域序列，選取pIFN-λ1(-500/-1)和pIFN-λ3(-1500/-1)區(qū)域序列，使用SnapGene設(shè)計(jì)上下游含有酶切位點(diǎn)的重組引物。引物序列見表1。

表1 引物及序列

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

MARC-145細(xì)胞使用10%常規(guī)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，IPEC-J2細(xì)胞使用10%常規(guī)胎牛血清的F12/DMEM培養(yǎng)基，在含5% CO2體積濃度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞生長至70%～90%融合時(shí)使用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑依照說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

轉(zhuǎn)錄本水平篩選PEDV蛋白，MARC-145轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒12 h，同時(shí)設(shè)置空載體pLV轉(zhuǎn)染孔做對照，再轉(zhuǎn)染0.5 μg/mL Poly(I：C)12 h。啟動活性水平篩選共轉(zhuǎn)染pRL-TK 0.1 μg，啟動子質(zhì)粒1 μg和NSP5 1 μg，pLV空載為對照，12 h后轉(zhuǎn)染0.5 μg/mL Poly(I：C)12 h。

1.5 PEDV感染MARC-145細(xì)胞

MARC-145細(xì)胞接種于24孔板長至單層(細(xì)胞數(shù)約105個(gè))，使用含有5 μg/mL胰酶濃度的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋PEDV病毒原液，稀釋至每孔加入200 μL病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)=0.1，吸附90 min。吸附后用PBS清洗1遍細(xì)胞，每孔使用500 μL 5 μg/mL胰酶濃度的高糖DMEM培養(yǎng)基維持細(xì)胞生長。

1.6 重組質(zhì)粒構(gòu)建

使用細(xì)胞總RNA提取試劑盒FastPure Cell/TissueTotal RNA Isolation Kit V2中的gDNA去除柱吸附gDNA，洗滌液清洗后用洗脫液洗脫得到IPEC-J2細(xì)胞基因組DNA，以IPEC-J2細(xì)胞基因組DNA為模板擴(kuò)增pIFN-λ1(-500/-1)和pIFN-λ3(-1500/-1)片段，PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增程序依照高保真酶Phanta Max MasterMix說明書設(shè)置，1%瓊脂糖凝膠電泳后依照膠回收試劑盒Gel Extraction Kit說明書純化目的片段，經(jīng)SacⅠ/HindⅢ、XhoⅠ/HindⅢ雙酶切后使用T4 DNA連接酶連接到相同酶切處理且回收的線性pGL3-Basic載體上，構(gòu)建得到熒光素酶報(bào)告基因載體pIFN-λ1-Luc、pIFN-λ3-Luc。轉(zhuǎn)化大腸桿菌5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐固體培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切和測序驗(yàn)證重組質(zhì)粒的正確性。

1.7 RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)

去除細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS清洗1遍，依照細(xì)胞總RNA提取試劑盒FastPure Cell/ TissueTotal RNA Isolation Kit V2說明書和逆轉(zhuǎn)錄酶HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行RNA提取和cDNA合成。使用熒光定量試劑SYBR Green ChamQ SYBR qPCR Master Mix檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本pIFN-λ1、pIFN-λ3和PEDV-N相對水平。GAPDH基因作為內(nèi)部參照。通過融解曲線分析確定特異性，靶基因的相對轉(zhuǎn)錄水平表示為相對于相應(yīng)內(nèi)參基因閾值周期(Ct值)的倍數(shù)變化，方法使用2-ΔΔCt法。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測

收取細(xì)胞樣品時(shí)棄去上清液培養(yǎng)基，用PBS清洗1遍細(xì)胞，依照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒Dual-Luciferase?Reporter Assay System說明書加入150 μL裂解液，室溫裂解20 min后將裂解液連同細(xì)胞收集在離心管中，12 000 r/min離心1 min，取上清液20 μL加入全黑96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，依次加入螢火蟲熒光素酶底物和海腎熒光素酶底物，每加入1種底物，使用酶聯(lián)免疫分析儀讀取熒光數(shù)值。

1.9 Western blot檢測

蛋白樣品的制備：棄掉細(xì)胞板中培養(yǎng)基，加RIPA裂解液，冰上裂解10 min，加蛋白上樣緩沖液，混勻后金屬浴煮沸10 min，SDS-PAGE分析并進(jìn)行Western blot鑒定。用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗膜3次，根據(jù)檢測靶標(biāo)選擇對應(yīng)抗體，4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次，室溫孵育對應(yīng)HRP二抗60 min，PBST洗滌3次，ECL曝光檢測。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用 GraphPad 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對于每組單獨(dú)的測定，至少評估3個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)。結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 pIFN-λ1和λ3啟動子質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

