代地林 吳 園 包明威

肥胖是影響心肌肥大和心力衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,減重可以逆轉(zhuǎn)部分心臟重構(gòu)。2016年WHO報(bào)道,全球有超過(guò)19億成年人(≥18歲)超重,超過(guò)6.5億人肥胖[1]。預(yù)計(jì)到2030年,將有21.6億人超重,11.2億人肥胖[2]。研究顯示,交感神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度激活是肥胖的早期改變,表現(xiàn)為全身去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)溢出增加以及心率變異性降低[3]。除了交感神經(jīng)系統(tǒng)的表現(xiàn)外,肥胖還表現(xiàn)為血脂異常、胰島素抵抗、脂肪積累等病理生理改變,這些改變是促進(jìn)心血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)因素[4]。

單胺氧化酶A(monoamine oxidase A,MAO-A)是一種定位于線粒體外膜的酶,它通過(guò)分解代謝NE等神經(jīng)胺產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)[5]。大量的ROS生成和隨后的氧化應(yīng)激可能通過(guò)靶向線粒體功能來(lái)影響心肌細(xì)胞的存活和功能,從而促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展[6, 7]。雖然MAO-A發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不清楚,但在幾種模型的心臟中,已發(fā)現(xiàn)MAO-A水平增加對(duì)心臟功能有損害作用[7, 8]?；贛AO-A對(duì)神經(jīng)胺的降解作用,MAO-A抑制劑在臨床上已用于抑郁癥患者的治療以及作為治療壓力負(fù)荷性心力衰竭等心臟病的工具藥而被廣泛研究[9～11]。本研究旨在探討MAO-A對(duì)高脂環(huán)境培養(yǎng)的心肌細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響及其機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)儀器與試劑:微量分光光度計(jì)(中國(guó)杭州奧盛儀器有限公司)、DG-3022A酶標(biāo)儀(美國(guó)ThermoFisher公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)、光學(xué)正置顯微鏡(日本Olympus公司)。3T3-L1前脂肪細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)拜意爾生物技術(shù)有限公司,Ⅱ型膠原酶購(gòu)自德國(guó)Biofroxx公司,胰酶、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司,100U/ml青霉素-鏈霉素(PS)購(gòu)自美國(guó)Genom公司,溴脫氧尿苷(Brdu)、過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)、油紅O染液、Mayer蘇木精、胰島素(10μg/ml)、地塞米松(0.25μmol/L)和3-異丁基-1-的誘導(dǎo)劑Ⅰ甲基黃嘌呤 (IBMX, 0.5mmol/L)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,Transwell 小室(孔徑為 0.4μm)購(gòu)自美國(guó)Corning公司,DAPI購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,Fluoromount-G?封片液購(gòu)自美國(guó)southernbiotech公司,棕櫚酸(palmitic acid,PA)購(gòu)自西安鯤創(chuàng)科技有限公司,NE、氯吉蘭(clogyline,CLG)購(gòu)自美國(guó)MCE公司,Trizol試劑購(gòu)自英國(guó)Ambion公司,甲醛、60%異丙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-sarcomeric actin,α-SCA)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,JNK購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,p-JNK購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

2.心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng):40只出生1～3天的SD大鼠由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。將整個(gè)心臟無(wú)菌取出后,用預(yù)冷的PBS洗滌液清洗數(shù)次,除去殘留的血液和多余的組織。將心臟組織剪成約1cm3的組織碎塊并轉(zhuǎn)移至含有Ⅱ型膠原酶和0.25%胰酶的消化液中,在37℃的水浴鍋中消化5min,收取上清于裝有等體積含有10%胎牛血清的終止液中終止消化。反復(fù)重復(fù)以上消化步驟,直至心臟組織消化完全。收取的上清11000×g離心10min,棄上清,加入等體積含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液,吹打混勻,用0.22μm的細(xì)胞濾器過(guò)濾后均勻地種在培養(yǎng)皿中,放于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中差速貼壁1.5h。吸取上清于離心管中,11000×g離心5min,棄上清。用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞、計(jì)數(shù)、均勻地種在6孔板和裝有爬片的12孔板中。避光環(huán)境下加入Brdu溶液(終濃度為0.1mmol/L)抑制非肌細(xì)胞的生長(zhǎng)。將孔板置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況定期更換培養(yǎng)液。所有實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號(hào):WDRM 20210814)。

