冷冬月 李旭峰 方興剛

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病,與滑膜組織增生、血管翳形成、軟骨破壞和全身性并發(fā)癥相關(guān),臨床表現(xiàn)為早期關(guān)節(jié)腫脹、行動不便等,嚴重者會導(dǎo)致關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)周圍結(jié)構(gòu)損傷、關(guān)節(jié)強直甚至畸形以及全身炎癥[1,2]。RA暴露出的致殘問題,可造成患者經(jīng)濟負擔(dān)加重,治療難度增高[3],因此尋找并研究RA治療藥物具有重大意義。研究表明,在RA的治療中,傳統(tǒng)中草藥具有抑制氧化應(yīng)激,下調(diào)促炎細胞因子水平,降低金屬蛋白酶誘導(dǎo)的軟骨破壞,增強抗氧化活性等作用[4]。吳茱萸堿(evodiamine,Evo)為提取自中藥植物吳茱萸干燥成熟果實的活性生物堿,具有抗癌、抗炎、抗骨質(zhì)疏松活性等[5]。一項研究表明在佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠中,Evo治療可以調(diào)節(jié)大鼠免疫平衡,降低促炎細胞因子的水平,改善關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥[6]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein box 1,HMGB1)/Toll樣受體4(Toll like receptor-4,TLR-4)/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路在多種疾病炎癥中均有作用,如脂多糖誘導(dǎo)的肝腎損傷、急性肺損傷等[7,8]。在哮喘大鼠的治療中,Evo可通過下調(diào)HMGB1/NF-κB/TLR-4信號通路,發(fā)揮減輕氣道重塑和炎癥的重要保護作用[9]?？紤]到Evo的抗炎特性和HMGB1/NF-κB/TLR-4信號通路在炎癥疾病中的作用,本研究推測Evo可能通過作用于HMGB1/NF-κB/TLR-4信號通路在RA中發(fā)揮保護作用,并建立膠原誘導(dǎo)的RA大鼠模型,報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠70只,周齡為6周,體重180～200 g,購自廣州銳格生物科技有限公司,許可證號:SCXK(粵)2021-0059。所有動物飼養(yǎng)于醫(yī)院動物實驗中心,12/12 h自然晝夜交替培養(yǎng),自由飲食水,所有實驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,檢查無異常,用于后續(xù)實驗。

1.2 試劑與儀器 (1)Evo標(biāo)準(zhǔn)品(純度:98%～99%)購自上海同田生物技術(shù)有限公司;牛Ⅱ型膠原購自上海創(chuàng)賽科技有限公司;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司;β-actin、HMGB1、TLR-4、p-NF-κB p65、NF-κB p65抗體均購自Abcam公司;腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)的ELISA試劑盒購自上海紀(jì)寧科技生物有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide Dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;HE染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;TUNEL染色試劑盒武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。(2)儀器:全自動酶標(biāo)儀購自賽默飛世爾科技中國有限公司;光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 造模及分組處理:取60只大鼠根據(jù)文獻[10]進行造模,方法:將醋酸溶解的牛Ⅱ型膠原(2 g/L)分別與弗氏完全佐劑(1 g/L)、弗氏不完全佐劑(1 g/L),按等體積配比為乳劑Ⅰ和乳劑Ⅱ。第1天在大鼠尾根部皮下注射0.1 ml乳劑Ⅰ,第10天在大鼠尾根部皮下注射0.05 ml乳劑Ⅱ,造模10 d后出現(xiàn)足跖腫脹者為造模成功大鼠,最終建模成功56只,失敗4只。將造模大鼠分為模型組(n=12)、吳茱萸堿低(n=11)、中(n=11)、高(n=11)劑量組(Evo-L、M、H組)(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg)[11]、陽性對照(美洛昔康組)(n=11)(2 mg/kg)[12],另取10只同時注射0.9%氯化鈉溶液的健康大鼠作為對照組。給藥方式:造模成功后第1天開始給藥,Evo-L、M、H組分別按照對應(yīng)劑量灌胃給予Evo,美洛昔康組按照2 mg/kg劑量灌胃給藥,RA組和對照組給予同體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。1次/d,連續(xù)干預(yù)28 d。

1.3.2 大鼠的足跖腫脹度及關(guān)節(jié)炎指數(shù):①足跖腫脹度:分別于給藥第7、14、21、28 d使用足跖容積測量儀進行測量。②關(guān)節(jié)炎指數(shù):分別于給藥第7、14、21、28天對大鼠進行觀察,計算關(guān)節(jié)炎指數(shù)。評分越高,關(guān)節(jié)炎越嚴重。見表1。

