高章明，石景瑜，曾皓，張學(xué)軍

1.上饒市公安局物證鑒定中心，江西 上饒 334000；2.上饒市廣信區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，江西 上饒 334100；3.江西省公安廳毒品檢驗(yàn)鑒定中心，江西 南昌 330000

布桂嗪又名強(qiáng)痛定、AP-237，化學(xué)名稱為1-正丁?；?4-肉桂基哌嗪，英文名bucinnazine，屬于國家管制的麻醉藥品。1968 年，日本杏林制藥員工ITO 等首次報(bào)道了布桂嗪的合成[1]。布桂嗪是一種速效、強(qiáng)效的鎮(zhèn)痛藥，屬于阿片類鎮(zhèn)痛藥物，鎮(zhèn)痛作用是嗎啡的1/3、氨基比林的4～20 倍[2]，主要對(duì)皮膚、黏膜、運(yùn)動(dòng)器官（包括關(guān)節(jié)、肌肉、肌腱等）的疼痛有明顯的抑制作用，是目前我國治療癌癥以及相關(guān)慢性疼痛的首選鎮(zhèn)痛藥，在臨床上適用于偏頭痛、三叉神經(jīng)痛、癌性疼痛等。布桂嗪連續(xù)超劑量使用可致耐受和成癮，容易引起濫用，過量則可導(dǎo)致中毒死亡。目前，在歐美已出現(xiàn)布桂嗪作為新型毒品濫用的勢頭[3]，在國內(nèi)也有使用布桂嗪成癮的案例報(bào)道[4-6]，因此，建立高效、準(zhǔn)確的布桂嗪檢測方法對(duì)日常涉毒案件的偵破和臨床治療都具有十分重要的意義。

對(duì)血液中布桂嗪的檢驗(yàn)，常見的前處理方式主要有液液萃?。╨iquid-liquid extraction）、固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）、基質(zhì)固相分散（matrix solid phase dispersion，MSPD）萃取等[7-8]。其中，液液萃取方法需要手動(dòng)操作，過程繁瑣，耗時(shí)長，目標(biāo)物回收率偏低且需要消耗大量有機(jī)溶劑，容易對(duì)環(huán)境造成污染；SPE 和MSPD 萃取方法的檢驗(yàn)成本較高，方法開發(fā)較為復(fù)雜。布桂嗪常見的分析方法有GC、GC-MS和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）等[7-10]。GC 和HPLC 易受樣品中復(fù)雜基質(zhì)的干擾，導(dǎo)致定性不準(zhǔn)確。GC-MS方法靈敏度較低，容易漏檢。面對(duì)布桂嗪濫用案件的逐漸增加，亟須建立一種檢驗(yàn)效率高、成本低、專屬性強(qiáng)的方法。本研究擬通過優(yōu)化的沉淀蛋白法，并結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）特異性強(qiáng)、分析時(shí)間短、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，建立血液中布桂嗪的UPLC-MS/MS 快速測定方法，并應(yīng)用于實(shí)際案例，為司法案件提供準(zhǔn)確快速的鑒定意見。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

LCMS-8050 三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司），配電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；RG-165AT 高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；DHG-9075A 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

布桂嗪標(biāo)準(zhǔn)品（0.1 mg/mL，美國Cerilliant 公司），嗎啡-d3（純度≥98.0%，美國Sigma 公司），甲醇、乙腈（色譜純，美國Honeywell 公司），甲酸、乙酸銨（色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司），0.22 μm 混合纖維素酯濾膜［島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司］。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，用甲醇稀釋布桂嗪標(biāo)準(zhǔn)品溶液得到質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。嗎啡-d3用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)工作液。將上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液密封后置于冰箱中-20 ℃冷凍保存。

1.3 樣品前處理

本研究使用沉淀蛋白法對(duì)血液樣品進(jìn)行前處理，分別考察乙腈溶液和甲醇溶液的沉淀效果，乙腈溶液的比例為100%乙腈、80%乙腈水溶液、50%乙腈水溶液，甲醇溶液的比例為100%甲醇、80%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液。

