■ 王加黛 王利軍 王 平 劉超齊 金三俊 黨曉偉 常 娟 尹清強*

（1.河南農業(yè)大學動物科技學院，河南鄭州 450046；2.河南德鄰生物制品有限公司，河南新鄉(xiāng) 453500）

玉米秸稈是我國常見的農副產品，具有纖維素含量高、適口性差、瘤胃降解率低等特點，導致其利用率低，僅為30%，直接限制了玉米秸稈資源在反芻動物粗飼料中的應用。玉米秸稈微貯主要以干秸稈為原料，通過調節(jié)水分、添加發(fā)酵菌劑密封儲存，利用微生物厭氧發(fā)酵，降低其pH，達到改善飼料品質、增加營養(yǎng)價值、提高家畜生產性能和經濟效益的目的，是一種秸稈資源化利用的有效途徑[1-3]。

乳酸菌是微貯飼料中最常見的添加劑種類，進行微貯時直接加入乳酸菌制劑，能夠增加發(fā)酵時的初始乳酸菌數目，加快乳酸菌發(fā)酵產酸，促使微貯pH 快速下降，從而抑制霉菌等有害微生物的生長繁殖，提高秸稈的營養(yǎng)價值，改善微貯發(fā)酵品質[4-5]。纖維素酶能夠降解玉米秸稈細胞壁中的纖維素，降低秸稈中的纖維含量[6]，同時將秸稈中富含的多糖物質水解為單糖，為微生物的生長繁殖提供資源，促進秸稈的發(fā)酵過程[7]。常見的微貯輔料（如玉米粉、豆粕等）的添加也能在一定程度上改善發(fā)酵品質。因此，本試驗通過添加發(fā)酵底物并聯合使用植物乳桿菌和纖維素酶進行玉米秸稈微貯，研究其對玉米秸稈微貯品質的影響，為玉米秸稈微貯工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米秸稈取自河南省新鄉(xiāng)市，挑選干凈的玉米秸稈去根，自然風干，室溫保存。植物乳桿菌來自河南農業(yè)大學飼料生物技術實驗室，纖維素濾紙酶活為221.74 FPU/g。玉米粉、棉粕由河南德鄰生物制品有限公司惠贈。

1.2 微貯玉米秸稈發(fā)酵底物的正交試驗設計

試驗采用三因素三水平正交設計，選取玉米粉（A）、棉粕（B）、水分含量（C）為考察因素，進行L9(33)正交試驗，共10 組（9 個試驗組+1 個對照組），試驗分組如表1 所示。9 個試驗組中玉米秸稈占風干物質的比例為94%～98%，使風干物質總量達到100%；發(fā)酵物中水分含量，根據設計要求調整至60%～70%。對照組不添加玉米粉、棉粕、氯化鈉和植物乳桿菌，僅含有玉米秸稈，并調整水分含量為65%。每組3 個重復，每個重復100 g。將試驗組發(fā)酵底物混合均勻后，添加0.9%氯化鈉及一定量的植物乳桿菌，使物料中植物乳桿菌的活菌數達到1×106CFU/g；混合均勻后裝入聚乙烯真空袋中，用真空包裝機封口。根據本實驗室以前的試驗結果，室溫下（16～28 ℃）微貯秸稈的發(fā)酵時間定為28 d。發(fā)酵結束后，取樣測定其pH，以pH 為主要指標確定最佳底物配比及水分含量。

表1 微貯玉米秸稈發(fā)酵底物的正交試驗設計(%)

1.3 菌和酶單獨及組合處理玉米秸稈的試驗設計

在獲得上述最佳發(fā)酵底物組成的基礎上，共設計四個組。分別為對照組：不添加菌和酶；單菌組：添加植物乳桿菌1×106CFU/g；單酶組：添加的纖維素酶濾紙酶活性為0.1 FPU/g 風干物質；菌酶組合組：植物乳桿菌1×106CFU/g、纖維素酶0.1 FPU/g 風干物質。每組3 個重復，每個重復100 g，將發(fā)酵底物混合均勻后放于聚乙烯真空袋中，用真空包裝機封口，室溫下發(fā)酵28 d，28 d 后取樣進行感官評定，并進行pH、乳酸菌活菌數、纖維素降解率的測定。

