徐予浛，謝巧玲，張薇，朱梅珍，陳小旋，郭東北，李永忠，郭建榮，李紅衛(wèi)*

（1.廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，福建廈門 361102）（2.小鳥鮮燕錦溢(廈門)健康產(chǎn)業(yè)有限公司，福建廈門 361006）

燕窩（Edible Bird's Nest，EBN）是一種雨燕科金絲燕屬鳥類分泌的唾液與其羽絨混合凝結(jié)而成的物質(zhì)[1]。近年來許多研究證明燕窩具有緩解炎癥[2]、降脂[3]、抗氧化[4]等多種生物活性，且對人體軟骨及關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞具有保護(hù)效果[5,6]。

燕窩中的蛋白質(zhì)主要以糖蛋白的形式存在[7]，唾液酸（Sialic Acid，SA）是其重要的糖基之一[8]。唾液酸是一類含有9個碳原子并具有吡喃糖結(jié)構(gòu)的酸性氨基糖的總稱，常以α-2,3或α-2,6鍵與半乳糖或N-乙酰葡糖胺連接（圖1），位于酸性N-鏈寡糖的末端，既能作為激素、凝集素、陽離子等分子的結(jié)合配體，又能掩蔽細(xì)胞或蛋白本身的關(guān)鍵識別位點；其結(jié)構(gòu)中C1位的羧基化使其帶有很強的負(fù)電性，負(fù)電之間的排斥力影響著分子、細(xì)胞間的相互作用[9]。一般所說的唾液酸多指N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac），其構(gòu)成比占該家族所有成員的99%以上。唾液酸在自然界廣泛分布，存在于唾液、胃液、血清、尿液、母乳等體液中，或燕窩、牛奶、雞蛋、奶酪等食物中。外源性唾液酸在機體內(nèi)的消化吸收與利用途徑尚不明確。研究表明大鼠單次口服放射性標(biāo)記的Neu5Ac后1 h內(nèi)，90%以上Neu5Ac以原型從尿液中排出[10]，說明絕大多數(shù)唾液酸不經(jīng)裂解即以完整形態(tài)參與機體代謝，且利用率較低。因此借鑒氮平衡實驗原理，通過監(jiān)測食物中攝入唾液酸、糞尿中排出唾液酸，即可構(gòu)建機體的“唾液酸平衡”并以此評價外源性唾液酸的消化吸收效率。

圖1 游離Neu5Ac(a)及其通過α-2,3(b)、α-2,6(c)糖苷鍵連接半乳糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formula of free Neu5Ac (a) and its linkage to galactose via α-2,3 (b) or α-2,6 (c) glycosidic bond

圖2 干預(yù)期間大鼠體質(zhì)量變化Fig.2 Body weight alteration in rats during intervention

唾液酸修飾著細(xì)胞膜最外層的糖類部分或分泌型的糖蛋白、糖脂與低聚糖等復(fù)合糖類的糖鏈末端。生物大分子的唾液酸化通過掩蔽不利的特異性識別、本身作為被識別的受體、實現(xiàn)細(xì)胞間信息傳遞等來發(fā)揮不同的功能，包括對紅細(xì)胞膜生化性質(zhì)的改變[11]、抵抗病毒感染[12]、提升學(xué)習(xí)與記憶能力[13]、調(diào)節(jié)血脂[14]、改善骨丟失[15]等。有報道稱紅細(xì)胞膜的唾液酸化參與對紅細(xì)胞生命周期的調(diào)控，新生紅細(xì)胞膜表面唾液酸含量明顯高于衰老紅細(xì)胞[16]。此外，血漿脂蛋白的唾液酸化程度被認(rèn)為與動脈粥樣硬化發(fā)展相關(guān)[14]。唾液酸化修飾是糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)和功能多樣化的物質(zhì)基礎(chǔ)，是其生物學(xué)功能發(fā)揮的前提，而食物中的營養(yǎng)物質(zhì)被吸收后最先經(jīng)過血液組織，之后才分布于全身，故推測血液唾液酸化狀態(tài)具有代表性，能夠較早反映機體內(nèi)唾液酸的利用狀況。

