秦 晗 蔡 軍

牙齒萌出是在多種細胞、組織和細胞因子的參與下,牙齒器官和其周圍牙槽骨組織相互作用、協(xié)同調節(jié)的復雜級聯(lián)過程。在這個精密調節(jié)的過程中,無論是牙胚或是牙槽骨的任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生改變都可導致牙齒的萌出異常[1]。關于牙齒萌出機制的研究至今未有定論[2]。

一、骨改建的動態(tài)平衡是牙齒萌出的關鍵

牙齒萌出時,隨著牙胚的生長發(fā)育,在牙囊、牙槽骨和牙齦組織間產(chǎn)生一定的壓力,促進局部組織破骨細胞分化,引起牙槽骨的吸收、萌出通道的形成[3]。同時牙槽窩底部骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞,形成新生骨質作為推動牙齒萌出的動力以及彌補牙冠方移動時其根方的骨質缺損[4]。因此骨改建的動態(tài)平衡是保證牙齒正常萌出的關鍵。

1.動物體內研究牙齒萌出骨改建過程:大量的動物學實驗論述了牙槽骨吸收在牙齒萌出中的重要作用。有研究者對出生1.5～14.5天的小鼠下頜第一磨牙冠方牙槽骨中的破骨細胞進行研究,發(fā)現(xiàn)細胞的數(shù)量隨著時間逐漸減少,第9.5天時,局部牙冠突破牙槽骨,此時破骨細胞作用明顯減弱,第14.5天時無破骨作用,僅近遠中牙槽骨處見少許破骨細胞,而后牙槽骨進一步被吸收,萌出通道形成[5]。Cahill對狗萌出中的前磨牙進行金屬線阻擋實驗,發(fā)現(xiàn)當金屬線隔離牙胚冠方通道時,牙齒不能正常萌出,去除金屬線后牙齒可繼續(xù)萌出,這個經(jīng)典的實驗充分說明了萌出通道對牙齒的正常萌出至關重要。另有研究發(fā)現(xiàn),給予小鼠抗破骨細胞分化因子的單抗或破骨細胞抑制劑——二磷酸鹽后,小鼠牙槽骨內破骨細胞功能受限,萌出通道不能正常形成,導致牙齒不萌出或萌出滯后[6]。對構建成骨細胞特異性轉錄因子(runt-related transcription factor 2,Runx2)雜合突變小鼠模型研究發(fā)現(xiàn),由于不能形成足夠量的破骨細胞,導致頜骨吸收障礙及牙齒萌出延遲[7]。

2.臨床研究牙齒萌出骨改建過程:臨床研究同樣證實了牙槽骨改建動態(tài)平衡在牙齒萌出中的重要作用。顱骨鎖骨發(fā)育不良(cleidocranial dysplasia,CCD)是一種典型牙齒萌出障礙性疾病,多項研究表明,Runx2的雜合突變及基因插入、缺失等是造成CCD的重要原因。Runx2是一個具有編碼Runt-DNA結構域家族中的核蛋白,對成骨細胞的分化成熟起到?jīng)Q定性的作用。在骨改建過程中,Runx2不但可以直接促進間充質干細胞分化為成骨細胞,而且還可以通過上調相關基因蛋白的表達進一步促進前成骨細胞分化成熟。當Runx2基因突變時易出現(xiàn)骨改建的異常,牙齒萌出障礙[8]。原發(fā)性萌出障礙(primary failure of eruption, PEE)發(fā)病機制尚未有全面認識,近年來從分子生物學基因角度研究發(fā)現(xiàn),PEE的致病基因可能是編碼甲狀旁腺激素受體1(parathyroid hormone receptor 1,PTH1R)基因發(fā)生突變,打破成骨和破骨之間的動態(tài)平衡,臨床表現(xiàn)為患者乳牙或恒牙不能正常萌出,局部牙槽骨塑形功能缺失[9,10]。