表1 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分

1.3.3 樣本采集:1.3.2項結(jié)束后,麻醉大鼠,腹主動脈取全血,用于血清炎性因子水平檢測。然后斷頭處死,取雙側(cè)踝關(guān)節(jié)滑膜組織用于后續(xù)實驗。

1.3.4 HE染色觀察踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)變化:將右側(cè)滑膜組織用PBS沖洗干凈后,加入固定液固定,乙醇脫水,石蠟包埋,切片后按照HE染色試劑盒說明書進行染色。光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.3.5 TUNEL法檢測踝關(guān)節(jié)滑膜細胞凋亡:將1.3.4制備的石蠟切片脫蠟至水化,加入破膜液20 min后,PBS洗滌。采用TUNEL染色試劑盒染色,熒光顯微鏡下觀察并拍照,凋亡細胞核呈棕黃色,正常細胞核顯藍色,對凋亡細胞進行計數(shù),計算細胞凋亡率。

1.3.6 微量法檢測踝關(guān)節(jié)滑膜組織氧化應(yīng)激指標(biāo):將部分左側(cè)滑膜組織勻漿后,分離上清液,滑膜組織上清液中MDA、SOD、GSH-Px水平檢測根據(jù)試劑盒操作說明書進行,在酶標(biāo)儀下根據(jù)對應(yīng)波長讀數(shù),計算上述因子水平。

1.3.7 ELISA法檢測血清炎性因子:將1.3.3取得的血樣離心后取上清,根據(jù)ELISA檢測試劑盒說明書檢測血清中IL-6、CRP、TNF-α的水平。

1.3.8 Western blot法檢測滑膜組織中HMGB1/TLR-4/NF-κB通路相關(guān)蛋白:將部分左側(cè)滑膜組織液氮研磨勻漿后離心,加入RIPA裂解蛋白,離心后,BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟完成后,加入一抗HMGB1(1∶1 000)、TLR-4(1∶1 000)、p-NF-κB p65(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000),以β-actin(1∶1 000)為內(nèi)參,4℃過夜,PBS洗膜,加入二抗,孵育1 h。加入顯影液顯影,根據(jù)目的條帶灰度值計算蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 Evo對大鼠足跖腫脹度的影響 給藥后第7、14、21、28天,RA組大鼠足跖腫脹度顯著高于control組(P<0.05);Evo-L、M、H組及美洛昔康組與RA組相比,大鼠足跖腫脹度顯著下降(P<0.05);其中Evo-H組足跖腫脹度最低(P<0.05),與美洛昔康組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 6組大鼠足趾腫脹度比較

2.2 Evo對大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響 給藥后第7、14、21、28天,Evo-L、M、H組及美洛昔康組與模型組相比,大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);其中Evo-H組關(guān)節(jié)炎指數(shù)下降最顯著,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且與美洛昔康組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 6組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較

2.3 Evo對大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)變化的影響 對照組大鼠滑膜組織結(jié)構(gòu)完整正常;模型組大鼠可見明顯的滑膜細胞增生,炎性細胞浸潤明顯,滑膜層相對增厚;Evo處理后,隨著Evo濃度增大,病變顯著好轉(zhuǎn)。美洛昔康組與Evo-H組滑膜組織病變好轉(zhuǎn)最為顯著。見圖1。

圖1 6組大鼠關(guān)節(jié)病理組織學(xué)觀察圖(HE染色×100)

2.4 Evo對大鼠滑膜細胞凋亡的影響 模型組大鼠滑膜細胞凋亡率顯著低于對照組(P<0.05);經(jīng)過Evo和美洛昔康處理后,4組滑膜細胞凋亡率顯著高于模型組,Evo-H組與美洛昔康組滑膜細胞凋亡率最高(P<0.05),并且2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2,表4。

圖2 6組大鼠滑膜細胞凋亡(TUNEL染色×100)

表4 6組大鼠滑膜細胞凋亡率 %,

2.5 Evo對大鼠滑膜組織氧化應(yīng)激的影響 模型組大鼠出現(xiàn)高氧化應(yīng)激狀態(tài),其中MDA水平較對照組顯著上升,SOD、GSH-Px水平較對照組顯著下降(P<0.05);Evo各組和美洛昔康組MDA水平較模型組顯著下降,SOD、GSH-Px水平較對照組顯著上升(P<0.05);Evo-H組與美洛昔康組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 6組大鼠滑膜組織氧化應(yīng)激水平比較