1.4 指標測定

1.4.1 感官評定

感官評定方法參考我國農業(yè)農村部下發(fā)的《青貯飼料質量評定標準》，如表2 所示，開封時對微貯玉米秸稈的水分含量、色澤、氣味和質地等感官指標評定，并測定pH，進行綜合評分。

表2 青貯飼料質量評定標準（分）

1.4.2 pH測定

將樣品混勻后稱取10 g 于250 mL 錐形瓶中，加入90 mL 純化水，于搖床上180 r/min 振蕩20 min，通過定性濾紙過濾，所制備的浸提液采用pHS-3C pH計進行測定。

1.4.3 乳酸菌活菌數測定

將樣品混勻后稱取2 g 于50 mL 離心管中，加入18 mL滅菌生理鹽水，振蕩均勻后稀釋至100萬倍，使用MRS固體培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。乳酸菌活菌數采用平板計數法進行測定，結果以每克微貯飼料所含的微生物菌落數（CFU/g）的自然對數值（lg）來表示。

1.4.4 纖維素含量的測定

將樣品置于65 ℃烘箱，干燥至恒重后，將干燥后的樣品用粉碎機進行粉碎并過40 目篩后用自封袋密封保存待測。利用濾袋法，參照Van Soest 等[8]的方法測定樣品中中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、纖維素和半纖維素的含量。

1.5 數據統(tǒng)計及分析

試驗數據采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，并用Duncan’s 法對組間進行多重比較，結果用“平均值±標準差”表示，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 最佳底物配比及水分含量的正交試驗結果

以pH 為參照指標進行正交試驗分析，由表3 可知，各因素對玉米秸稈微貯pH 影響的主次關系為：C（水分含量）＞A（玉米粉）＞B（棉粕），正交試驗得出的最佳組合為A2B2C1，與5 組一致，且5 組pH 顯著低于2、3、4 組和對照組（P＜0.05）。因而，玉米秸稈微貯中最佳風干物質的組成為96%玉米秸稈、2%玉米粉、2%棉粕；最佳水分含量為60%。以此為基礎，開展下面的試驗。

表3 不同比例玉米粉、棉粕、水分含量對微貯28 d玉米秸稈pH的影響

2.2 菌酶復合發(fā)酵對玉米秸稈微貯乳酸菌活菌數、pH及感官評定的影響

由表4 可知，與對照組相比，單菌組和菌酶復合組均能顯著提高玉米秸稈微貯中的乳酸菌活菌數（P＜0.05）。單菌組、單酶組和菌酶復合組與對照組相比，均能顯著降低玉米秸稈微貯的pH，其中菌酶復合組的pH 降至3.88，顯著低于其余各組（P＜0.05）。感官評定總評分從高到低依次為：菌酶復合組＞單菌組＞單酶組＞對照組。

表4 發(fā)酵28 d各組玉米秸稈微貯乳酸菌活菌數及感官評定

2.3 菌酶復合發(fā)酵對微貯玉米秸稈纖維素含量及纖維素降解率的影響

由表5 可知，與對照組和單菌組對比，單酶組和菌酶復合組均可顯著降低玉米秸稈的中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、纖維素和半纖維素含量（P＜0.05）。

表5 發(fā)酵28 d各組玉米秸稈中纖維素含量（%）

3 討論

3.1 發(fā)酵底物對微貯效果的影響

微貯原料中可溶性碳水化合物（WSC）的含量可影響微貯發(fā)酵的效果[9]，由于秸稈中的WSC 含量較低，所以在發(fā)酵底物中添加玉米粉可提高原料的初始WSC 含量，為乳酸菌生長提供優(yōu)質碳源，促進乳酸菌的生長增殖，從而達到降低微貯pH、改善玉米秸稈的微貯效果[10]。棉粕中粗蛋白含量高，可以為微生物的生長和繁殖提供氮源，有利于提高玉米秸稈的發(fā)酵品質。本試驗中，在玉米秸稈的發(fā)酵底物中添加適量的玉米粉和棉粕可顯著降低玉米秸稈微貯后的pH，其原因是玉米粉和棉粕提供了充足的能源和氮源，有利于乳酸菌的生長和繁殖。水分含量的高低可直接影響微貯的發(fā)酵效果，水分過高容易導致微貯過程中發(fā)生腐敗，水分過低則不利于微生物生長和秸稈發(fā)酵。本試驗結果顯示水分為60%時微貯效果最好，這與李苗苗等[11]的研究結果一致。