蛋白質(zhì)是燕窩中含量最高的營養(yǎng)成分，達(dá)50%以上。然而，機體對燕窩蛋白質(zhì)的消化與生物利用程度有限。研究顯示，經(jīng)胃腸消化后燕窩中蛋白質(zhì)和唾液酸的溶解度僅有47.23%和44.24%[17]。蛋白質(zhì)形成肽以后極具活性，可不經(jīng)消化被機體直接吸收，吸收率提高2～2.5倍[18]。目前常采用體外酶解法將燕窩黏蛋白降解為小分子肽類，以期促進(jìn)其蛋白質(zhì)吸收。鑒于蛋白質(zhì)與唾液酸的溶解性呈正相關(guān)性[17]，推測肽類也能促進(jìn)唾液酸等有效成分的生物利用。本研究擬通過動物實驗研究含有燕窩肽的即食燕窩、常規(guī)燉煮燕窩的唾液酸消化、吸收與利用狀況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動物

健康成年雄性SPF級SD大鼠32只，體質(zhì)量200～250 g。購買并飼養(yǎng)于廈門大學(xué)實驗動物中心SPF級動物實驗室，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（閩）2018-0003、實驗動物使用許可證號為SYXK（閩）2018-0009。動物倫理審批號XMULAC20210010。在22 ℃溫度、40%～60%濕度下飼養(yǎng)，12 h明暗交替照明。

1.1.2 受試干預(yù)物

采用某燕窩生產(chǎn)加工有限公司提供的含肽款即燉燕窩（0.463±0.011 g Neu5Ac/100 g）、常規(guī)款即燉燕窩（0.447±0.019 g Neu5Ac/100 g）分別作為兩種燕窩干預(yù)物；Neu5Ac標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98% HPLC）作為標(biāo)準(zhǔn)品對照干預(yù)物；空白組給予生理鹽水。

1.1.3 試劑

Neu5Ac標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma；乙腈、甲醇（均為色譜純），Sigma-Aldrich；冰乙酸，羅恩試劑；磷酸，滬試；聚乙二醇，滬試；硫酸，滬試；氫氧化鈉，滬試；硫酸銨，羅恩試劑；硼酸，滬試；異氟烷，深圳瑞沃德；甲基紅，國藥集團(tuán)；溴甲酚綠，上海三愛思；PBS-EDTA，海標(biāo)科技。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫高效液相色譜儀，Agilent 1200；Hypersil?SAX LC色譜柱，Thermo Scientific；Varioskan Flash酶標(biāo)儀，美國Thermo；VCX-150PB超聲粉碎儀，美國Sonics；FRESCO17小型臺氏高速冷凍離心機、JXFSTPRP-CL全自動樣品冷凍研磨儀、大鼠代謝籠，廈門吉卡。

1.3 動物分組與處理

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機分為空白對照組（Blank Control，BC）、含肽燕窩組（Peptide-Containing Edible Bird's Nest，PB）、常規(guī)燕窩組（Traditionaledible Bird's Nest，TB）、唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品組（SA Standard Control，SC），每組8只。使用相應(yīng)干預(yù)物按動物體質(zhì)量1%灌胃干預(yù)（比例為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。動物干預(yù)如表1所示。動物處理分為唾液酸代謝實驗和60 d連續(xù)干預(yù)實驗。

表1 實驗動物分組及處理Table 1 Grouping and treatment of rats

表2 干預(yù)期間大鼠體質(zhì)量變化Table 2 Body weight alteration in rats during intervention (±s, n=8, g)

表2 干預(yù)期間大鼠體質(zhì)量變化Table 2 Body weight alteration in rats during intervention (±s, n=8, g)

注：同列右肩相同上標(biāo)字母表示沒有顯著差異（P＞0.05）；BC為空白對照組，PB為含肽燕窩組，TB為常規(guī)燕窩組，SC為唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品組。