3.細胞學實驗分析牙齒萌出骨改建過程:對體外培養(yǎng)的破骨細胞內加入巨噬細胞集落刺激因子和核因子κB受體活化因子配體誘導細胞的分化已作為一種成熟的培養(yǎng)方式,可以促進破骨細胞體積增生、核數(shù)量增多以及活性增強。這提示應用細胞因子進行骨改建動態(tài)平衡的調節(jié)或許是一種簡便有效的方法。另有研究利用CCD患者的牙周膜細胞與破骨細胞的前體細胞共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn),破骨細胞分化減少,功能下降。說明CCD患者牙齒萌出障礙的一個主要原因便是破骨細胞形成和活化不足。另有研究對CCD患者的牙囊細胞體外培養(yǎng)并進行成骨誘導,發(fā)現(xiàn)Runx2基因突變嚴重干擾了牙囊細胞的成骨能力以及成骨細胞相關基因的表達,但是利用慢病毒過表達野生型Runx2可以逆轉細胞的成骨分化異常[11,12]。這一研究提示,牙囊的成骨能力參與牙槽骨的重塑過程,在牙齒萌出骨動態(tài)平衡中發(fā)揮關鍵性作用,為CCD患者恒牙延遲出牙的機制提供有價值的解釋和啟示。

骨改建的動態(tài)平衡是牙齒萌出通道正常形成的重要基礎,大量的信號通路參與了骨改建的動態(tài)平衡,與牙齒萌出密切相關的骨改建信號通路分述如下。

二、調節(jié)牙齒萌出通道形成的主要骨代謝通路

1.RANK/RANKL/OPG 系統(tǒng)與牙齒萌出:目前認為,RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)是調節(jié)成骨、破骨細胞分化,參與牙齒萌出骨改建過程中最重要的信號通路[13]。破骨細胞核因子κB受體活化因子配體(receptoractivator of nuclear factor kappa-Bligand,RANKL)主要由骨髓間充質細胞、成骨細胞及一些腫瘤細胞表達,可以被許多因素激活。破骨細胞核因子κB受體活化因子(receptoractivator of nuclear factor kappa-B,RANK)位于破骨前體細胞膜表面,是RANKL刺激破骨細胞活化的直接靶受體。二者結合后促進破骨前體細胞活化,通過骨架重構使細胞形態(tài)發(fā)生改變,易于移動并黏附到骨吸收部位。骨保護素(osteoprotegerin,OPG)是RANKL的直接抑制劑,主要通過競爭性與成骨細胞/基質細胞的RANKL結合,阻斷RANKL-RANK的結合,抑制破骨前體細胞的分化與成熟。

RANKL的陽性信號在與牙齒發(fā)育萌出相關的各部分組織中廣泛表達,但是在不同時期其表達的部位和強度均不一致。動物實驗研究表明,在小鼠牙齒萌出中期RANKL表達明顯增強,OPG表達減弱,但是在萌出初期和后期牙槽骨內破骨細胞相對較少, RANKL表達強度較萌出中期減弱,與骨吸收的活躍程度保持一致[14]。通過對臨床正常萌出和萌出障礙的牙齒進行研究,結果顯示,牙槽骨組織中RANK和OC表達水平在二者間沒有顯著異常,但是局部的比值存在明顯差異。RANK/RANKL比值主要作為骨吸收的指標,RANKL/OPG的比值主要作為骨改建平衡的指標。上述研究結果顯示,在牙齒萌出障礙組RANK/RANKL下降的同時RANKL/OPG比值增加,提示此類患者的牙齒萌出障礙可能是因為骨骼重塑過程中牙槽骨吸收和形成的平衡失調進而影響出牙[15]。

2.Wnt信號通路與牙齒萌出:Wnt信號通路是調控機體內多種細胞形成、分化、遷徙和凋亡的主要通路,根據(jù)是否依賴β-catenin的轉錄活化,可分為典型(依賴性途徑)和非典型(非依賴性途徑)兩類。成骨細胞系中典型Wnt信號的激活可增強OPG表達抑制破骨細胞分化,而非典型途徑則通過誘導成骨細胞相關因子的表達促進成骨分化[16]。對類似人類牙齒發(fā)育的豬模型研究發(fā)現(xiàn),直到乳牙開始萌出恒牙才從靜止階段過渡到初始階段。乳牙萌出后釋放下頜骨內累積的機械應力,進而誘導乳牙和恒牙間充質中Wnt信號下調和恒牙上皮中Wnt信號上調,觸發(fā)恒牙發(fā)育的啟動[17]。提示W(wǎng)nt信號是器官更新的關鍵啟動器,對牙齒再生機制研究提供一個新的視角。