3.心肌細(xì)胞鑒定及細(xì)胞面積測(cè)定:細(xì)胞爬片經(jīng)4%甲醛固定、0.5% Triton X-100室溫通透、山羊血清封閉后,加入α-SCA(1∶100)一抗稀釋液并放入濕盒,4℃孵育過(guò)夜。棄去一抗稀釋液,加入Cy3標(biāo)記的羊抗兔二抗稀釋液,39℃孵育1h。滴加DAPI避光孵育5min,對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核,PBS清洗多余的DAPI,用吸水紙吸干爬片上的液體,用Fluoromount-G?封片液封片,鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)并采集圖像。自加入二抗開(kāi)始,所有操作于暗室進(jìn)行。使用Image-Pro Plus軟件分析平均心肌細(xì)胞面積。

4.NRCM/3T3-L1共培養(yǎng)體系的建立、細(xì)胞處理與分組:將3T3-L1前脂肪細(xì)胞種植在Transwell小室中誘導(dǎo)成熟,誘導(dǎo)方法如文獻(xiàn)[12]所述。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō),將 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞接種在Transwell小室的上室,密度為5×105個(gè)細(xì)胞/平方厘米,并在含有添加10% FBS 和1% PS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。48h后,將基礎(chǔ)培養(yǎng)基更換為含有DMEM、10% FBS、1% PS、胰島素(10μg/ml)、地塞米松(0.25μmol/L)和IBMX(0.5mmol/L)的誘導(dǎo)劑Ⅰ。48h后,將誘導(dǎo)劑Ⅰ更換為含有DMEM、10% FBS、1% PS和胰島素(10μg/ml)的誘導(dǎo)劑Ⅱ。48h后,再次將誘導(dǎo)劑Ⅱ換成基礎(chǔ)培養(yǎng)基,每2天更換1次基礎(chǔ)培養(yǎng)基。3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)成熟(3T3-L1脂肪細(xì)胞)后,將Transwell小室移至種有心肌細(xì)胞的孔板上,并加入含有PA(400μmol/L)的培養(yǎng)液孵育18h構(gòu)建NRCM/3T3-L1共培養(yǎng)體系。接下來(lái),在共培養(yǎng)體系中分別加入含有NE(1μmol/L)、H2O2(200μmol/L)和CLG(MAO-A特異性抑制劑,1μmol/L)的培養(yǎng)液孵育,將細(xì)胞分為對(duì)照組(心肌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng))、PA組(心肌細(xì)胞與3T3-L1脂肪細(xì)胞共培養(yǎng),并加入PA)、NE組(心肌細(xì)胞與3T3-L1脂肪細(xì)胞共培養(yǎng),并加入PA、NE)、H2O2組(心肌細(xì)胞與3T3-L1脂肪細(xì)胞共培養(yǎng),并加入PA、H2O2)、NE+CLG組(心肌細(xì)胞與3T3-L1脂肪細(xì)胞共培養(yǎng),并加入PA、NE、CLG)、CLG組(心肌細(xì)胞與3T3-L1脂肪細(xì)胞共培養(yǎng),并加入PA、CLG),48h后收取心肌細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)。藥物作用濃度和時(shí)間的選擇基于既往研究[13～16]。

5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR):取心肌細(xì)胞,加入Trizol試劑提取RNA。用微量分光光度計(jì)測(cè)定A260、A280以及A260/A280,計(jì)算RNA的純度和濃度。根據(jù)測(cè)得的濃度取適量RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。將cDNA于50℃ 2min,95℃ 10min;95℃ 30s,60℃ 30s,40個(gè)循環(huán)的反應(yīng)參數(shù)下進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-qPCR檢測(cè)。繪制溶解曲線,獲得的測(cè)定數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析。使用GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻谋磉_(dá)量進(jìn)行校正。心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide,ANP)上游引物: 5′-GCCGGTAGAAGATGAGGTCA-3′, 下游引物: 5′-GCAGATCTATCGGAGGGGTC-3′。

6.心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平測(cè)定:細(xì)胞爬片經(jīng)DHE染料染色、4%甲醛固定后,在細(xì)胞爬片上滴加hoechst33342染液,室溫孵育5min。吸水紙吸去爬片上多余的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片后,鏡下觀察心肌細(xì)胞熒光染色情況并采集圖像。以上操作均在暗室中進(jìn)行。使用Image-Pro Plus軟件分析心肌細(xì)胞DHE染色的熒光強(qiáng)度。

7.油紅O染色:細(xì)胞爬片經(jīng)4%甲醛固定、60%異丙醇浸洗后,用油紅O染液染色10min。再用60%異丙醇分色至背景無(wú)色后,使用Mayer蘇木精復(fù)染、PBS浸洗藍(lán)化、蒸餾水洗后,使用Fluoromount-G?封片液封片。鏡下觀察心肌細(xì)胞脂滴染色情況并采集圖像。使用Image-Pro Plus軟件分析心肌細(xì)胞內(nèi)脂滴含量。