Group 0 wk 1 wk 2 wk 3 wk 4 wk BC 250.12±42.4a 294.15±35.24a325.34±35.26a340.18±30.64a454.21±27.24a PB 235.96±6.74a 292.47±10.16a322.89±11.65a332.33±17.36a450.31±46.85a TB 225.28±9.34a 287.03±7.91a 316.31±14.64a323.51±13.3a 439.6±21.92a SC 227.24±9.31a 287.03±14.02a318.85±20.2a 331.18±16.27a452.78±32.84a Group 5 wk 6 wk 7 wk 8 wk 9 wk BC 457.41±35.48a 481.52±39.4a 485.85±37.12a487.77±47.61a508.15±36.89a PB 459.56±49.68a 479.83±47.82a484.17±53.56a501.27±39.87a513.19±37.55a TB 434.24±22.82a 463.23±30.95a470.04±32.75a464.91±36.33a487.62±40.99a SC 450.63±30.87a 483.76±35.5a 490.43±36.16a481.19±46.38a486.06±58.91a

表3 大鼠唾液酸攝入、吸收與儲留量Table 3 Intake, absorption, and retention of sialic acid(±s, n=8, mg/2 d)

表3 大鼠唾液酸攝入、吸收與儲留量Table 3 Intake, absorption, and retention of sialic acid(±s, n=8, mg/2 d)

Group Intake Absorption Retention BC 0±0 -0.39±0.96 -0.85±2.85 PB 45.97±0.13 41.96±7.40 36.18±10.98 TB 45.18±0.19 43.72±1.34 35.92±5.41 SC 45.79±0.19 43.19±1.12 36.88±4.41

表4 唾液酸消化、吸收率Table 4 Digestion and absorption of sialic acid (±s, n=8, wt%)

表4 唾液酸消化、吸收率Table 4 Digestion and absorption of sialic acid (±s, n=8, wt%)

注：同列右肩相同上標(biāo)字母表示沒有顯著差異（P＞0.05）；PB為含肽燕窩組，TB為常規(guī)燕窩組，SC為唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品組。

Group Apparent digestibility True digestibilityProtein Biological ValueNet Protein Utilization PB 91.26±16.09a 91.26±16.09a 86.03±19.56a 78.67±23.89a TB 97.51±3.86a 98.28±3.03a 82.56±11.24a 81.30±12.24a SC 98.65±2.56a 98.65±2.56a 85.54±11.44a 84.23±10.07a

1.3.1 唾液酸代謝實驗

參照“食物蛋白質(zhì)營養(yǎng)學(xué)評價”的氮平衡實驗方法[19]，將大鼠單只喂養(yǎng)于代謝籠中，每日記錄唾液酸干預(yù)總量，收集期間的全部糞便與尿液，并檢測總唾液酸量，計算大鼠唾液酸吸收與儲留量，評價唾液酸的消化、吸收程度。此部分實驗設(shè)計為三階段：（I）無氮無唾液酸飼料（廈門普寧生物）+無受試物；（II）無氮無唾液酸飼料+受試物；（III）普通有氮飼料（北京維通利華）+受試物。I階段保證動物無任何外源性唾液酸攝入，從而確定內(nèi)源性糞、尿代謝唾液酸；II、III階段唾液酸的來源為內(nèi)源性與受試物來源唾液酸；III階段氮絕大部分來源于有氮飼料，小部分來自于內(nèi)源代謝氮或燕窩中蛋白質(zhì)，通過階段間物質(zhì)含量差值來考察消化吸收狀況[19]。每階段安排2 d作為飲食適應(yīng)期，2 d作為正式實驗期；各階段之間至少安排3 d作為洗脫期。

1.3.2 60 d連續(xù)干預(yù)實驗

連續(xù)60 d使用相應(yīng)干預(yù)物按動物體質(zhì)量1%灌胃干預(yù)。從0 d開始每隔10 d對大鼠進(jìn)行一次麻醉與頸靜脈采血，直至60 d結(jié)束時最后一次采血并處死。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 體質(zhì)量

連續(xù)干預(yù)期間，從0 d起每周記錄一次體質(zhì)量直至60 d結(jié)束。

1.4.2 唾液酸攝入、吸收與儲存量

糞便處理：唾液酸代謝實驗所收集的全部糞便烘干并記錄總質(zhì)量，研磨成均勻的粉末取0.5～5 g用超純水定容至5 mL，加等體積冰乙酸于100 ℃水浴中水解10 min后取出并冷卻至室溫。水解液經(jīng)濾紙過濾后，用流動相定容至100 mL，取上清液用0.45 μm針筒式過濾器過濾，待測。

