楊忠慧,楊木軍,李紹祥,丁明亮,劉 琨,顧 堅,李宏生

(云南省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所/國家小麥改良中心云南分中心,云南昆明 650205)

雙單倍體(doubled haploid, DH)技術可使雜合育種材料在一個世代純合穩(wěn)定,該技術與分子育種技術整合,可構(gòu)建精準、快速的高效育種技術體系,成倍提高育種效率[1-3]。另外,通過對小麥單倍體胚進行基因編輯并結(jié)合DH技術,可降低小麥基因組的復雜性,提高基因(組)編輯效率[4]。

建立高效DH生產(chǎn)技術體系是DH 技術在作物育種中廣泛應用的前提。小麥×玉米遠緣雜交技術具有單倍體胚產(chǎn)生頻率較高、穩(wěn)定性較好、不產(chǎn)生白化苗以及無嚴格基因型限制等優(yōu)點,目前已在國內(nèi)外小麥遺傳育種中成功應用[5-6]。該技術的主要缺點是小麥和玉米一般在不同季節(jié)種植,需在人工氣候室來實現(xiàn)兩者花期相遇;其次是產(chǎn)生的單倍體胚或單倍體苗無染色體組自然加倍,需人工加倍處理;此外,染色體加倍化學試劑(如秋水仙素)毒性較大,加倍溶液需妥善處理。

自Zenkteler等[7]和Laurie等[8]報道小麥×玉米雜交產(chǎn)生小麥DH的技術規(guī)程以來,經(jīng)各國學者不斷研究與改進,目前主要包括以下步驟:麥穗去雄、授玉米花粉、激素處理、單倍體胚誘導發(fā)育、單倍體胚接種培養(yǎng)并萌發(fā)成單倍體苗、單倍體苗的染色體加倍。其中,得胚率(指小麥小花用玉米花粉授粉后,獲得可供接種培養(yǎng)的單倍體胚產(chǎn)生頻率)、成苗率(指單倍體胚接種后能萌發(fā)形成單倍體苗的百分率)、加倍率(指單倍體苗經(jīng)染色體加倍處理后,能收獲自交結(jié)實種子的雙單倍體的百分率)是評價DH技術成熟度的3個關鍵指標。

為提高小麥×玉米雜交產(chǎn)生小麥DH的效率,2000年以來,本團隊借助云南昆明自然條件下小麥(冬性和半冬性小麥需春化預處理)和玉米可同季種植、4月至12月花期可相遇的有利條件,在國內(nèi)外相關研究的基礎上,以簡化技術規(guī)程、提高DH生產(chǎn)效率、適于育種應用為目標,持續(xù)系統(tǒng)地開展了小麥×玉米雜交生產(chǎn)小麥DH的相關研究,初步建立了小麥DH批量生產(chǎn)技術體系[9-14],并促進了該技術在小麥遺傳育種中的應用。本文總結(jié)了過去20年該技術在云南省的研究進程及其在國內(nèi)小麥遺傳育種中的應用進展,以期為DH技術在小麥遺傳育種中的廣泛應用提供幫助。

1 小麥DH生產(chǎn)技術規(guī)程的研究改進

DH技術在育種中需要大批量甚至規(guī)?；a(chǎn)小麥DH,因此必須考慮DH的生產(chǎn)效率和單位成本。本團隊在國內(nèi)外報道的小麥×玉米雜交產(chǎn)生小麥DH的操作規(guī)程基礎上,借助云南昆明的自然生態(tài)條件,對小麥DH生產(chǎn)技術規(guī)程進行了研究、簡化和改進。

1.1 昆明自然條件下小麥和玉米的可雜交期研究

昆明氣溫年較差小,夏季和秋季氣候溫和,自然條件下春性小麥材料一年四季均可播種。本團隊從2002年2月9日至2003年2月1日利用7個本地春性小麥品系在昆明每隔7 d播種一期,連續(xù)播種52期,每期都能正常生長發(fā)育至成熟(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。半冬性、冬性小麥材料經(jīng)春化預處理后在昆明夏播即可正常抽穗,冬播或春播則無需進行春化處理。因此,昆明具有開展小麥×玉米雜交生產(chǎn)小麥DH的有利自然條件。

