夏葦 劉偉鳳 張琦

膿毒癥在重癥監(jiān)護室中發(fā)病率和死亡率居高不下,其嚴重形式——感染性休克可導致高達60%的死亡率[1]。據(jù)報道,全球每年有超過1 900萬膿毒癥患者,其中600萬患者死亡,病死率超過1/4[2]。膿毒癥的治療不僅占用大量的醫(yī)療資源,同時給社會和個人造成了嚴重的經濟負擔。事實上,感染性休克引起的炎性反應失控是膿毒癥高死亡率的主要原因之一。在膿毒癥期間,為了應對感染和危險信號,炎性介質的產生不受控制,從而誘導有害的免疫反應,最終導致多器官功能障礙[3]。值得注意的是,肺是最常見和最脆弱的器官之一,主要表現(xiàn)為急性肺損傷(acute lung injury,ALI)和急性呼吸道疾病窘迫綜合征[4]。具體而言,ALI是一種嚴重的炎性肺病,其特征是炎性細胞浸潤、炎性介質過度產生、肺泡損傷,以及細胞因子積累,最終導致嚴重的急性呼吸窘迫綜合征。因此,改善失調的炎性反應是實現(xiàn)ALI成功治療的重要策略。氫溴酸山莨菪堿(C17H23NO4·HBr,Ani HBr)即山莨菪堿,是1956年從中國特產植物山莨菪根中提取的活性成分,常用于治療胃腸痙攣和有機磷農藥中毒[5]。研究報道,山莨菪堿具有顯著的抗炎作用,能夠抑制心肌細胞氧化應激和凋亡,對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用[6]。另外,山莨菪堿可抑制急性腎損傷和胰腺腺泡細胞損傷中的炎性反應[7,8]。然而,其在ALI進展中的作用仍有待研究。因此,本研究旨在探討Ani HBr在感染性休克大鼠急性肺損傷中的作用,并通過體內實驗研究Ani HBr對受損大鼠肺組織的細胞凋亡和炎性過程的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只SPF級雄性SD大鼠(8～10周齡),體重250～300 g,購自上海實驗動物研究中心,許可證號:SYXK(滬)2018-0028。每籠5只大鼠,自由飲食飲水,室溫(21～23℃),濕度(30%～70%),12 h光照/12 h黑暗。所有動物實驗均經過華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院倫理委員會批準并完全遵循《國際實驗動物保護與使用指南》。適應性飼養(yǎng)1周后進行后續(xù)動物實驗。

1.2 主要試劑與儀器 氫溴酸山莨菪堿注射液購自長春長慶藥業(yè)集團有限公司;脂多糖購自美國Sigma公司;蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司;鼠L-1β、IL-6及TNF-α ELISA試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司;Bcl2抗體、Bax抗體、Caspase-3抗體、NF-κB p65抗體、NLRP3抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗均購自abcam公司;GAPDH抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。梅特勒托利多精密天平(PL-IC,蘇州賽恩斯),自動組織處理機(TP1020,德國徠卡),Bio-Rad凝膠成像分析儀(ChemiDocTM,美國伯樂),多功能酶標儀(VarioskanTMLUX,美國賽默飛)。

1.3 方法

1.3.1 模型制備與分組:將30只大鼠按照隨機數(shù)表法分為假手術組(Sham)、模型組(LPS)以及Ani HBr治療組(LPS+Ani HBr),每組10只。隨后,按照Tian等[9]的方法,建立脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的感染性休克大鼠急性肺損傷模型。具體操作:SD大鼠禁食12 h后,用20%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠,割開頸部,暴露氣管。待血壓穩(wěn)定后,LPS+Ani HBr組通過1 ml注射器沿氣管壁插入氣管內,注入15 mg/kg LPS,隨后立即腹腔注射3.6 mg/kg的Ani HBr;LPS組通過氣管管道注入15 mg/kg LPS后,按上述操作注射等體積的0.9%氯化鈉溶液;Sham組不做任何處理。

1.3.2 樣本收集:給藥處理6 h后,麻醉處死大鼠,用預冷的PBS通過氣管插管沖洗肺3次。灌洗液經1 500 r/min離心10 min,收集上清液,即支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。BALF在-4℃中保存待用。隨后,將40～50 μg肺組織置于-80℃冰箱儲存。

1.3.3 確定肺系數(shù)、濕/干重比及組織含水量 實驗前大鼠稱重并記錄。實驗后,取大鼠右側肺組織,用吸水紙去除表面水分,稱重并記為濕重,計算肺組織系數(shù)。隨后將肺組織置于60℃烘箱中,連續(xù)干燥72 h直至組織重量保持不變,稱重并記為干重,計算肺組織濕/干重(W/D)比及肺組織含水量。肺組織系數(shù)=濕重/體重×100%,肺組織含水量=(1-干重/濕重)×100%。

1.3.4 肺組織病理學觀察:取左肺上葉部分組織在4%多聚甲醛溶液中固定48 h,脫水后石蠟包埋,切片厚度5 μm,最后蘇木素-伊紅染色觀察病理變化。肺組織損傷由專業(yè)病理學家在雙盲條件下根據(jù)肺泡腔結構完整性、中性粒細胞和淋巴細胞浸潤等情況進行評分。評分標準:無肺組織損害,0分;肺組織損害范圍<25%,1分;肺組織損害范圍20%～50%,2分;肺組織損害范圍51%～75%,3分;肺組織損害范圍>75%,4分。取每個病理切片的4個不同視野進行評分,并對評分結果進行統(tǒng)計學分析。

