楊昊若 楊 斌

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091）

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是一種常見(jiàn)的慢性呼吸道疾病，嚴(yán)重影響患者的正常生活。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，近年來(lái)哮喘發(fā)病率不斷攀升，全球哮喘患者已達(dá)3.58 億，已成為全球性健康問(wèn)題［1］。哮喘實(shí)質(zhì)是由多種炎性細(xì)胞和炎性介質(zhì)共同參與的慢性炎癥氣道反應(yīng)，以氣道重塑和氣道高反應(yīng)性為典型病理特征。輔助性T細(xì)胞（Th）是哮喘的氣道炎癥反應(yīng)中重要的免疫細(xì)胞，其亞群Th1/Th2 的比例失調(diào)一直以來(lái)被認(rèn)為是導(dǎo)致哮喘慢性氣道炎癥發(fā)生最主要的“罪魁禍?zhǔn)住?。但隨著當(dāng)前對(duì)Th細(xì)胞的研究日益增多，這種觀念已經(jīng)無(wú)法充分闡釋許多臨床試驗(yàn)或預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)［2］，Th17 與調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）的比例關(guān)系在哮喘發(fā)生發(fā)展中亦發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，Treg 細(xì)胞可分泌包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等在內(nèi)的多種效應(yīng)細(xì)胞因子以調(diào)節(jié)Th1/Th2的比例失衡，而與其同源的Th17 則通過(guò)分泌重要的促炎介質(zhì)白細(xì)胞介素-17（IL-17）發(fā)揮著完全相反的作用。二者相互拮抗，共同維持著免疫的平衡。micro RNAs（miRNAs）是一種內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，以其對(duì)機(jī)體正常發(fā)育和免疫系統(tǒng)的重要調(diào)控作用為人們所熟知，而目前也已有相當(dāng)數(shù)量的miRNAs 被證實(shí)在哮喘發(fā)病中起關(guān)鍵作用［3］。其中miR-155 是淋巴T細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞發(fā)揮功能的必須miRNAs，其可通過(guò)多種信號(hào)通路及細(xì)胞效應(yīng)因子調(diào)控Th17 和Treg 的分化，并在分子水平上調(diào)節(jié)兩者的平衡，因此在未來(lái)治療哮喘上將miR-155作為靶點(diǎn)具有很高的價(jià)值。

中醫(yī)藥在治療哮喘上相較西藥治療具有多途徑、多靶點(diǎn)、副作用少的顯著優(yōu)勢(shì)。槲皮素（Quercetin）是一種植物衍生出的黃酮類化合物，來(lái)源于柴胡、菟絲子、甘草、旋覆花等多種中藥材，具有止咳平喘和抗過(guò)敏等作用，在治療哮喘上取得了不錯(cuò)的療效［4］。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［5］，槲皮素可通過(guò)抑制microRNA-155（miR-155）表達(dá)，有效減緩哮喘氣道炎癥反應(yīng)。但目前尚無(wú)關(guān)于槲皮素是否可通過(guò)下調(diào)microRNA-155（miR-155）表達(dá)，從而促使Th17/Treg 平衡以減緩哮喘癥狀的研究，具體作用機(jī)制仍不清晰。本研究擬通過(guò)OVA 激發(fā)致敏建立大鼠哮喘模型，檢測(cè)槲皮素對(duì)哮喘大鼠IgE 及白細(xì)胞介素（IL-4、IL-5、IL-10、IL-17）水平、支氣管病理形態(tài)變化及microRNA-155（miR-155）、Th17/Treg 平衡的關(guān)鍵蛋白維甲酸相關(guān)孤兒受體轉(zhuǎn)錄因子（RORγt）、叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（Foxp3）表達(dá)，以期探索槲皮素對(duì)哮喘的治療作用及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康成年雄性SPF 級(jí)SD 大鼠60 只，體重150～200 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0001。飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房，溫度20～24 ℃，濕度40%～60%。