2003年小麥與玉米的花期同步試驗結(jié)果表明,昆明自然條件下小麥與玉米的可雜交期為5月上旬至10月上旬,共180 d[11]。由于春性和經(jīng)過春化處理的冬性、半冬性小麥材料在昆明自然條件下一年四季均可種植,因此延長玉米花粉供給時間即可增加小麥與玉米的可雜交期。昆明1月和10月雖然白天氣溫超過20 ℃,但平均氣溫較低,分別只有10 ℃和17 ℃左右(http://data.cma.cn/),在此期間,自然條件下種植的玉米生長緩慢,開花少甚至不開花。近年來,本團隊于1月和10月在溫室大棚分期種植玉米,保證了玉米前期能夠正常生長;開花期溫度在20 ℃以上,能夠正常開花(無需收獲玉米籽粒),進一步把小麥與玉米的可雜交期延長到每年4月中旬至12月下旬,甚至次年1月初;此外,大棚種植的玉米與自然條件下生長的玉米相比,其單倍體誘導效率也沒有明顯差異。

半冬性和冬性小麥材料除經(jīng)過春化處理后可以在昆明夏播外,也可以在昆明冬播或1～2月春播,此階段播種小麥的抽穗期一般在4月中旬至5月中旬,可與早期播種的玉米花期相遇。此外,北方麥區(qū)的冬性小麥材料也可在當?shù)卣静シN,于第二年拔節(jié)期前后挖苗移栽至昆明,與早期播種的玉米花期相遇(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。

1.2 高得胚率基因型玉米的篩選

國內(nèi)外研究表明,玉米基因型對小麥×玉米雜交產(chǎn)生的單倍體胚得胚率有顯著影響[5,15]。本團隊用糯、甜糯、甜、超甜等不同類型的玉米品種作為花粉供體進行試驗,結(jié)果表明,相同玉米類型而基因型不同的玉米品種間單倍體胚得胚率的差異大于不同類型玉米間的單倍體胚得胚率。因此,篩選高得胚率玉米品種的關鍵是篩選玉米基因型而非玉米類型[16]。

1.3 高效授粉方法的篩選

DH技術用于育種時需對大量麥穗進行授粉。根據(jù)文獻報道,用畫筆、刷子或毛筆等蘸取玉米花粉給麥穗逐朵小花的授粉效率較高[17](圖1A),一般每人每小時可授粉40～50穗。實際應用中每天常有300～500個麥穗需要授粉,而較高的玉米花粉活力持續(xù)時間一般只有約3 h,因此常規(guī)授粉方法難以滿足需要[18]。

A:逐朵小花授粉;B:整穗“滾粉”授粉;C:“滾粉”授粉后玉米花粉覆蓋小麥柱頭。A:Pollinating one-by-one with a brush; B: Whole ear “rolling pollination”; C: Maize pollens on wheat stigmas after rolling pollination.圖1 改進后的授粉方法及授粉效果Fig.1 Improved pollination methods and pollination effect

根據(jù)昆明自然條件下可大量種植玉米以及玉米花粉充足的特點,本團隊發(fā)明了“滾粉”授粉法(圖1B):待去雄麥穗基部小花柱頭呈羽毛狀散開時,于當天上午10:00～11:30采集新鮮玉米花粉,濾去花藥后將花粉置于折疊紙中,將1～2個麥穗直接置于玉米花粉中以整穗為單位進行“滾粉”(或向上輕抖1～2次玉米花粉,讓花粉自由下落于麥穗柱頭),1～2秒即完成授粉,取粉和授粉配合,每小時至少可授粉600～800個麥穗,授粉效率大幅提高。該授粉方法簡單快速,授粉效果好,授粉后玉米花粉幾乎覆蓋整個柱頭(圖1C),基本無需再次套袋,省工省時[12,14]。

1.4 激素處理與割穗離體培養(yǎng)

小麥×玉米雜交后補充激素,是產(chǎn)生單倍體胚的必要條件[15]。常用的激素處理方法為授粉結(jié)束后立即在穗下節(jié)注射2,4-D,4 h或24 h后再次逐朵小花滴注2,4-D,濃度一般為50～100 mg·L-1[11,15,19-21]。但由于這種處理方式復雜且效率較低,Matzk等[22]將該方法進行了改進,即授粉20～24 h后用50～100 mg·L-1的2,4-D溶液噴施或浸施整個麥穗。