尿液處理：全部尿液以φ=0.1%硫酸溶液稀釋至50 mL，準(zhǔn)確吸取2 mL至比色管，加等體積冰乙酸于100 ℃水浴中水解10 min并冷卻至室溫。將水解液經(jīng)濾紙過濾后用流動相定容至100 mL，取上清液用0.45 μm針筒式過濾器過濾，待測。

式中：

A——吸收總量，mg/d；

R——儲留總量，mg/d；

I——攝入唾液酸總量，mg/d；

F——糞唾液酸，mg/d；

FE——糞內(nèi)源唾液酸，mg/d；

U——尿唾液酸，mg/d；

UE——尿內(nèi)源唾液酸，mg/d。

1.4.3 唾液酸消化率、吸收率與凈利用率

根據(jù)吸收量與儲留量，計算唾液酸消化、吸收與利用率。

式中：

A——吸收總量，mg/d；

R——儲留總量，mg/d；

I——攝入唾液酸總量，mg/d；

F——糞唾液酸，mg/d；

FE——糞內(nèi)源唾液酸，mg/d；

AD——表觀消化率，wt%；

TD——真消化率，wt%；

BV——生物價，wt%；

NUR——凈利用率，wt%。

1.4.4 血漿唾液酸含量、紅細(xì)胞膜唾液酸含量

血液4 000 r/min，10 min離心，上層血漿用于檢測血漿游離唾液酸濃度、血漿蛋白結(jié)合唾液酸含量，下層紅細(xì)胞用于檢測紅細(xì)胞膜結(jié)合唾液酸含量。

血漿游離唾液酸[20,21]：取100 μL血漿，加入900 μL流動相（乙腈-0.1%磷酸水溶液60:40，體積比）稀釋至1 mL，用0.45 μm針筒式過濾器過濾，待測。

血漿結(jié)合唾液酸[20,21]：取100 μL血漿，加入400 μL飽和硫酸銨溶液4 ℃存放8 h沉淀蛋白。15 000 r/min離心15 min，吸取上清，并加入0.2 mol/L稀硫酸1 mL于80 ℃水浴鍋中水解120 min，冷卻后用0.45 μm針筒式過濾器過濾水解液，待測。

紅細(xì)胞膜結(jié)合唾液酸：0.25 mol/L PBS-EDTA緩沖液（4 ℃預(yù)冷，pH值7.6）溶脹紅細(xì)胞提取紅細(xì)胞膜，超聲粉碎機制成均勻紅細(xì)胞膜液，蛋白定量試劑盒定量膜蛋白；取600 μL膜液加入1 000 μL、0.05 mol/L稀硫酸，于80 ℃水解120 min，冷卻后用0.45 μm針筒式過濾器過濾水解液，待測。

1.5 唾液酸檢測方法

使用高效液相色譜（HPLC）測定樣品中唾液酸含量[22]。參數(shù)：色譜柱：300SCX陽離子交換色譜柱，4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（60:40，體積比）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：205 nm；檢出限：0.003 g/kg。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 體質(zhì)量

干預(yù)開始前（0 wk）大鼠體質(zhì)量236.02 g，各組無統(tǒng)計學(xué)差異（F=1.96，P＞0.05）。60 d的干預(yù)期間，各組大鼠間的體質(zhì)量始終保持相近（P＞0.05）。重復(fù)測量方差分析中，體質(zhì)量不滿足球形分布假設(shè)（χ2=531.49，P＜0.001）。采用Greenhouse & Geisser方法校正后的結(jié)果表明，隨干預(yù)時間推移，大鼠體質(zhì)量顯著增長，60 d時整體水平已增長至498.83 g，干預(yù)與時間的交互作用無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.48，P＞0.05），各組在0～60 d內(nèi)體質(zhì)量增長趨勢基本一致。