1.2 藥物與試劑

槲皮素（美國(guó)Sigma，貨號(hào)PHR1488），卵蛋白（OVA）（美國(guó)Sigma，貨號(hào)A5503，批號(hào)BC88709X），Al（OH）3凝膠（美國(guó)Thermo Fisher，貨號(hào)77161，批號(hào)UE284411B），miR-155Antagomir 試劑（上海吉?jiǎng)P基因），地塞米松注射液（山東華信制藥，批號(hào)37021466），白細(xì)胞介素（IL-4、IL-5、IL-10、IL-17）ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物，批號(hào)分別為E-EL-R0014c、E-EL-R0558c、EEL-R0016c、E-EL-R0566c），蘇木素-伊紅染色試劑盒（北京索萊寶，貨號(hào)G1120），RORγt、Foxp3 單克隆抗體（美國(guó)Abcam，貨號(hào)分別為ab207028、ab215206），酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG 聚合物（北京中杉金橋，貨號(hào)PV6000），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（美國(guó)Thermo Fisher）。402A 型超聲霧化器（江蘇魚(yú)躍），LS-3750 型全自動(dòng)高壓滅菌器（日本三洋），LDZ5-2 型自動(dòng)平衡離心機(jī)（北京京立），TP1020 型全自動(dòng)脫水機(jī)（德國(guó)Leica），2016 型病理切片機(jī)（德國(guó)Leica），Olympus BX53型顯微鏡（日本Olympus），Image-Pro Plus 6.0（美國(guó)Media Cybernetics）。

1.3 模型制備

SD 大鼠分為正常組、模型組、地塞米松組、槲皮素低劑量組、槲皮素高劑量組、槲皮素+miR155 抑制劑組，每組10 只。除正常組外，其余各組于第1 天、第4天腹腔內(nèi)注射10%OVA+10%AH（OH）3的PBS混合液1 mL 致敏，第7 天將大鼠依次置于超聲霧化器中，1%OVA 霧化激發(fā)哮喘發(fā)作，空白組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)以PBS溶液代替OVA 進(jìn)行腹腔注射及霧化吸入，當(dāng)大鼠出現(xiàn)口唇發(fā)紺、呼吸加快、腹肌痙攣、點(diǎn)頭呼吸或站立不穩(wěn)等，表明造模成功［6］。

1.4 給藥方法

地塞米松組每日給予地塞米松0.005 g/kg灌胃，槲皮素低、高劑量分別每日給予中藥0.75、3.0 g/kg 灌胃，槲皮素組+miR155 抑制劑組除了每日槲皮素3.0 g/kg灌胃外，同時(shí)以miR-155Antagomir 100 mg/kg尾靜脈注射，隔日1次，共3次。干預(yù)周期為2周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 支氣管肺泡灌洗液（BALF）炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類 各組大鼠用2%戊巴比妥鈉麻醉，剪去頸部毛發(fā)后剪開(kāi)皮膚，去除氣管周?chē)M織，在氣管上橫行切口，插入氣管插管。結(jié)扎右主支氣管，經(jīng)氣管插管以PBS溶液10 mL 分3 次灌洗左肺后回收BALF，2 000 r/min離心15 min，棄上清液，取沉渣經(jīng)生理鹽水重懸，吸取少量細(xì)胞懸液置血細(xì)胞計(jì)數(shù)板下計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。Diff-Quik染色涂片后，行炎性細(xì)胞分類并計(jì)數(shù)。

1.5.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)大鼠血清炎癥介質(zhì)水平 戊巴比妥鈉麻醉大鼠，分離一側(cè)頸總動(dòng)脈，動(dòng)脈取血5 mL，2 000 r/min 離心10 min，取上層血清，采用ELISA 檢測(cè)血清中IL-4、IL-5、IL-10、IL-17、IgE 的水平，具體操作嚴(yán)格依照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5.3 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠支氣管病理學(xué)形態(tài) 取左肺組織固定于10%的甲醛溶液中，固定24 h，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 切片，HE 染色后，光鏡下觀察肺支氣管病理形態(tài)學(xué)變化。