因小麥×玉米雜交后的受精、合子形成過程以及單倍體幼胚生長發(fā)育過程均易受溫度、濕度、光照等多種環(huán)境因素的影響,授粉后雜交穗若繼續(xù)在田間母體植株上生長,會導致得胚率較低或不穩(wěn)定。Riera-Lizarazu等[23]將授玉米花粉后的麥穗從田間母體植株上生長改為割穗離體培養(yǎng),獲得了顯著的改進效果。

2014年,本團隊對不同的培養(yǎng)方法進行了比較,結(jié)果表明,割穗離體培養(yǎng)的得胚率是田間自然生長的3倍[12],且雜交穗離體培養(yǎng)的同時,簡化了激素處理方式,即授粉24 h后把所有麥穗剪回室內(nèi),再集中噴施2,4-D溶液,同時還研制了穎果結(jié)實率和得胚率均較高的麥穗離體培養(yǎng)液配方[24],從而形成了完整的離體培養(yǎng)方案[12],具體為:授粉24 h后將雜交穗沿地面根部剪回室內(nèi),集中噴施100 mg·L-1的2,4-D溶液,再插入到麥穗離體培養(yǎng)液中置于人工氣候箱(寧波江南儀器RXZ-1500B)培養(yǎng)(溫度23℃,相對濕度80%,光照8 000 Lx,每天光照14 h),每3 d更換一次營養(yǎng)液,培養(yǎng)14 d左右結(jié)束。2021年,本團隊再次優(yōu)化了割穗離體培養(yǎng)的麥穗離體培養(yǎng)液配方及培養(yǎng)程序[25],使得胚率和穎果千粒重進一步提高(圖2和表1)。

表1 不同營養(yǎng)液試驗結(jié)果Table 1 Experiment result of different medium

A: 2021年麥穗離體培養(yǎng)液新配方培養(yǎng)的穎果;B:2014年麥穗離體培養(yǎng)液配方培養(yǎng)的穎果。A: Caryopses cultivated with new formula of 2021; B: Caryopses cultivated from previous formula of 2014.圖2 割穗離體培養(yǎng)液改進前后的穎果質(zhì)量對比Fig.2 Comparison of caryopsis quality before and after medium improvement

因此,激素處理與割穗離體培養(yǎng)結(jié)合,不僅簡化了操作程序,而且提高了得胚率及其穩(wěn)定性。2016-2021年間,用于生產(chǎn)DH的1 900余份小麥材料(來自云南省及國內(nèi)其他省份共33個科研育種單位以及孟加拉國、巴基斯坦、埃及、德國)中,幾乎所有材料的得胚率均在15%以上,最高可達70%,平均值約25%左右(未發(fā)表)。

1.5 有胚穎果的篩選及胚挽救

小麥×玉米雜交產(chǎn)生的穎果有四種類型:有胚無胚乳、胚和胚乳均有、有胚乳無胚、胚和胚乳均無。前人報道的小麥×玉米雜交的雙受精率可達10%～26%[20,26-27],但本團隊發(fā)現(xiàn),胚和胚乳均有的穎果僅約占1%(未發(fā)表),因此必須對單倍體幼胚進行胚挽救才能獲得單倍體苗。

小麥×玉米雜交誘導單倍體胚的麥穗經(jīng)過14 d離體培養(yǎng)后,幼胚直徑一般可達到0.5～1.0 mm,此時為最佳胚挽救時期[11]。把小麥×玉米雜交產(chǎn)生的穎果從麥穗上剝離下來,經(jīng)過消毒、滅菌后,在解剖鏡下從穎果中剝?nèi)伪扼w胚接種于1/2 MS或B5培養(yǎng)基中進行胚挽救。由于只有約25%的穎果中含有單倍體胚,因此,本團隊設計了一種有胚穎果預識別裝置[28],能直接檢測雜交穗上剝離下來的穎果是否含有胚(圖3),將有胚穎果挑選出來,再進行消毒、滅菌、剝胚和接種。通過驗證,發(fā)現(xiàn)該裝置準確率>95%,利用該裝置使接種效率提高了2～3倍。

箭頭指示有胚穎果。Arrows indicate embryonic caryopsis.圖3 有胚穎果的預篩選結(jié)果Fig.3 Pre-screening result of caryopses with embryo