2.2 唾液酸消化、吸收率

鑒于絕大多數(shù)唾液酸均以原型形態(tài)參與腸內(nèi)吸收或隨糞尿排出[10]，參考氮平衡實驗?zāi)Ｊ?，本研究建立“唾液酸平衡”評價不同類型燕窩唾液酸的消化、吸收情況。結(jié)果如圖3所示，在兩日的代謝監(jiān)測期內(nèi)，由于各組動物體質(zhì)量、受試物折合唾液酸含量均不同，各組唾液酸攝入量略有差異，BC組無外源性唾液酸攝入。根據(jù)糞尿中唾液酸量對吸收與儲留唾液酸量進(jìn)行推算，計算與分析結(jié)果顯示，PB組的唾液酸攝入、吸收、儲留量依次為每兩日45.97、41.96、36.18 mg，TB組依次為每兩日45.18、43.72、35.92 mg，SC組依次為每兩日45.79、43.19、36.88 mg，不同干預(yù)組的唾液酸吸收與儲留量雖數(shù)值上有所差異，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 大鼠唾液酸攝入、吸收與儲留量Fig.3 Intake, absorption, and retention of sialic acid

圖4所示為各干預(yù)組唾液酸的表觀及真消化率、生物價、凈利用率。由于尚未檢出大鼠存在內(nèi)源性的糞代謝唾液酸（TB組檢出少量），故目前實驗結(jié)果表明唾液酸在機體內(nèi)的表觀消化率與真消化率相近。各干預(yù)組表觀消化率（F=1.05，P＞0.05）、生物價（F=1.34，P＞0.05）、凈利用率（F=0.22，P＞0.05）差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。故尚未從本研究所構(gòu)建的“唾液酸平衡”中觀察到唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品、含肽燕窩、常規(guī)燕窩中唾液酸的消化率、生物價或凈利用率存在明顯不同。推測原因有以下兩點：一為該平衡實驗為短期干預(yù)，短時間內(nèi)外源唾液酸難以實現(xiàn)體內(nèi)的駐留；二為該方法精確度低，不適用于評價唾液酸此類含量較低生物活性物質(zhì)的消化吸收。

圖4 不同干預(yù)物中唾液酸的消化、吸收率Fig.4 Digestibility and absorption of sialic acid in different interventions (n=8)

圖5 各組血漿游離唾液酸濃度變化Fig.5 The concentration of free sialic acid in the plasma in each group

圖6 各組血漿蛋白結(jié)合唾液酸含量變化Fig.6 The content of protein-bound sialic acid in the plasma in each group

圖7 各組紅細(xì)胞膜結(jié)合唾液酸含量變化Fig.7 The content of erythrocyte membrane-bound sialic acid in each group

2.3 血漿游離唾液酸濃度變化

實驗進(jìn)一步通過血液指標(biāo)考察唾液酸的利用情況。干預(yù)期間血漿游離唾液酸濃度的變化如表5所示。血液是外源性唾液酸進(jìn)入人體被吸收、分布和消除的必經(jīng)之路，紅細(xì)胞生命周期短且更新代謝快，可更早、更直接反映外源性唾液酸對機體的影響[23-25]。在長期連續(xù)灌胃實驗中，除BC組以外，各干預(yù)組的血漿游離唾液酸、蛋白結(jié)合唾液酸與紅細(xì)胞結(jié)合唾液酸含量均顯著升高，因此通過監(jiān)測血液中唾液酸含量變化來評估外源唾液酸的利用程度是可行的。

表5 各組血漿游離唾液酸濃度變化Table 5 The change in plasma free sialic acid concentration during the intervention (±s, n=8, g/L)

表5 各組血漿游離唾液酸濃度變化Table 5 The change in plasma free sialic acid concentration during the intervention (±s, n=8, g/L)

注：同列右肩完全不同上標(biāo)字母表示具有顯著差異（P＜0.05），按均值大小按照a、b、c、d以此類推進(jìn)行標(biāo)記；BC為空白對照組，PB為含肽燕窩組，TB為常規(guī)燕窩組，SC為唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品組。

Group 0 d 10 d 20 d 30 d 40 d 50 d 60 d BC 0.30±0.07a10.22±0.05b 0.36±0.03b0.32±0.08b0.31±0.09b0.33±0.03c 0.31±0.08c PB 0.33±0.08a0.30±0.04a 0.40±0.01a0.39±0.07a0.41±0.11a0.44±0.05b 0.55±0.06ab TB 0.33±0.06a0.29±0.03a 0.38±0.04ab0.39±0.04a0.37±0.08ab0.47±0.02ab 0.45±0.17b SC 0.29±0.11a0.31±0.04a 0.40±0.03a0.35±0.05ab0.35±0.05ab0.48±0.04a 0.62±0.08a