2.6 Evo對大鼠血清炎性因子的影響 模型組大鼠血清中IL-6、CRP、TNF-α水平顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);Evo-L、M、H組和美洛昔康組IL-6、CRP、TNF-α水平較模型組顯著下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);Evo-H組與美洛昔康組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表6。

表6 6組大鼠血清炎性因子水平比較

2.7 Evo對大鼠滑膜組織中HMGB1/TLR-4/NF-κB信號通路的影響 模型組大鼠滑膜組織中HMGB1、TLR-4蛋白水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值顯著高于對照組(P<0.05);Evo-L、M、H各組和美洛昔康組HMGB1、TLR-4蛋白水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值較模型組顯著下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);Evo-H組與美洛昔康組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表7,圖3。

圖3 大鼠滑膜組織中HMGB1/TLR-4/NF-κB信號通路蛋白

表7 大鼠滑膜組織中HMGB1/TLR-4/NF-κB信號通路蛋白表達

3 討論

RA是一種慢性全身性疾病,其特征在于滑膜炎癥、關(guān)節(jié)炎性細胞浸潤,對患者生活質(zhì)量產(chǎn)生不良影響[13]。臨床治療主要以緩解炎癥為著力點,常規(guī)的西藥抗炎藥物可能引發(fā)腸胃刺激和抑制骨髓再生的副作用,目前治療方向逐漸向具有多靶點抗風(fēng)濕作用的中藥類復(fù)方或者單體物質(zhì)治療轉(zhuǎn)移,頗有成效[12]。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠足跖腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著高于對照組,提示造模成功?；そM織增生、炎性細胞浸潤和侵襲,關(guān)節(jié)功能破壞是RA的典型病理特征[14]。本研究HE染色結(jié)果顯示,模型組大鼠滑膜組織呈現(xiàn)出典型上述病理學(xué)變化,經(jīng)過Evo各劑量處理后,滑膜增生減弱,炎性細胞浸潤逐漸減輕。TUNEL染色顯示,經(jīng)過Evo處理后,滑膜細胞凋亡率顯著上升與陽性藥物(美洛昔康)藥效類似,提示Evo可抑制模型組大鼠滑膜細胞凋亡,改善滑膜組織增生。

RA與氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)有關(guān),一項關(guān)于RA患者的研究顯示,血清MDA水平過高,SOD、GSH-Px水平過低,表現(xiàn)為高氧化應(yīng)激狀態(tài)[15]。氧化應(yīng)激還會加劇炎性反應(yīng),促進促炎細胞因子表達,而促炎細胞因子高表達可導(dǎo)致并加重RA的病情。研究發(fā)現(xiàn),IL-6、TNF-α可作為RA的早期預(yù)測標(biāo)志物,其中IL-6可以促進滑膜成纖維細胞的致病性轉(zhuǎn)化和侵襲,TNF-α主要誘導(dǎo)細胞增殖、代謝活化、炎性反應(yīng)和細胞死亡等生物活動[16]。CRP也可作為RA全身炎性的標(biāo)志物,它們在與RA相關(guān)的炎性途徑中起重要作用[17]。本研究中經(jīng)過Evo處理后模型組大鼠滑膜組織中氧化應(yīng)激水平顯著降低,血清中促炎細胞因子的表達也顯著降低,表明Evo可能通過氧化應(yīng)激和促炎級聯(lián)反應(yīng),改善RA大鼠病癥。

HMGB1/TLR4/NF-κB通路的活化,可促進促炎細胞因子產(chǎn)生和釋放,啟動炎性反應(yīng);通過藥物抑制該通路蛋白表達,可以減輕小膠質(zhì)細胞活化和神經(jīng)炎性[18]。另外,抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路還可改善結(jié)腸炎大鼠炎性[19]。抑制該通路也可以下調(diào)炎性因子的表達,如黃芩苷可通過下調(diào)miR-181b/HMGB1/TRL4/NF-κB通路,抑制LPS誘導(dǎo)的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、Cox和iNOS等表達和產(chǎn)生[20]。本研究結(jié)果顯示,Evo處理后抑制了HMGB1/TLR4/NF-κB通路表達及炎性因子釋放,改善了模型組大鼠的炎性反應(yīng)。提示Evo具有改善RA大鼠關(guān)節(jié)炎病癥的潛力,其作用可能通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路實現(xiàn)。

綜上所述,Evo可能通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路,改善RA大鼠的滑膜增生和炎性反應(yīng)。