使用細(xì)胞RNA提取試劑盒，裂解正常生長的IPEC-J2細(xì)胞，將基因組DNA吸附柱上的DNA洗脫作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在500和1 500 bp左右各出現(xiàn)1條條帶，與目的條帶的大小一致(圖1)。啟動子區(qū)域序列擴(kuò)增成功。將目的條帶純化回收，雙酶切后連接在pGL3-Basic載體得到pIFN-λ1-Luc、pIFN-λ3-Luc，經(jīng)菌液PCR、雙酶切(圖2)及測序驗(yàn)證重組質(zhì)粒的正確性，結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M. DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL2000；1. pIFN-λ1(-500/-1)擴(kuò)增產(chǎn)物；2. pIFN-λ3(-1500/-1)擴(kuò)增產(chǎn)物。圖1 pIFN-λ1和pIFN-λ3啟動子序列片段PCR結(jié)果

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1. pIFN-λ1-Luc雙酶切鑒定；2. pIFN-λ3-Luc雙酶切鑒定。圖2 pIFN-λ1-Luc和pIFN-λ3-Luc雙酶切鑒定

***表示P<0.001，下同。圖3 pIFN-λ1和pIFN-λ3的啟動子啟動活性驗(yàn)證

2.2 pIFN-λ1-Luc和pIFN-λ3-Luc啟動子活性的驗(yàn)證

IPEC-J2細(xì)胞接種24孔板長至70%以上融合，每孔共轉(zhuǎn)染pRL-TK 0.1 μg和啟動子質(zhì)粒1 μg，12 h后再次轉(zhuǎn)染0.5 μg/mL Poly(I：C)12 h，收取細(xì)胞樣品進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測。結(jié)果與轉(zhuǎn)染空載體的對照組相比，轉(zhuǎn)染pIFN-λ1-Luc和pIFN-λ3-Luc的熒光數(shù)值極顯著升高(P<0.001)，證明pIFN-λ1和pIFN-λ3的啟動子具有良好的啟動活性。

2.3 PEDV感染對IFN-λ1和IFN-λ3轉(zhuǎn)錄水平的影響

MARC-145細(xì)胞接種24孔板，以MOI=0.1感染PEDV，以只轉(zhuǎn)染0.5 μg/mL Poly(I：C)12 h的細(xì)胞為陽性對照，在感染后的0、4、8、12 h收取試驗(yàn)組細(xì)胞，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測。結(jié)果顯示，PEDV在MARC-145中可以復(fù)制(圖4)。由圖5可見，在感染PEDV 12 h引起IFN-λ1轉(zhuǎn)錄本水平顯著降低，其余時(shí)間點(diǎn)均未引起IFN-λ1和IFN-λ3顯著變化。

A. Western blot檢測；B. 熒光定量PCR檢測。圖4 PEDV在MARC-145細(xì)胞上的增殖情況

**表示P<0.01，下同；A. PEDV對IFN-λ1 mRNA的影響；B. PEDV對IFN-λ3 mRNA的影響。圖5 細(xì)胞感染PEDV后IFN-λ轉(zhuǎn)錄水平的變化

細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pRL-TK和啟動子螢火蟲熒光質(zhì)粒12 h，以MOI=0.1感染PEDV，以轉(zhuǎn)染0.5 μg/mL Poly(I：C)12 h的細(xì)胞為陽性對照，感染后的0、4、12 h收取細(xì)胞樣品進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染PEDV引起IFN-λ1和IFN-λ3啟動活性顯著升高(圖6A、6B)，但與陽性對照較高倍數(shù)升高相比，啟動活性仍然較低。

*表示P<0.05，下同；A. PEDV對IFN-λ1啟動水平的影響；B. PEDV對IFN-λ3啟動水平的影響。圖6 細(xì)胞感染PEDV后IFN-λ啟動水平的變化

2.4 PEDV抑制Poly(I：C)誘導(dǎo)的IFN-λ1和IFN-λ3的升高

設(shè)置Mock組、Poly(I：C)組、PEDV組和PEDV+Poly(I：C)組。MARC-145細(xì)胞生長至單層感染PEDV，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基代替病毒液處理對照組，12 h后轉(zhuǎn)染0.5 μg/mL Poly(I：C)12 h，結(jié)果表明感染PEDV組在轉(zhuǎn)錄本水平顯著降低IFN-λ1和IFN-λ3(圖7A、7B)。

A. PEDV對Poly(I：C)處理的IFN-λ1 mRNA水平的影響；B. PEDV對Poly(I：C)處理的IFN-λ3 mRNA水平的影響；C. PEDV對Poly(I：C)處理的IFN-λ1啟動水平的影響；D. PEDV對Poly(I：C)誘導(dǎo)的IFN-λ3啟動水平的影響。圖7 PEDV對Poly(I：C)處理的細(xì)胞的IFN-λ調(diào)控

為檢測PEDV感染MARC-145細(xì)胞是否能引起Poly(I：C)激活的IFN-λ1和IFN-λ3啟動活性變化，在細(xì)胞生長至70%融合時(shí)轉(zhuǎn)染雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒12 h，而后感染PEDV 12 h，再轉(zhuǎn)染0.5 μg/mL Poly(I：C)處理細(xì)胞12 h，收取細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測。結(jié)果顯示IFN-λ1的熒光素酶活性由陽性對照的15倍下降至6倍，IFN-λ3由40倍下降至不到20倍，表明PEDV抑制Poly(I：C)誘導(dǎo)的IFN-λ1和IFN-λ3升高(圖7C、7D)。