干預(yù)前大鼠血漿游離唾液酸濃度整體水平為0.31 g/L，經(jīng)60 d干預(yù)后，干預(yù)組濃度比BC組提高了約45.16%～100.00%。對大鼠血清游離唾液酸濃度進(jìn)行重復(fù)測量方差分析，數(shù)據(jù)不符合球形分布假設(shè)（χ2=94.41，P＜0.001）。Greenhouse-Geisser的檢驗結(jié)果顯示，時間與不同干預(yù)物的交互效應(yīng)顯著（F=10.04，P＜0.001）。簡單效應(yīng)分析結(jié)果顯示，實驗初始（0 d）時，干預(yù)受試物的簡單效應(yīng)無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.21，P＞0.05）；自給予受試物干預(yù)10 d開始至60 d干預(yù)結(jié)束，絕大多數(shù)時間點的干預(yù)受試物的簡單效應(yīng)具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），在40 d時干預(yù)物簡單效應(yīng)無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。多重比較發(fā)現(xiàn)，此期間（10～60 d）PB組濃度始終高于BC組（P＜0.05）；SC組在50～60 d時間點的血漿游離唾液酸濃度超過兩組燕窩干預(yù)組（P＜0.05）。在干預(yù)10 d時PB組、TB組和SC組的血漿游離唾液酸濃度均比初始含量有所提高（P＜0.05），并持續(xù)升高。時間的簡單效應(yīng)在各干預(yù)組都具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但并非持續(xù)升高，不同干預(yù)組均在某些時間點血漿游離唾液酸濃度達(dá)到高峰，并開始回落，可能是頻繁采血造成的貧血所致。

2.4 血漿蛋白結(jié)合唾液酸含量變化

唾液酸的修飾對象包括血漿脂蛋白、血液中多種蛋白因子、細(xì)胞表面蛋白和糖脂分子等。干預(yù)期間大鼠血漿蛋白結(jié)合唾液酸含量如表6所示，干預(yù)前大鼠血漿蛋白結(jié)合唾液酸含量整體水平為2.14 g/L，經(jīng)60 d干預(yù)后，干預(yù)組濃度比BC組提高了約28.32%～56.99%。結(jié)合本章2.3的結(jié)果可見，游離唾液酸濃度上升幅度小，血漿蛋白結(jié)合唾液酸則相對穩(wěn)定上升。游離唾液酸在體內(nèi)滯留時間短，可能被快速排出體外，或進(jìn)一步被唾液酸轉(zhuǎn)移酶修飾于大分子表面，從而轉(zhuǎn)為結(jié)合形態(tài)間接被機體利用。血漿中蛋白結(jié)合唾液酸含量是游離唾液酸的10倍左右，是極具觀測意義的指標(biāo)。

表6 各組血漿蛋白結(jié)合唾液酸含量變化Table 6 The change in plasma protein-bound sialic acid content during the intervention (±s, n=8, g/L)

表6 各組血漿蛋白結(jié)合唾液酸含量變化Table 6 The change in plasma protein-bound sialic acid content during the intervention (±s, n=8, g/L)

注：同列右肩完全不同上標(biāo)字母表示具有顯著差異（P＜0.05），按均值大小按照a、b、c、d以此類推進(jìn)行標(biāo)記；BC為空白對照組，PB為含肽燕窩組，TB為常規(guī)燕窩組，SC為唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品組。

Group 0 d 10 d 20 d 30 d 40 d 50 d 60 d BC 2.16±0.59a1 2.06±0.27b 2.41±0.56a2.42±0.16b2.92±0.09c3.02±0.18c 2.79±0.33c PB 2.13±0.59a 2.73±0.48a 2.82±0.01a3.08±0.24a3.86±0.33a4.31±0.40a 4.09±0.29a TB 2.15±0.47a 2.34±0.32b 2.33±0.77a2.56±0.42b3.37±0.48b4.15±0.46ab 3.58±0.53b SC 2.11±0.46a 2.55±0.23ab 2.54±0.96a2.68±0.28b3.36±0.46b3.91±0.40b 4.38±0.28a

表7 干預(yù)期間各組紅細(xì)胞膜結(jié)合唾液酸含量變化Table 7 The change in erythrocyte membrane-bound sialic acid content during the intervention (±s, n=8, mg/mg pro)