牙齒萌出是上皮和間充質相互級聯(lián)作用并伴有牙根形成的過程。在這個時空過程中,Wnt信號的正確表達對調節(jié)細胞增殖、分化、牙根形成及上皮-間充質相互作用至關重要[18]。多種Wnt配體及其下游轉錄因子從牙齒發(fā)育起始階段便在上皮和間充質細胞中表達,當成骨和成牙細胞中β-連環(huán)蛋白的條件發(fā)生改變導致牙本質和牙骨質畸形。相反,若β-catenin過度表達則導致磨牙根變短、牙本質變薄和低礦化以及出牙失敗[19]。通過體內、體外兩個方面觀察甲狀旁腺激素相關肽(parathyroid hormone-related peptide,PTHrP)與牙囊細胞Wnt信號之間關系。體外研究表明,與PTHrP(1～34)共培養(yǎng)的牙囊細胞表達成骨細胞因子表達低于對照組,并且PTHrP(1～34)可能通過阻斷Wnt/β-catenin通路抑制牙囊細胞的成骨分化。體內研究證實了體外實驗的結果,即PTHrP(1～34)抑制牙囊成骨能力和牙槽骨的形成,加速牙齒的萌出[20]。

3.Notch信號通路與牙齒萌出:Notch信號通路是調節(jié)骨骼重塑和再生的又一重要信號系統(tǒng),參與骨髓干細胞的增殖分化、成骨細胞形成和骨基質的鈣化以及破骨細胞的融合和活化[21]。Notch共有4種配體,Notch1～4廣泛存在于各類器官中并通過協(xié)調細胞的增殖、分化和活化,決定細胞命運的走向。在骨骼中Notch1既可抑制成骨細胞的分化與礦化,也可抑制破骨細胞的分化,Notch2可與NF-κB信號通路相互作用刺激破骨細胞的生成,Notch3則被認為促進破骨細胞分化同時抑制成骨的形成, Notch4低水平表達于骨組織中,因此對其在骨改建中的研究較少。進一步的研究提示,Notch信號對成骨和干細胞發(fā)揮刺激或抑制作用具有細胞環(huán)境的依賴性,與骨發(fā)育不同階段細胞的形成和分化狀況密切相關。那么在不斷變化的牙齒發(fā)育與萌出過程中,Notch信號對牙槽骨的改建會發(fā)揮怎樣的調節(jié)作用?

Notch信號作為一種高度保守的細胞間信號傳遞機制,通過副誘導作用調節(jié)干細胞的分化和增殖,參與牙齒整個發(fā)育萌出過程。Notch信號因子的表達和激活不僅在成牙和成骨細胞的分化、牙體硬組織的鈣化、牙尖形態(tài)的構造及牙根的形成中起著關鍵性作用,而且對成熟牙齒相關損傷組織的再生也至關重要[22]。有研究發(fā)現(xiàn),牙齒萌出時牙囊干細胞的Notch信號被激活,Notch1受體抑制堿性磷酸酶的活性和礦化結節(jié)的形成,對牙囊干細胞的成骨分化功能起到抑制作用[23]。在牙齒萌出后,Notch信號則可在牙髓的干細胞中被觸發(fā),誘導它們分化為成牙本質細胞,從而產(chǎn)生新的牙本質組織。同時Notch信號還可以與其他信號通路,如轉化生長因子(transforming growth factor-β, TGF-β)、Wnt和音猬因子(sonic hedgehog,Shh)等相互作用共同調節(jié)牙齒的生長發(fā)育。

4.TGF-β信號通路參與牙齒萌出:TGF-β超家族成員是由成骨細胞和其他骨細胞產(chǎn)生的多效性生長因子,在促進骨形成和重塑中發(fā)揮重要作用[24]。TGF-β對成骨細胞具有激活或抑制雙重作用,發(fā)揮何種作用取決于TGF-β不同的濃度和時間點以及不同的靶細胞和細胞分化階段。但另有研究發(fā)現(xiàn),TGF-β對成骨細胞自噬功能的影響不會隨著濃度的增加而改變,這從一個新的角度為TGF-β生物效能研究和臨床應用提供參考[25]。