2.5 篩選抑制IFN-λ1和IFN-λ3的PEDV蛋白

MARC-145細(xì)胞轉(zhuǎn)染pLV-mCherry載體的PEDV蛋白重組質(zhì)粒，在倒置熒光顯微鏡下觀察到Cherry熒光(圖8)，表明所有重組質(zhì)粒均正常表達(dá)。

A. NSP1；B. NSP2；C. NSP3；D. NSP4；E. NSP5；F. NSP6；G. NSP7；H. NSP8；I. NSP9；J. NSP10；K. NSP12；L. NSP13；M. NSP14；N. NSP15；O. E；P. M；Q. N；R. S；S. ORF3。圖8 PEDV重組蛋白表達(dá)(100×)

MARC-145細(xì)胞轉(zhuǎn)染PEDV重組表達(dá)質(zhì)粒后再轉(zhuǎn)染Poly(I：C)處理細(xì)胞，收取細(xì)胞樣品檢測轉(zhuǎn)錄本IFN-λ1和IFN-λ3的水平變化，結(jié)果顯示NSP1、NSP5、NSP9和ORF3顯著抑制IFN-λ1的表達(dá)(圖9A)，NSP1、NSP5、NSP8和ORF3顯著抑制IFN-λ3的表達(dá)(圖9C)。

A.病毒蛋白對Poly(I：C)處理后IFN-λ1 mRNA水平的影響；B. 病毒蛋白對Poly(I：C)處理后IFN-λ3 mRNA水平的影響；C. NSP5對Poly(I：C)處理后IFN-λ1啟動活性的影響；D. NSP5對Poly(I：C)處理后IFN-λ3啟動活性的影響。圖9 抑制IFN-λ1/3的PEDV蛋白篩選

為了進(jìn)一步驗(yàn)證NSP5對IFN-λ1和IFN-λ3啟動活性也具有抑制效果，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證NSP5對IFN-λ1和IFN-λ3啟動活性的作用。結(jié)果顯示IFN-λ1和IFN-λ3的熒光素酶活性與陽性對照相比均下降至50%以下(圖9B、9D)，表明NSP5顯著抑制了IFN-λ1和IFN-λ3的啟動活性。

3 討論

PEDV作為一種以糞口途徑傳播為主的病毒，其主要感染和增殖的部位是豬小腸上皮細(xì)胞[29]。因此，小腸黏膜是PEDV感染宿主所要突破的第一道防線。雖然Ⅰ型干擾素α和β已經(jīng)是公認(rèn)的重要抗病毒因子，但研究發(fā)現(xiàn)，其與Ⅲ型干擾素λ有明顯的表達(dá)差異性，Ⅰ型干擾素α/β主要在腸道淋巴結(jié)中發(fā)揮抗病毒作用，而在腸道黏膜的表達(dá)水平遠(yuǎn)不及IFN-λ[30]，且IFNL-λ已被證實(shí)具有良好的抵抗PEDV感染作用[21-22]。目前，Ⅰ型干擾素逃逸PEDV感染的機(jī)制已得到廣泛研究，但有關(guān)PEDV逃逸IFN-λ的研究鮮有報(bào)道?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，NSP1、NSP3、NSP5、NSP8、NSP14、NSP15、NSP16、ORF3、E、M和N均有可能參與了逃逸宿主IFN-λ1的過程，其中以NSP1、NSP14和ORF3抑制效果較為顯著，NSP1阻斷IRF1的核易位并減少過氧化物酶體的數(shù)量以抑制IRF1介導(dǎo)的Ⅲ型IFN[23]；N蛋白通過阻斷NF-κB的核易位干擾IFN-λ的產(chǎn)生[24]。但更多分子作用機(jī)制尚不明確，PEDV蛋白介導(dǎo)的IFN-λ免疫逃逸機(jī)制仍有巨大的探索空間。

試驗(yàn)中首先確定了PEDV感染MARC-145細(xì)胞未能引起IFN-λ1/3轉(zhuǎn)錄本水平的升高，啟動活性有3至5倍升高，又將感染PEDV的細(xì)胞使用Poly(I：C)處理，證實(shí)了PEDV在轉(zhuǎn)錄本水平和啟動活性水平都具有抑制IFN-λ1/3的能力，最后對不同PEDV蛋白進(jìn)行篩選和驗(yàn)證，NSP1、NSP5、NSP8、NSP9和ORF3均有對IFN-λ的抑制效果，其中NSP5對IFN-λ的下調(diào)作用最為顯著，且抑制IFN-λ3效果較抑制IFN-λ1更為明顯。整個(gè)試驗(yàn)運(yùn)用了熒光定量PCR和報(bào)告基因兩種方法，試驗(yàn)結(jié)果相互佐證，檢測IFN-λ轉(zhuǎn)錄本水平的變化，通過報(bào)告基因檢測則有更加靈敏、重復(fù)結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)勢。