8.Western blot法檢測(cè):取心肌細(xì)胞,經(jīng)漂洗、裂解、離心后,收集細(xì)胞蛋白。取適量蛋白上清稀釋,使用DG-3022A酶標(biāo)儀測(cè)定A568,計(jì)算樣品蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠,制備好的蛋白樣品經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,加入一抗稀釋液,4℃孵育過(guò)夜。洗去多余的一抗,用二抗稀釋液室溫孵育2h。洗去多余的二抗,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯影。條帶灰度值用Image-Pro Plus軟件測(cè)量。將目的條帶與內(nèi)參GAPDH的比值作為半定量指標(biāo)。

結(jié) 果

1.原代心肌細(xì)胞的鑒定:免疫熒光染色顯示,大于95%的細(xì)胞為心肌細(xì)胞(圖1)。

圖1 原代心肌細(xì)胞鑒定(免疫熒光染色)A.α-SCA;B.DAPI;C.Merge。紅色代表原代心肌細(xì)胞胞質(zhì),藍(lán)色代表細(xì)胞核

2.3T3-L1共培養(yǎng)體系加PA刺激能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大表型:與對(duì)照組比較,PA組中的心肌細(xì)胞面積(14.681±0.481μm2vs 19.932±0.220μm2,P<0.01)明顯增大,且心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物ANP的相對(duì)mRNA水平(1.006±0.017 vs 1.914±0.152,P<0.01)也明顯增加,說(shuō)明3T3-L1共培養(yǎng)體系加PA能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大表型(圖2)。

圖2 3T3-L1共培養(yǎng)體系加PA能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大表型A.-SCA染色的熒光顯微照片。紅色代表α-SCA染色的原代心肌細(xì)胞胞質(zhì),藍(lán)色代表細(xì)胞核;B.α-SCA染色觀察心肌細(xì)胞面積變化的半定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果;C.心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物ANP的相對(duì)mRNA水平

3.氯吉蘭抑制心肌細(xì)胞內(nèi)單胺氧化酶A的蛋白水平:與對(duì)照組比較,PA組心肌細(xì)胞內(nèi)MAO-A相對(duì)蛋白水平(0.117±0.022 vs 0.430±0.092,P<0.01)增加;與PA組比較,NE明顯增加心肌細(xì)胞中MAO-A的相對(duì)蛋白水平(0.430±0.092 vs 1.114±0.091,P<0.01),CLG降低心肌細(xì)胞中MAO-A相對(duì)蛋白水平(0.430±0.092 vs 0.251±0.054,P<0.05);與NE組比較,NE+CLG組的MAO-A相對(duì)蛋白水平明顯降低(1.114±0.091 vs 0.599±0.062,P<0.01,圖3)。

圖3 氯吉蘭抑制單胺氧化酶A的蛋白水平A.MAO-A的Western blot法條帶圖;B.MAO-A相對(duì)蛋白水平的定量分析。*P<0.05,**P<0.01

4.抑制MAO-A降低心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平:與對(duì)照組比較,PA組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平(0.001±0.001 vs 0.004±0.002,P<0.01)增加;與PA組比較,NE明顯增加心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平(0.004±0.002 vs 0.013±0.001,P<0.01);與NE組比較,NE+CLG組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平(0.013±0.001 vs 0.006±0.001,P<0.01)明顯降低,說(shuō)明抑制MAO-A的相對(duì)蛋白水平可減少心肌細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激(圖4)。

圖4 抑制MAO-A對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的影響A.原代心肌細(xì)胞DHE免疫熒光染色代表圖。紅色代表DHE熒光;B.DHE免疫熒光染色觀察心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的半定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果

5.抑制MAO-A改善心肌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積:與對(duì)照組比較,PA組心肌細(xì)胞的脂滴面積比(0.001±0.001 vs 0.054±0.002,P<0.01)增加;與PA組比較,NE和H2O2均明顯增加心肌細(xì)胞的脂滴面積比(0.054±0.002 vs 0.106±0.005,P<0.05;0.054±0.002 vs 0.092±0.002,P<0.01);與NE組比較,NE+CLG組心肌細(xì)胞的脂滴面積比(0.106±0.005 vs 0.072±0.001,P<0.01)明顯減少,說(shuō)明抑制MAO-A的相對(duì)蛋白水平可部分減少心肌細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積(圖5)。

圖5 抑制MAO-A對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)脂滴含量的影響A.原代心肌細(xì)胞油紅O染色代表圖。紅色代表脂滴,紫色代表細(xì)胞核;B.油紅O染色觀察心肌細(xì)胞內(nèi)脂滴含量的半定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果。*P<0.05,**P<0.01