TGF-β作為功能多樣的生長因子,在牙齒發(fā)育萌出的不同部位和階段都發(fā)揮協(xié)同調節(jié)作用。阻斷牙囊細胞中TGF-β信號通路,會抑制該細胞向成骨細胞分化,導致牙齒萌出障礙和牙根形成不良[26]。通過對小鼠牙齒萌出期的牙周膜和牙槽骨中TGF-β進行研究,發(fā)現(xiàn)在牙槽嵴、牙尖和牙根間隔內有大量的骨形成,堿性磷酸酶活性增強,同時牙槽骨表面和牙周膜中TGF-β表達顯著升高,并與Wnt信號通路相互作用,共同調控牙根分化。這些結果提示,可以通過對TGF-β的管理調節(jié)牙齒的萌出異常[27]。在這種理念的指導下,有研究者用博來霉素和外源性TGF-β1處理人和大鼠的牙囊細胞進行成骨誘導實驗和信號轉導分析。研究發(fā)現(xiàn),博萊霉素和TGF-β1均可抑制牙囊細胞中成骨基因的表達,抑制了成骨能力,而且二者均通過TGF-β1信號通路發(fā)揮作用[28]。臨床上TGF-β信號通路相關基因突變可引起牙齒和顏面部的發(fā)育異常,Loeys-Dietz綜合征就是這種異常的典型性疾病。其主要臨床表現(xiàn)為上顎高弓狹窄、牙釉質缺損、錯頜、牙齒擁擠以及恒牙萌出延遲,具體的發(fā)病機制還有待于深入探究。

5.Shh信號通路與牙齒萌出:Shh信號通路在胚胎發(fā)育過程中有助于四肢的形成并在長骨縱向生長過程中調節(jié)軟骨細胞的分化和骨組織的改建,同時該信號還可以調節(jié)骨骼修復和再生期間的干細胞分化。Shh主要在牙上皮中表達,參與牙齒萌出上皮向間充質轉化并貫穿牙齒發(fā)育萌出的整個過程。通過對Shh信號在牙齒發(fā)育不同時期的功能進行研究,發(fā)現(xiàn)其可以參與調節(jié)牙齒各個部位的形成[29]。牙齒的形態(tài)發(fā)生涉及到上皮信號中心的活動,這些信號中心在其他分子中分泌Shh。Shh應答細胞需要完整的初級纖毛來進行信號轉導,初級纖毛和鞭毛內運輸(intraflagellar transport, IFT)蛋白在組織發(fā)育和體內平衡過程中控制著各個環(huán)節(jié)。在成牙細胞譜系中缺失IFT80的小鼠通過減少牙髓干細胞的增殖和分化以及破壞成牙細胞的極化,表現(xiàn)出磨牙根發(fā)育受損和前牙萌出障礙[30]。

發(fā)育中牙齒的上皮根鞘在牙根形成期間大量表達Shh,表明牙囊干細胞中Shh信號在牙根形成和牙齒萌出中發(fā)揮作用。牙囊干細胞是牙槽成骨細胞的前體細胞,骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein, BMP2)可誘導牙囊細胞的成骨分化,但是若經(jīng)過BMP2誘導成骨分化后,牙囊干細胞中Shh信號轉導途徑則被抑制[31]。對特殊發(fā)育類型的牙齒——小鼠持續(xù)生長的門牙進行研究,發(fā)現(xiàn)來自感覺神經(jīng)元的Shh在小鼠成年門牙穩(wěn)態(tài)和硬組織修復中都起著關鍵作用,但不是干細胞增殖和維持所必需的[32]。臨床上一些伴有牙齒發(fā)育異常的綜合征可能與Shh信號通路異常有關,有數(shù)據(jù)分析表明,Shh通路在空間和時間上的活動中斷是Ellis-van Creveld綜合征患者發(fā)生牙齒異常的主要原因[33]。

綜上所述,骨改建的動態(tài)平衡是牙齒正常萌出的關鍵,多種與骨改建密切相關的信號通路參與調節(jié)了這一過程,本文通過對與牙齒萌出骨改建的主要信號通路進行探討,旨在拓展牙齒萌出過程中分子調控機制并為牙齒萌出障礙的診治提供一定的參考。