表7 干預(yù)期間各組紅細(xì)胞膜結(jié)合唾液酸含量變化Table 7 The change in erythrocyte membrane-bound sialic acid content during the intervention (±s, n=8, mg/mg pro)

注：同列右肩完全不同上標(biāo)字母表示具有顯著差異（P＜0.05），按均值大小按照a、b、c、d以此類推進(jìn)行標(biāo)記；BC為空白對照組，PB為含肽燕窩組，TB為常規(guī)燕窩組，SC為唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品組。

Group 0 d 10 d 20 d 30 d 40 d 50 d 60 d BC 0.28±0.14a1 0.18±0.05d 0.29±0.12b0.34±0.04b0.29±0.12b0.29±0.03c 0.43±0.06b PB 0.25±0.02a 0.41±0.03a 0.47±0.01a0.48±0.03a0.59±0.25a0.54±0.06a 0.60 ±0.01a TB 0.21±0.03a 0.32±0.02c 0.41±0.07a0.46±0.10a0.48±0.08a0.51±0.02a 0.59±0.13a SC 0.27±0.04a 0.36±0.01b 0.41±0.08ab0.43±0.04a0.46±0.06a0.43±0.04b 0.59±0.08a

對大鼠血漿蛋白結(jié)合唾液酸含量進(jìn)行重復(fù)測量方差分析，數(shù)據(jù)不符合球形分布假設(shè)（χ2=107.88，P＜0.001）。Greenhouse-Geisser的檢驗結(jié)果顯示，時間與不同干預(yù)物的交互效應(yīng)顯著（F=12.29，P＜0.001）。簡單效應(yīng)分析結(jié)果顯示，在干預(yù)10 d以及30 d往后的所有時間點，干預(yù)物的簡單效應(yīng)均存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.005）。多重比較發(fā)現(xiàn)，PB、SC組大鼠的血漿蛋白結(jié)合唾液酸含量較早高于了BC組，在10 d時PB組蛋白結(jié)合唾液酸含量已較BC組提高約32.52%（P＜0.05），TB組在40 d時方較BC組提高27.74%；給予干預(yù)10 d起PB組的含量最先高于TB組與SC組（P＜0.05）；在干預(yù)后期，各干預(yù)組的血漿蛋白結(jié)合唾液酸含量逐漸趨于一致，在60 d時干預(yù)組整體水品達(dá)到4.02 g/L，顯著高于此時的BC組2.79 g/L。時間的簡單效應(yīng)在各干預(yù)組都具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），30 d及往后時間點血漿蛋白結(jié)合唾液酸含量均高于0 d時的初始含量。目前研究已發(fā)現(xiàn)血漿載脂蛋白A-II、B-48、B-100、C-II、C-III、D、E、J均存在唾液酸化修飾[26-28]；高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的去唾液酸化與動脈粥樣硬化、2型糖尿病的發(fā)生有顯著相關(guān)性[29-31]，蛋白表面唾液酸的修飾水平影響著機體的健康狀況。

2.5 紅細(xì)胞膜結(jié)合唾液酸含量變化

干預(yù)前大鼠紅細(xì)胞膜結(jié)合唾液酸含量整體水平為0.25 mg/mg prot，經(jīng)60 d干預(yù)后，干預(yù)組濃度比BC組提高了約37.21%。唾液酸被認(rèn)為能夠影響紅細(xì)胞的形態(tài)、攜氧能力、膜變形性、氧合能力，甚至血紅蛋白（Hb）分子的結(jié)構(gòu)和分布[32-34,16]。有報道稱酶法去除紅細(xì)胞膜表面部分唾液酸后，紅細(xì)胞聚集程度增加，且生化特性與細(xì)胞存活時間都受到影響。紅細(xì)胞的抗聚集能力主要源于其自身的電負(fù)性，而紅細(xì)胞90%的負(fù)電荷均為唾液酸所提供[35]。因此，紅細(xì)胞表面唾液酸的準(zhǔn)確表達(dá)對生理和病理過程至關(guān)重要[36]。