取空白血液加入布桂嗪標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制質(zhì)量濃度為20、50、80 μg/L 的系列血液樣品，取100 μL 上述3 種質(zhì)量濃度的血液樣品分別置于2 mL 具塞離心管中，加入1 μg/mL 嗎啡-d3內(nèi)標(biāo)工作液5 μL，再加入900 μL 上述不同比例的甲醇和乙腈，渦旋混勻1 min后，14 800×g，高速離心5 min，取上清液，過0.22 μm混合纖維素酯濾膜，平行進(jìn)樣 3 次。

1.4 儀器條件

液相色譜條件：Shim-pack GIST C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2 μm；日本島津公司），柱溫40 ℃，流速0.4 mL/min。在流動(dòng)相的選擇方面，本研究考察0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈、5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）-乙腈、5mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）-甲醇4 種流動(dòng)相，使用梯度洗脫。洗脫程序：初始流動(dòng)相為10%B，0～3.0 min 10%B～28%B，3.0～5.0 min 28%B～100%B，5.0～7.0 min 100%B，7.0～7.01 min 100%B～10%B，7.01～8.0 min 10%B?？偛蓸訒r(shí)間為8.0 min，進(jìn)樣量為5 μL。

質(zhì)譜條件：在電噴霧正離子模式下進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測掃描；霧化器流速3 L/min，加熱器流速10 L/min；接口溫度300 ℃，加熱塊溫度400 ℃；干燥氣流速10 L/min。經(jīng)優(yōu)化后得到的布桂嗪質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 布桂嗪和內(nèi)標(biāo)嗎啡-d3的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Mass spectrum parameters of bucinnazine and morphine-d3

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1 選擇性

6 個(gè)不同來源的空白血液樣品按1.3 節(jié)方法處理后進(jìn)行UPLC-MS/MS 分析，觀察血液中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)布桂嗪和嗎啡-d3的檢測是否存在干擾。

1.5.2 線性關(guān)系、檢出限和定量限

取空白血液100 μL于2 mL具塞離心管中，加入布桂嗪標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg/L 的系列血液樣品，按1.3 節(jié)方法進(jìn)行前處理后，按1.4 節(jié)條件進(jìn)行分析，使用內(nèi)標(biāo)法定量，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以信噪比（S/N）≥3 時(shí)的樣品質(zhì)量濃度為檢出限，以信噪比（S/N）≥10 時(shí)的樣品質(zhì)量濃度為定量限。

1.5.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除目標(biāo)物以外的物質(zhì)對(duì)分析結(jié)果的影響和干擾，通常表現(xiàn)為使目標(biāo)物在儀器上的響應(yīng)發(fā)生增強(qiáng)或抑制。用甲醇配制質(zhì)量濃度為1、10和100 μg/L 的布桂嗪標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，記錄峰面積為S1。6 份不同來源的空白血液樣品基質(zhì)提取液添加相應(yīng)的布桂嗪標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行UPLC-MS/MS 分析，記錄峰面積為S2。以S2與S1的比值評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。

1.5.4 回收率

取空白血液100 μL 于2 mL 具塞離心管中，加入布桂嗪標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別配制質(zhì)量濃度為1、10 和100 μg/L 的布桂嗪血液樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度6 份樣品，按1.3 節(jié)方法進(jìn)行前處理后，按1.4 節(jié)條件進(jìn)行分析，記錄峰面積為S3。以S3與S2的比值計(jì)算回收率，回收率需滿足日常案件檢驗(yàn)需要[11]。

1.5.5 準(zhǔn)確度和精密度

依據(jù)《法醫(yī)毒物分析方法驗(yàn)證通則》（SF/T 0063—2020）[12]計(jì)算準(zhǔn)確度、日內(nèi)精密度和日間精密度，準(zhǔn)確度用偏倚（%）表示，日內(nèi)和日間精密度均用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示。