6.抑制MAO-A降低心肌細(xì)胞內(nèi)JNK信號(hào)通路蛋白的磷酸化水平:Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,各組心肌細(xì)胞內(nèi)JNK總蛋白水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與對(duì)照組比較,PA組心肌細(xì)胞內(nèi)p-JNK的相對(duì)蛋白水平(0.032±0.007 vs 0.263±0.119,P<0.05)增加;與PA組比較,NE和H2O2明顯增加心肌細(xì)胞內(nèi)p-JNK的相對(duì)蛋白水平(0.263±0.119 vs 0.969±0.082,P<0.05; 0.263±0.119 vs 0.640±0.101,P<0.05),CLG可明顯降低NE引起的異常改變,說(shuō)明抑制MAO-A可以下調(diào)JNK信號(hào)通路(圖6)。

圖6 抑制MAO-A對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)JNK信號(hào)通路的影響A.JNK、p-JNK的Western blot法條帶圖;B.JNK、p-JNK相對(duì)蛋白水平的定量分析。*P<0.05,**P<0.01

討 論

肥胖導(dǎo)致全身交感神經(jīng)過(guò)度激活和許多代謝性病理變化,如血脂異常、胰島素抵抗、脂肪細(xì)胞的增殖和肥大等[3,4,17]。本研究使用3T3-L1脂肪細(xì)胞與原代心肌細(xì)胞在含有PA的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)來(lái)模擬肥胖大鼠心肌細(xì)胞脂肪浸潤(rùn)的內(nèi)環(huán)境。通過(guò)在共培養(yǎng)體系中加入NE和H2O2來(lái)探索MAO-A對(duì)高脂培養(yǎng)的心肌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的影響及機(jī)制。NE和H2O2分別用于模擬肥胖大鼠交感過(guò)度激活及氧化應(yīng)激的狀態(tài)。眾所周知,MAO-A可通過(guò)降解底物去甲腎上腺素、血清素等神經(jīng)胺產(chǎn)生ROS[6,7]。MAO-A驅(qū)動(dòng)的H2O2產(chǎn)生已被證實(shí)會(huì)引起不同類型的細(xì)胞反應(yīng),如肥大和死亡等[7,18]。近年來(lái),MAO-A介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在心血管疾病中的作用逐漸成為研究熱點(diǎn)[19,20]。

本研究評(píng)估了MAO-A是否可以被外源性MAO-A底物NE激活及其對(duì)心肌細(xì)胞的影響。在共培養(yǎng)體系中,筆者使用NE和CLG處理細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)NE處理細(xì)胞不僅增加了心肌細(xì)胞內(nèi)MAO-A的相對(duì)蛋白水平,還增加了心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平和脂滴含量,這些變化可被CLG抑制。另外,筆者發(fā)現(xiàn),CLG組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平與PA組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明MAO-A以依賴NE的方式引起心肌細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激。這與Manzella等[20]的研究一致,即用NE處理H9c2細(xì)胞會(huì)增加MAO-A介導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平。

為了評(píng)估MAO-A誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是否增加JNK信號(hào)通路蛋白的磷酸化以及脂質(zhì)沉積,筆者在NRCM/3T3-L1共培養(yǎng)體系中用H2O2孵育來(lái)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。結(jié)果顯示,與PA組比較,H2O2組的心肌細(xì)胞中JNK的磷酸化水平和脂質(zhì)沉積明顯增加。Imam等[18]研究也顯示,使用H2O2處理的心肌細(xì)胞表現(xiàn)出JNK磷酸化增加,這與本研究結(jié)果一致。以上結(jié)果說(shuō)明,MAO-A引起的氧化應(yīng)激是引起心肌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的一個(gè)重要原因。JNK是一種應(yīng)激活化蛋白激酶,屬于有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)超家族,可由肥胖和過(guò)量飲食糖激活,從而介導(dǎo)炎癥、異常脂質(zhì)沉積和胰島素抵抗[21,22]。本研究中雖然沒(méi)有評(píng)估JNK信號(hào)通路在脂質(zhì)沉積中的作用,但前期有大量研究表明,使用JNK抑制劑或siRNA介導(dǎo)的JNK敲低均可明顯改善心肌細(xì)胞中脂質(zhì)沉積[23,24]。

綜上所述,MAO-A相對(duì)蛋白水平增加是導(dǎo)致高脂培養(yǎng)的心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平、以及JNK磷酸化水平和脂質(zhì)沉積增加的重要原因,其機(jī)制可能與ROS/JNK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活有關(guān)。本研究為肥胖相關(guān)心臟損害的體內(nèi)研究和臨床研究提供了新的干預(yù)靶點(diǎn)。