1.6 染色體加倍

由于小麥與玉米雜交產(chǎn)生的小麥單倍體植株無法自然加倍,只有通過染色體加倍處理才能獲得能正常結(jié)實的雙單倍體[14,29]。秋水仙素是最常用、效果最穩(wěn)定的染色體加倍試劑,本團隊采用浸根法進行加倍處理,加倍率為50%～90%[14],不同材料間存在顯著差異,可能與加倍處理時單倍體苗的細胞分裂時期不同有關[30]。具體操作方法:從培養(yǎng)瓶中取出帶分蘗的單倍體植株,洗凈后將植株分蘗節(jié)置于500 mg·L-1的秋水仙素液面下2～3 cm,處理5 h,然后用自來水沖洗3～4 h。浸根法影響生殖細胞染色體倍性的可能途徑為:秋水仙素通過根吸收和分蘗節(jié)滲透方式進入單倍體小麥植株體內(nèi),并擴散至各分蘗的莖節(jié)原基分生組織,導致其處于有絲分裂中期的單倍體細胞加倍成二倍體細胞,這些二倍體細胞中的部分細胞后來發(fā)育成二倍體花粉母細胞和胚囊母細胞,通過減數(shù)分裂形成正常的雌、雄配子,自交授粉后即可收獲雙單倍體種子;同時,部分莖節(jié)原基分生組織細胞受秋水仙素的作用不明顯,或受秋水仙素作用明顯但細胞未處于分裂中期,這些細胞發(fā)育形成的花粉母細胞和胚囊母細胞仍為單倍體,減數(shù)分裂時染色體分離紊亂,難形成正常的雌、雄配子,導致單倍體植株染色體加倍失敗。目前本團隊正研究秋水仙素處理植株分蘗節(jié)時,莖節(jié)原基等相關分生組織在細胞有絲分裂前期和中期分裂指數(shù)與加倍率的關系(國家基金項目32001549),為進一步改進加倍處理方法、提高加倍效率提供科學依據(jù)。

1.7 加倍苗移栽與套袋隔離

加倍處理后的單倍體植株若直接移栽至大田,其成活率較低。本團隊將加倍苗先移栽至苗盤,待完全成活后再移栽至大田[31],顯著提高了幼苗的成活率。

經(jīng)多年實踐,本團隊發(fā)現(xiàn)小麥單倍體植株在染色體加倍處理過程中,因所處發(fā)育時期不同,導致植株部分麥穗雌、雄蕊加倍不同步(未發(fā)表)。因此,在構(gòu)建用于遺傳研究的DH群體時,為避免單株間相互串粉,需對每個單株進行套袋隔離。由于需套袋的麥穗較多,工作量大,本團隊還設計了一種用于提高小麥單株隔離效率的防護裝置[32],抽穗前即可分株套袋隔離,一次可完成1個單株所有主穗和分蘗穗套袋,同時還可觀察植株的發(fā)病情況以及是否加倍成功,待植株開花結(jié)束后可回收該隔離裝置、重復利用。

2 小麥DH批量生產(chǎn)技術體系的驗證

通過多年持續(xù)、系統(tǒng)地研究改進,本團隊已基本建立了小麥×玉米雜交高效生產(chǎn)小麥DH的技術規(guī)程,平均得胚率約25%(15%～70%,以平均每穗授粉20個小花估算)、成苗率62%(50%～80%)和加倍率62%(50%～90%),為該DH技術的育種應用奠定了基礎。

2016-2021年間,本團隊利用國內(nèi)外共1 900余份小麥材料累計生產(chǎn)出10.5萬個小麥DH株系(表2),其中春性、半冬性和冬性材料各822、657和427份,均能通過該技術獲得DH。其中2021年產(chǎn)生的單倍體在2022年共獲得3.1萬個DH,初步實現(xiàn)了小麥DH的批量生產(chǎn)。

表2 2016-2021年小麥DH生產(chǎn)技術主要參數(shù)統(tǒng)計表Table 2 Technical parameters of wheat DH production during 2016-2021

3 DH批量生產(chǎn)技術的初步應用

構(gòu)建DH作圖群體是DH技術在小麥遺傳研究上的主要用途。2016年以來,本團隊先后為國內(nèi)21個科研單位構(gòu)建了64個小麥DH群體。

創(chuàng)造、選擇和固定優(yōu)異變異是作物育種的三大環(huán)節(jié)。DH技術可加快固定優(yōu)異變異進程,從純合穩(wěn)定的DH品系中篩選候選品種或優(yōu)異資源,減少了對育種經(jīng)驗的依賴。同時DH技術還可克服復合雜交、遠緣雜交等育種雜交后代分離世代長、穩(wěn)定性低等不良因素,提高育種效率[33]。