1.5.4 免疫組化（IHC）染色觀察Foxp3、RORγ 蛋白表達(dá) 石蠟包埋后行厚度4 μm切片，烘箱70 ℃烤片1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%H2O2避光10 min 滅活內(nèi)源性酶，枸櫞酸鹽修復(fù)液（pH6.0）高壓鍋熱修復(fù)3 min，滴加Foxp3、RORγ 抗體（濃度均為1∶200），4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。次日PBS 沖洗后，滴加酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG 聚合物，常溫孵育30 min，DAB 顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，染色完成后自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。光鏡下觀察，陽(yáng)性信號(hào)為支氣管黏膜及肺泡上皮細(xì)胞棕黃色顆粒，陰性對(duì)照用PBS 代替一抗，每張切片隨機(jī)取5 個(gè)高倍視野（400倍），Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)定陽(yáng)性信號(hào)的平均光密度（IOD）值。

1.5.5 RT-PCR 法檢測(cè)細(xì)胞中miR-155、Foxp3、RORγt表達(dá) miR-155、Foxp3、RORγtmRNA 及內(nèi)參基因βactin 的引物采用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)，上海生工股份有限公司合成。引物序列為（miR-155 184 bp，上游5′-CCGTCGCTTCGGCAGCACG-3′，下游5′-GGCTAGCTTATGGCAGCC-3′；Foxp3 234 bp，上游-5′ACCTATGCCACCCTTATCC-3′，下游5′-GCTCCTCTTCTTGCGAA AC-3′ ；RORγt 150 bp，上游5′-CCTGGATGTGTAAAGAATG-3′，下游5′-TAGACTGCTAACGAATCTG-3′；β-actin 349 bp，上游5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′，下游5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′）。肺組織總RNA 提取按照試劑說(shuō)明書(shū)操作，逆轉(zhuǎn)錄后取cDNA。采用20 μL 體系，正反向引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，雙氧水6.4 μL進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共設(shè)40個(gè)循環(huán)。結(jié)果計(jì)算：LC480檢測(cè)得出的CT 值為cDNA 熒光強(qiáng)度達(dá)到所設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)，ΔCT=目的基因CT 值-內(nèi)參基因CT 值。每個(gè)樣品中mRNA相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCT。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠BALF總細(xì)胞數(shù)及分類細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

見(jiàn)表1。與正常組相比，模型組大鼠BALF 中總細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而與模型組比較，槲皮素高、低劑量組、地塞米松組、槲皮素+miR155 抑制劑組大鼠BALF 總細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低（P＜0.05）。

表1 兩組大鼠BALF總細(xì)胞數(shù)及分類細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（×105/mL，±s）

表1 兩組大鼠BALF總細(xì)胞數(shù)及分類細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（×105/mL，±s）

注：與正常組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05。下同。

組 別正常組模型組地塞米松組槲皮素低劑量組槲皮素高劑量組槲皮素+miR155抑制劑組n 10 10 10 10 10 10細(xì)胞總數(shù)5.01±0.83 18.13±2.01*9.85±0.94△12.86±1.62 10.73±1.31△9.31±1.46△中性粒細(xì)胞1.32±0.19 4.81±0.52*2.17±0.25△2.34±0.31△1.99±0.29△1.46±0.24△嗜酸粒細(xì)胞0.87±0.09 3.23±0.46*1.85±0.18△2.03±0.14 1.76±0.23△1.57±0.19△

2.2 各組大鼠血清炎癥介質(zhì)水平比較

見(jiàn)表2。與正常組相比，模型組大鼠血清IL-4、IL-5、IL-17 及IgE 水平明顯增加，IL-10 水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，槲皮素高、低劑量組及槲皮素組+miR155抑制劑組、地塞米松組IL-4、IL-5、IL-17 和IgE 水平減低，IL-10 水平上調(diào)，部分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠炎癥介質(zhì)水平比較（ng/mL，±s）