取空白血液100 μL于2 mL具塞離心管中，加入布桂嗪標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別配制低（1 μg/L）、中（10 μg/L）、高（100 μg/L）3 個(gè)質(zhì)量濃度的血液樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度6 份樣品，按1.3 節(jié)方法進(jìn)行前處理后，按1.4 節(jié)條件進(jìn)行分析，連續(xù)測定3 d，計(jì)算測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。將上述3 種質(zhì)量濃度的血液樣品于1 d 內(nèi)分析6 次，得日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，得日間精密度。所得結(jié)果需滿足體內(nèi)樣品分析要求[13]。

1.5.6 穩(wěn)定性

針對(duì)血液樣品在不同溫度下的保存情況，設(shè)計(jì)血液中布桂嗪的長期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。取空白血液100 μL于2 mL 具塞離心管中，加入布桂嗪標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別配制低（1 μg/L）、高（100 μg/L）兩個(gè)質(zhì)量濃度的血液樣品各24 份，分為4 組，每組包含低、高質(zhì)量濃度血液樣品各6 份，分別置于-25、0、25、50 ℃下保存10 d，于第5 天、第10 天各取樣3 份，與新配制的低、高質(zhì)量濃度血液樣品同時(shí)按1.3 節(jié)方法處理后進(jìn)行測定，所得準(zhǔn)確度用偏倚（%）表示，偏倚在±15%以內(nèi)，表明目標(biāo)物在一定時(shí)間內(nèi)可以穩(wěn)定保存[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的選擇

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相同比例下，乙腈溶液提取的回收率比甲醇溶液高，在考察的3 種比例乙腈溶液中，80%乙腈水溶液回收率最高，提取效果最好。而使用100%乙腈提取時(shí)，渦旋混合后血液不能完全散開，容易凝成小球，影響回收率。最終選擇80%乙腈水溶液作為提取溶劑。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

對(duì)4 種流動(dòng)相進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：選擇乙腈為有機(jī)相時(shí)，布桂嗪的峰形和分離效果比甲醇好。在水相中加入少量乙酸銨，增強(qiáng)流動(dòng)相極性，緩沖流動(dòng)相pH 值，可進(jìn)一步提高目標(biāo)物的離子化效率。最終選擇5 mmol/L 乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）-乙腈為流動(dòng)相用于布桂嗪的分析，分析結(jié)果顯示：布桂嗪峰形穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)拖尾峰或前沿峰。布桂嗪和內(nèi)標(biāo)嗎啡-d3的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 布桂嗪和嗎啡-d3的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of bucinnazine and morphine-d3

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 選擇性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6 個(gè)不同來源血液樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)布桂嗪和嗎啡-d3無干擾，該方法選擇性良好。

2.3.2 線性關(guān)系、檢出限和定量限

布桂嗪在0.5～200 μg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。血液樣品加標(biāo)后所得線性方程為y=0.023x+0.025，相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 7，檢出限為0.1 μg/L，定量限為0.5 μg/L。

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)

布桂嗪在血液中的基質(zhì)效應(yīng)為69.4%～73.8%（表2），血液中的基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物有抑制作用，基質(zhì)效應(yīng)較為明顯，所以本方法選擇使用內(nèi)標(biāo)嗎啡-d3來減少基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響。

表2 布桂嗪在血液中的基質(zhì)效應(yīng)、回收率、準(zhǔn)確度和精密度Tab.2 Matrix effect，recovery，accuracy and precision of bucinnazine in blood （%）

2.3.4 回收率

血液中布桂嗪在3 個(gè)添加質(zhì)量濃度（1、10、100 μg/L）的回收率見表2，回收率在78.3%～83.8%。

2.3.5 準(zhǔn)確度和精密度

研究結(jié)果（表2）表明，本方法的準(zhǔn)確度在3.1%～3.5%，日內(nèi)精密度在1.9%～2.8%，日間精密度在2.8%～3.2%，日內(nèi)和日間精密度均小于5%。