3.2 菌酶復合使用對微貯玉米秸稈中乳酸菌活菌數的影響

乳酸菌是微貯發(fā)酵過程中的關鍵微生物。研究發(fā)現，乳酸菌產生的乳酸對微貯玉米秸稈發(fā)酵品質具有改善作用，乳酸菌通過產生乳酸提高飼料發(fā)酵質量[12]，并且在生長過程中將秸稈中難以被消化吸收的大分子物質和抗營養(yǎng)因子分解轉化，形成便于家畜吸收和利用的小分子營養(yǎng)物質，提高秸稈的營養(yǎng)價值[13]。經過風干后的秸稈可利用的營養(yǎng)物質含量低于新鮮秸稈，且表面附著的乳酸菌數量減少，因此進行微貯時加入乳酸菌制劑能夠增加發(fā)酵初始乳酸菌數目，促進乳酸菌增殖產酸，迅速降低微貯秸稈的pH，抑制霉菌等有害微生物的生長，有效改善微貯發(fā)酵品質。纖維素酶能夠水解玉米秸稈細胞壁的多糖結構，使之分解為葡萄糖，為微生物的生長繁殖提供豐富碳源，進而增加微貯玉米秸稈中有益微生物菌群的數量[14]。本試驗中，單菌組和菌酶復合組發(fā)酵28 d 后，乳酸菌活菌數顯著高于對照組，且菌酶復合組的乳酸菌數目顯著高于單菌組。其原因是，纖維素酶分解秸稈產生的葡萄糖等低分子碳水化合物，為乳酸菌的生長和繁殖提供了充足的能源，提高了發(fā)酵秸稈中乳酸菌數量，并降低pH，說明菌酶復合有利于提高發(fā)酵秸稈的品質，與青綠飼料的發(fā)酵結果一致[15]。

3.3 菌酶復合使用對微貯玉米秸稈pH的影響

pH 是衡量玉米秸稈微貯發(fā)酵秸稈品質的一個重要指標，發(fā)酵過程中微貯的pH 因乳酸菌大量繁殖產生的乳酸而下降[16]。本試驗結果中單菌組、單酶組和菌酶聯合組處理的微貯pH 均顯著低于對照組，其中菌酶復合組的微貯玉米秸稈中pH 最低。乳酸菌是微貯發(fā)酵是否成功的關鍵，底物中添加的玉米粉，可被乳酸菌利用產生有機酸，使微貯的pH 顯著降低。纖維素酶的添加可以破壞細胞壁中纖維結構，并在進行微貯時將纖維素轉化為葡萄糖，可作為乳酸菌的發(fā)酵底物，促進乳酸的產生，降低發(fā)酵后的pH[16]。這也是為什么菌酶聯合組pH 顯著降低及發(fā)酵效果好和評分高的原因[17]。

3.4 菌酶復合使用對微貯玉米秸稈中纖維素含量的影響

本研究結果證明，添加纖維素酶的兩組均能顯著降低玉米秸稈的NDF、ADF和纖維素及半纖維素的含量。其主要原因是在微貯過程中添加纖維素酶所致，與前人研究結果一致[18]。因此，在未來的秸稈微貯中，為了提高微貯秸稈的品質，考慮纖維素酶及其與乳酸菌的共同添加。

4 結論

玉米秸稈微貯發(fā)酵風干底物的組成為玉米秸稈96%、玉米粉2%、棉粕2%，水分含量為60%時，微貯發(fā)酵效果最好；在此基礎上進行菌酶復合常溫微貯28 d 后，顯著提高了玉米秸稈的發(fā)酵品質，證明了纖維素酶與植物乳桿菌在微貯玉米秸稈中的疊加功能，有利于優(yōu)質微貯玉米秸稈的生產,但菌酶組合微貯玉米秸稈在反芻動物生產中的應用效果還有待進一步探究。