表2 各組大鼠炎癥介質(zhì)水平比較（ng/mL，±s）

組別正常組模型組地塞米松組槲皮素低劑量組槲皮素高劑量組槲皮素+miR155抑制劑組n 10 10 10 10 10 10 IL-4 7.26±1.18 62.15±10.76*31.56±5.43△47.54±6.08 35.46±5.05△34.12±4.56△IL-5 12.34±1.47 58.45±10.47*30.34±4.32△43.53±5.28 29.21±5.16△28.66±4.41△IL-17 18.67±11.53 49.67±5.67*29.55±5.83△32.45±6.51△31.79±6.33△30.56±5.87△IgE 16.02±7.01 56.31±11.43*33.55±8.63△40.21±8.51 35.87±7.94△35.16±8.73△IL-10 23.83±4.32 7.65±1.73*13.19±4.15 16.87±3.79△17.12±4.31△17.77±3.87△

2.3 各組大鼠支氣管病理改變

正常組大鼠支氣管管腔內(nèi)管壁完整，未見(jiàn)上皮細(xì)胞脫落，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管黏膜平整，平滑肌呈正常厚度。與正常組相比，模型組大鼠支氣管管腔狹窄，管腔內(nèi)分泌物增多，管壁全層炎細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管黏膜上皮脫落、變性，平滑肌層增厚明顯。與模型組相比，槲皮素高、中劑量組和地塞米松組及槲皮素+miR155 抑制劑組大鼠支氣管管腔內(nèi)黏液減少，支氣管黏膜上皮變性程度減輕，平滑肌增厚不明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠支氣管病理改變（HE染色，100倍）

2.4 各組大鼠RORγt、Foxp3蛋白的免疫組化結(jié)果

見(jiàn)圖2、表3。Th17/Treg 平衡的關(guān)鍵蛋白R(shí)ORγt和Foxp3 在各組大鼠肺組織中均有表達(dá)，主要定位支氣管黏膜上皮及肺泡上皮。結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠肺組織內(nèi)RORγt表達(dá)水平顯著升高，F(xiàn)oxp3表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，槲皮素高、低劑量組大鼠肺組織內(nèi)RORγt 表達(dá)受到抑制，F(xiàn)oxp3 表達(dá)水平上升；地塞米松組與槲皮素高、低劑量組實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨同；相比其他干預(yù)組，槲皮素+miR155抑制劑組RORγt蛋白表達(dá)量下降，F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)量上升更顯著。以上結(jié)果差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠肺組織RORγt、Foxp3蛋白表達(dá)（IHC，200倍）

表3 兩組大鼠肺組織RORγt、Foxp3免疫組化IOD值比較（±s）

表3 兩組大鼠肺組織RORγt、Foxp3免疫組化IOD值比較（±s）

組 別正常組模型組地塞米松組槲皮素低劑量組槲皮素高劑量組槲皮素+miR155抑制劑組n 10 10 10 10 10 10 RORγt 79.46±13.32 138.04±25.12*110.45±23.27△114.77±21.07△103.64±20.74△100.09±18.38△Foxp3 105.49±15.39 64.62±19.40*77.17±20.41 78.05±21.66 85.60±18.08△89.04±16.71△

2.5 各組大鼠肺組織RT-PCR 法檢測(cè)細(xì)胞中miR-155、Foxp3、RORγtmRNA表達(dá)結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠肺組織miR-155、RORγtmRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著增強(qiáng)，F(xiàn)oxp3mRNA 表達(dá)減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，槲皮素高、低劑量組、地塞米松組及槲皮素+miR155抑制劑組大鼠肺組織內(nèi)miR-155、RORγtmRNA表達(dá)明顯降低，F(xiàn)oxp3mRNA 表達(dá)活性明顯提升，部分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠肺組織miR-155、RORγt、Foxp3mRNA含量相對(duì)表達(dá)值比較