2.3.6 穩(wěn)定性

研究結(jié)果（表3）表明，低質(zhì)量濃度血液樣品的穩(wěn)定性低于高質(zhì)量濃度血液樣品。血液中布桂嗪在-25 ℃下保存時(shí)，低質(zhì)量濃度血液樣品的準(zhǔn)確度（偏倚）在±4.5%范圍內(nèi)，高質(zhì)量濃度血液樣品的準(zhǔn)確度（偏倚）在±3.0%范圍內(nèi)，穩(wěn)定性均較好。在0 ℃下保存時(shí)，血液樣品的準(zhǔn)確度（偏倚）均在±8.6%范圍內(nèi)，較為穩(wěn)定。在25 ℃和50 ℃下保存10 d 后，高質(zhì)量濃度血液樣品的準(zhǔn)確度（偏倚）分別為±24.7%和±49.9%，均大于±15%。由此可見，在常溫和高溫下目標(biāo)物不能長時(shí)間穩(wěn)定保存，存儲(chǔ)溫度的升高會(huì)加速血液中布桂嗪的分解，所以對(duì)于血液樣品的保存，建議短期冷藏、長期冷凍。

表3 布桂嗪在血液中的準(zhǔn)確度（偏倚）Tab.3 Accuracy（bias）of bucinnazine in blood（n=3，%）

2.4 案例應(yīng)用

某年12 月，一男子被發(fā)現(xiàn)死于家中，現(xiàn)場提取了死者的血液送檢，由于受到設(shè)備的限制，僅在死者血液中檢出芬太尼和利多卡因成分。4 年后，實(shí)驗(yàn)室將當(dāng)年的血液再次解凍，使用本研究方法在血液中檢出了芬太尼、利多卡因和布桂嗪成分（圖2），其中布桂嗪質(zhì)量濃度為22.8 μg/L、芬太尼質(zhì)量濃度為40.2 μg/L、利多卡因質(zhì)量濃度為88.9 μg/L。

圖2 實(shí)際樣品的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.2 Multiple reaction monitoring chromatogram of practical sample

布桂嗪成人的用量為1次30～60 mg口服（每日3次）或者1 次50 mg 皮下或肌內(nèi)注射（每日1～2 次），對(duì)于慢性中重度癌性疼痛患者，劑量可逐漸增加且第一次及總量可以不受常規(guī)劑量的限制[14]，所以會(huì)造成布桂嗪在血液中的治療濃度范圍較大。YU 等[15]的研究結(jié)果顯示，大鼠布桂嗪的亞致死量為1.0 g/kg；FOGARTY等[16]報(bào)道的4 例患者死后血液中布桂嗪的質(zhì)量濃度范圍為820～5 800 μg/L。本例死者血液中布桂嗪含量遠(yuǎn)未達(dá)到文獻(xiàn)所報(bào)道的質(zhì)量濃度，分析有以下兩個(gè)原因：（1）死者生前存在多種藥物濫用，有可能是多種藥物間的協(xié)同作用導(dǎo)致死亡；（2）從藥物穩(wěn)定性方面分析，雖然檢材長期在-25 ℃下保存，但存儲(chǔ)時(shí)間過長，布桂嗪在血液中緩慢分解，導(dǎo)致測定的含量偏低。

3 結(jié)論

本研究通過優(yōu)化前處理中的乙腈沉淀蛋白法與UPLC-MS/MS 條件，針對(duì)血液中的布桂嗪進(jìn)行快速定性定量分析，具有取樣量小、前處理過程簡單高效、重現(xiàn)性好、儀器分析靈敏度高等優(yōu)勢，該方法的定量限可達(dá)0.5 μg/L，且檢材在-25 ℃下冷凍保存可保證布桂嗪在血液中的穩(wěn)定性。本方法在司法鑒定領(lǐng)域針對(duì)布桂嗪濫用的快速定性定量以及臨床藥物濃度監(jiān)測方面有較高的應(yīng)用價(jià)值。