對大鼠紅細(xì)胞膜結(jié)合唾液酸含量進(jìn)行重復(fù)測量方差分析，數(shù)據(jù)不符合球形分布假設(shè)（χ2=95.34，P＜0.001）。Greenhouse-Geisser的檢驗結(jié)果顯示，時間與不同干預(yù)物的交互效應(yīng)顯著（F=5.30，P＜0.001）。簡單效應(yīng)分析結(jié)果顯示，從給予受試物干預(yù)10 d開始至60 d干預(yù)結(jié)束，受試物的簡單效應(yīng)始終具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.005）。多重比較發(fā)現(xiàn)，10～60 d各干預(yù)組紅細(xì)胞膜結(jié)合唾液酸含量均高于BC組（P＜0.05）；干預(yù)組中的PB組含量均值高于其他組，在10 d時與TB組、SC組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；SC組的紅細(xì)胞膜結(jié)合唾液酸含量在10 d、50 d這些時間點上都顯著低于PB組與TB組（P＜0.05）。PB組、TB組和SC組的紅細(xì)胞膜結(jié)合唾液酸含量值均在干預(yù)10 d時與初始含量出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），并持續(xù)升高，干預(yù)結(jié)束時干預(yù)組整體水平達(dá)到0.59 mg/mg prot，顯著高于BC組的0.43 mg/mg prot。

結(jié)合2.4、2.5的結(jié)果，可認(rèn)為在長期唾液酸負(fù)荷下，血液中蛋白與紅細(xì)胞的唾液酸化程度能夠顯著提高。時間效應(yīng)，即受試物長期干預(yù)所提供唾液酸的累積，是最主要的效應(yīng)。50～60 d血液唾液酸含量下降，可能是頻繁采血致貧血的影響，而40～50 d期間血液唾液酸指標(biāo)基本達(dá)到高峰，建議該方法評價實驗以40～50 d為宜。

蛋白質(zhì)被吸收前，需在體內(nèi)消化酶的作用下依次分解為多肽、寡肽、游離氨基酸。除游離氨基酸外，寡肽也被證實能在腸道直接吸收[37]，并參與機體組織蛋白的再生與合成[38,39]。寡肽被認(rèn)為能夠起載體作用，將食物中的營養(yǎng)物質(zhì)運載輸送到機體各細(xì)胞、組織與器官，促進(jìn)其他營養(yǎng)成分的吸收。本次受試燕窩的蛋白質(zhì)消化、吸收率未觀察到明顯差異，故文中不予贅述。但長期干預(yù)過程中，含肽的PB組血漿蛋白結(jié)合唾液酸、紅細(xì)胞膜結(jié)合唾液酸含量較早出現(xiàn)升高現(xiàn)象，在多個時間點均高于TB、SC組。因此推測燕窩肽可能有利于唾液酸分子穿過腸道粘膜細(xì)胞，或促進(jìn)燕窩中唾液酸的利用，在機體內(nèi)更早實現(xiàn)高水平的唾液酸化。

在干預(yù)60 d時TB組的血漿蛋白結(jié)合唾液酸、紅細(xì)胞膜唾液酸含量已與PB組接近，說明在保證長期攝入的前提下，各類燕窩產(chǎn)品均能起到提高機體唾液酸化程度的作用，無論是否加入燕窩肽類物質(zhì)。且在一定時刻，機體唾液酸化水平會達(dá)到某種飽和狀態(tài)，推測機體本身可能存在唾液酸的平衡機制，唾液酸化修飾存在飽和狀態(tài)。因此外源性唾液酸的補充應(yīng)遵循長期且適量的原則。

3 結(jié)論

燕窩的攝入提高了機體血液中唾液酸的含量，燕窩中唾液酸的體內(nèi)利用程度可具體體現(xiàn)在血漿游離唾液酸濃度、蛋白結(jié)合唾液酸含量、紅細(xì)胞膜唾液酸含量等指標(biāo)上。燕窩中的肽類物質(zhì)能夠促進(jìn)唾液酸的利用，有助于外源性唾液酸在各類蛋白、紅細(xì)胞表面的修飾，可幫助機體在早期實現(xiàn)唾液酸化水平的突破。各類燕窩經(jīng)30 d以上連續(xù)食用均能提高機體唾液酸化水平，且比攝入游離唾液酸更早出現(xiàn)效果。