3 討 論

哮喘是多種信號(hào)通路、炎性細(xì)胞、細(xì)胞因子共同參與的呼吸系統(tǒng)疾病，其實(shí)質(zhì)是慢性炎癥反應(yīng)，以氣道高敏性和重塑為主要病理特征。哮喘發(fā)病時(shí)［7］，會(huì)引起嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎性細(xì)胞活化并向炎癥部位聚集，釋放IL-4、IL-5、IL-17等炎性介質(zhì)，激活TGF-β/Smad3 等促炎通路，直接或間接損傷氣道上皮細(xì)胞，引發(fā)氣道炎癥。同時(shí)嗜酸粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞會(huì)在炎性介質(zhì)的作用下過(guò)度活化，進(jìn)一步產(chǎn)生病理?yè)p傷。因此，嗜酸粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞總數(shù)也常用作臨床診斷哮喘的關(guān)鍵指標(biāo)。中醫(yī)治療哮喘的歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，早在近兩千多年的《黃帝內(nèi)經(jīng)》中所記載的“喘鳴”就與本病發(fā)作特點(diǎn)相似，后經(jīng)歷代發(fā)展補(bǔ)充，最終將哮喘歸納為“哮病”的范疇。目前普遍認(rèn)為其病機(jī)是肺失宣肅，主要表現(xiàn)為喘息、呼吸困難、咳嗽等肺系癥狀。槲皮素屬黃酮類化合物含多種藥理作用，具有抗炎、抗過(guò)敏、抗氧化、抗癌的作用［8］。先前研究發(fā)現(xiàn)［9］，槲皮素能夠有效緩解哮喘患者癥狀，提高患者生活質(zhì)量。本次實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，模型組相較空白組大鼠BALF 中中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞總數(shù)更多，促炎分子IL-4、IL-5、IL-17 含量顯著上升，抑炎分子IL-10水平降低，支氣管出現(xiàn)嚴(yán)重病理?yè)p傷。而相比模型組，槲皮素相關(guān)劑量組及地塞米松組大鼠BALF 中炎性細(xì)胞總數(shù)均較模型組降低，IL-4、IL-5、IL-17水平與槲皮素劑量呈反比關(guān)系，IL-10 水平升高。根據(jù)HE 染色結(jié)果顯示，相比模型組，槲皮素相關(guān)劑量組及地塞米松組大鼠的哮喘病理?yè)p傷均得到不同程度改善，證明了槲皮素對(duì)哮喘的有效治療作用。

近年來(lái)多項(xiàng)研究均證明［10-11］，一方面Th17和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞及其效應(yīng)因子本身就與哮喘關(guān)系密切，另一方面二者間的免疫失衡也在氣道炎癥和重塑這兩個(gè)重要哮喘病理進(jìn)程中發(fā)揮極大作用。Th17 細(xì)胞作用主要通過(guò)其分泌的IL-17 實(shí)現(xiàn)，IL-17 是一種強(qiáng)大的促炎細(xì)胞因子，可以引起嚴(yán)重氣道炎癥，此外其還可與氣道平滑肌細(xì)胞（ASMC）上的受體結(jié)合，促進(jìn)ASMC 增殖及遷移引發(fā)氣道重塑和高反應(yīng)性。Treg細(xì)胞是一類可抑制或調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的T 細(xì)胞，其分化數(shù)目的減少可導(dǎo)致多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)生。其在哮喘中通過(guò)釋放IL-10，抑制嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在氣道內(nèi)的浸潤(rùn)，避免過(guò)敏反應(yīng)和自身炎癥反應(yīng)過(guò)度激活。RORγt、Foxp3分別是Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞重要的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子［12-13］。RORγt 可誘導(dǎo)Th17 細(xì)胞產(chǎn)生及分化并促進(jìn)IL-17 的分泌，F(xiàn)oxp3 是Treg 細(xì)胞核中特異性轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控Treg 細(xì)胞分泌IL-10 等抑炎因子負(fù)性調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。因此RORγt/Foxp3 的表達(dá)活性在維持Th17/Treg免疫動(dòng)態(tài)平衡中的作用舉足輕重，即RORγt/Foxp3可調(diào)控Th17/Treg的免疫偏移。本此實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，槲皮素相關(guān)各劑量組Foxp3 蛋白的表達(dá)增強(qiáng)、IL-10 水平升高，RORγt 蛋白的表達(dá)量明顯下降、IL-17 水平降低，說(shuō)明槲皮素可調(diào)節(jié)Th17/Treg的平衡。