利用小麥×玉米雜交的DH技術,國外已育成了大量優(yōu)良小麥品種并推廣應用[34];國內(nèi)陳新民等[35]于2010年也育成了中麥533。2014年以來,本團隊已將DH技術全面應用于加速常規(guī)雜交育種、遠緣雜交(包括遺傳、生態(tài)和地理遠緣)、矮敗小麥群體改良的育種進程,并初步構(gòu)建了基于小麥DH技術的高效育種技術體系(圖4)。與抗條銹病基因分子標記結(jié)合,2021年育成并審定了云麥110、云麥112等小麥新品種;另有3個品種2023年推薦審定;一批冬性小麥和春性小麥雜交的抗病優(yōu)良品系正參加生產(chǎn)試驗或區(qū)域試驗;5年內(nèi)育成了24個優(yōu)良溫光敏核不育系(其中省級鑒定4個)和1 064份恢復系材料,而且育種試驗用地至少減少了1/3。2016-2021年間,為河南、山東、安徽、江蘇、河北、山西、北京、湖北、四川、貴州、云南等省份(直轄市)33個單位新品種的快速選育和抗病資源的快速創(chuàng)制提供技術支持。

圖4 基于DH技術的小麥高效育種技術體系Fig.4 Efficient wheat breeding strategy based on DH technique

2015-2019年間,孟加拉國、巴基斯坦、埃及的小麥育種者在昆明于10月下旬或11月上旬播種本國的強春性小麥育種材料,次年2月配制雜交組合或3月選擇優(yōu)良單株,4月上旬收獲后立即在昆明夏播,當年11月即可獲得DH系,從播種親本、配制雜交組合到獲得DH純系只需1年(未發(fā)表),充分發(fā)揮了DH技術在加速育種進程中的優(yōu)勢。

4 小結(jié)與展望

通過小麥×玉米雜交產(chǎn)生小麥雙單倍體是一個集田間和室內(nèi)操作于一體的系統(tǒng)性工程。盡管其基本原理和操作規(guī)程早已有大量研究報道,但整個操作規(guī)程涉及眾多技術細節(jié),建立成熟穩(wěn)定的大批量DH生產(chǎn)技術體系仍需要大量研究和實踐驗證。借助昆明得天獨厚的自然條件,通過20多年的持續(xù)研究改進,本團隊基本建立了小麥DH高效生產(chǎn)技術規(guī)程,初步實現(xiàn)小麥DH的批量生產(chǎn)和育種應用。今后還需繼續(xù)完善相關技術細節(jié),不斷提高得胚率、成苗率、加倍率等關鍵技術指標,建立規(guī)?；?、低成本的小麥DH生產(chǎn)技術規(guī)程,促進該技術在小麥遺傳育種上更廣泛地應用。

除小麥×玉米雜交外,禾本科多年生植物白茅(Imperatacylindrica)也能夠替代玉米與小麥雜交,高效獲得小麥單倍體[36]。近年來,利用基因編輯技術創(chuàng)制的單倍體誘導系已成功用于生產(chǎn)小麥DH,如敲除小麥著絲粒組蛋白基因CENH3的同源基因TaCENH3α-B和TaCENH3α-D,可獲得7%的小麥單倍體產(chǎn)生率[37],其誘導機制最先在擬南芥中被發(fā)現(xiàn),并在普通大麥和球莖大麥雜交誘導獲得普通大麥單倍體的研究中得到驗證。普通大麥與球莖大麥雜交F1雜合子中CENH3基因丟失導致染色體失活,獲得的單倍體只保留了普通大麥的染色體組[38]?；谟衩讍伪扼w誘導機理,在小麥中敲除MTL/ZmPLA1/NLD的同源基因,其突變體的單倍體誘導率為5.88%～15.66%[39];同時敲除TaMTL-4A/4B/4D基因后,小麥單倍體獲得頻率可達到11.8%～31.6%[40]。這些新方法為高效生產(chǎn)小麥DH,促進DH技術在小麥遺傳育種上的廣泛應用開辟了新途徑。