miR-155是一種可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫及炎癥的重要的microRNAs（miRNAs），因其是T 細(xì)胞、B 細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)作用所必需的miRNA，所以在包括哮喘、肺纖維化、肺結(jié)核、慢性肺阻塞、肺癌等多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中，miR-155 均參與其中并發(fā)揮重要的作用［14］。在哮喘中miR-155 除可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞以影響疾病進(jìn)程外，還可導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞功能異常加重病理?yè)p傷。以往研究者們多聚焦于miR-155 通過(guò)削弱Th2 細(xì)胞過(guò)度激活恢復(fù)CD4+T 細(xì)胞的正?；罨灾委熛淖饔茫鲆暳薽iR-155 通過(guò)調(diào)控Th17/Treg 細(xì)胞比例在哮喘致病中的重要作用。研究表明［15］，通過(guò)在CD4+T 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-155 激動(dòng)劑可以明顯提高Th17 和Treg 的比例并抑制Foxp3的表達(dá)，而在轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑后，CD4+T 細(xì)胞中Th17 和Treg 的比例則顯著降低，F(xiàn)oxp3 的表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示miR-155 可增加Th17 的數(shù)目，減少Treg 的數(shù)目，同時(shí)削弱其免疫抑制的功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)Th17/Treg 平衡的調(diào)控。那么槲皮素可否通過(guò)抑制miR-155 表達(dá)重塑Th17/Treg 失衡以發(fā)揮抗支氣管哮喘的作用呢？本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素高劑量+miR155抑制劑組與槲皮素高劑量組（陰性對(duì)照組）相比，F(xiàn)oxp3 蛋白表達(dá)更強(qiáng)、IL-10 水平更高，RORγt 蛋白活性更弱、IL-17 的水平更低，表明槲皮素與miR-155 抑制劑合用能夠顯著抑制RORγt蛋白表達(dá)、減少I(mǎi)L-17分泌，增強(qiáng)Foxp3表達(dá)、促進(jìn)IL-10 的分泌，以調(diào)節(jié)Th17/Treg 的免疫平衡。此外最新研究表明，Th17/Treg 動(dòng)態(tài)平衡的地位在多種免疫紊亂的慢性炎癥中均舉足輕重，特別是在兒童患新冠肺炎后引起的兒童多系統(tǒng)炎癥綜合征（MIS-C）中，維持Th17/Treg 的免疫平衡可顯著改善炎癥病理進(jìn)程［16］。而在肥胖與代謝性疾病中，Th17/Treg 似乎又是連接腸道微生物群與宿主代謝紊亂的橋梁［17］。再次說(shuō)明了研究Th17/Treg免疫平衡的必要性。

綜上，槲皮素對(duì)哮喘擁有良好的治療作用。其通過(guò)抑制miR-155 表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)Th17/Treg 平衡可能是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵。本次僅通過(guò)相關(guān)細(xì)胞因子層面初探槲皮素對(duì)于下調(diào)miR-155 表達(dá)以重塑Th17/Treg 平衡的機(jī)制，仍存在許多不足，后續(xù)將進(jìn)一步深入，從信號(hào)通路角度進(jìn)一步探求其具體機(jī)制。