1.3.5 BALF中炎性相關細胞因子水平檢測:按照ELISA試劑盒說明,檢測各組大鼠BALF中IL-1β、IL-6及TNF-α濃度。以空白孔調零,多功能酶標儀在450 nm波長下檢測OD值,根據(jù)標準曲線計算樣品中IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度。

1.3.6 Western blot檢測凋亡相關蛋白表達及NF-κB/NLRP3通路的活性:取左肺下葉組織置于RIPA裂解液和磷酸酶抑制劑中,冰上裂解30 min。 4℃,12 000 r/min,離心10 min。然后將上清液轉移到新的離心管中,-20℃儲存。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。等量蛋白經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,用0.22 μm PVDF膜濕轉90 min。電轉結束后,將膜用5%(w/v)的BSA室溫下封閉1.5 h,隨后與TBST稀釋的特異性一抗4℃孵育過夜。一抗包括Bcl2(1∶1 000)、Bax(1∶500)、Caspase-3(1∶200)、NF-κB p65(1∶200)、NLRP3(1∶500)、和GAPDH(1∶2 000)。將膜用TBST洗滌30 min后,在室溫下與HRP標記的二抗(1∶2 000)孵育2 h,用TBST洗滌15 min。ECL發(fā)光試劑顯色蛋白質帶,最后用ImageJ軟件分析灰度值。

2 結果

2.1 Ani HBr降低肺系數(shù)、肺組織W/D比以及肺組織含水量 Sham組肺系數(shù)、肺組織W/D比值及肺組織含水量分別為(0.73±0.23)%,(6.12±0.22和(80.12±1.85)%;LPS組肺系數(shù)、肺組織W/D比值及肺組織含水量分別為(1.19±0.11)%,8.61±0.61和(85.71±0.43)%。與Sham組比較,LPS組大鼠的肺系數(shù)、肺組織W/D比值及肺組織含水量明顯升高(均P<0.05)。在給予Ani HBr處理后肺系數(shù)、肺組織W/D比值及肺組織含水量分別為(0.75±0.03)%,(6.02±0.17)和(79.88±1.05)%,與LPS組比較,LPS+Ani HBr(3.6 mg/kg)組大鼠的肺系數(shù)、肺組織W/D比值及肺組織含水量顯著降低(均P<0.05)。這提示Ani HBr能夠降低感染性休克大鼠急性肺損傷中的肺系數(shù)、肺組織W/D比和肺組織含水量。

2.2 Ani HBr改善感染性休克大鼠肺組織病理改變 與Sham組比較,LPS組肺泡結構紊亂,肺泡腔及間隔內大量中性粒細胞及淋巴細胞浸潤,肺泡間隔增寬,肺泡腔受壓塌陷。LPS+Ani HBr組肺組織出現(xiàn)與LPS組相似的病理改變,但嚴重程度相對較輕。隨后對各組大鼠進行肺組織形態(tài)學病理評分。LPS組病理評分明顯高于Sham組(P<0.01)。LPS+Ani HBr組病理評分明顯低于LPS組(P<0.05)。見圖1,表1。

表1 3組大鼠肺組織病理學評分比較 n=10,

圖1 3組大鼠肺組織病理結構比較(50 μm,HE×100)

2.3 3組大鼠BALF中IL-1β、IL-6以及TNF-α水平比較 3組大鼠BALF中IL-1β與Sham組比較,LPS組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6及TNF-α含量顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05);而經Ani HBr治療后,感染性休克大鼠肺組織中的促炎因子IL-1β、IL-6及TNF-α的含量明顯降低(均P<0.05)。以上結果說明Ani HBr能夠抑制感染性休克大鼠肺組織中炎性反應。見表2。

表2 3組大鼠BALF中炎性因子表達水平比較 n=10,

2.4 3組大鼠肺組織中Bcl2、Bax以及Caspase-3 等凋亡蛋白相對表達量比較 Bcl2具有抗凋亡作用,而Bax和Caspase-3具有促凋亡作用。Western blot結果顯示,與Sham組比較,LPS組大鼠肺組織中Bcl2蛋白表達明顯降低(P<0.01),而Bax和Caspase-3蛋白表達明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);而經Ani HBr治療后,感染性休克大鼠肺組織中的Bcl2蛋白表達顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),而Bax和Caspase-3蛋白表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3,圖2。

表3 3組大鼠肺組織中凋亡相關蛋白表達情況比較 n=10,

圖2 3組大鼠肺組織中相關蛋白表達水平;A 凋亡相關蛋白相對表達水平;B NF-κB和NLRP3蛋白相對表達水平

2.5 3組大鼠肺組織中NF-κB p65和 NLRP3蛋白相對表達量比較 采用Western blot法檢測3組大鼠肺組織中NF-κB p65和NLRP3 蛋白相對表達量。結果顯示,與Sham組比較,LPS組大鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3蛋白表達顯著升高(P<0.01)。這提示LPS誘導的大鼠急性肺損傷與NF-κB/NLRP3通路密切相關,LPS能夠激活NF-κB/NLRP3信號通路。另外,與LPS組比較,經Ani HBr治療后,大鼠肺組織中NF-κB p65、NLRP3蛋白表達顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);說明Ani HBr在感染性休克大鼠模型中發(fā)揮肺保護作用,在機制上與NF-κB/NLRP3信號通路相關。見表4,圖2。

表4 3組大鼠肺組織中NF-κB p65和NLRP3蛋白表達情況比較 n=10,

3 討論

膿毒癥誘導的急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是感染性休克疾病最常見的死亡原因之一。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分,其誘導的炎性反應是導致ALI的重要致病因素,其氣管給藥方式在動物模型中應用廣泛[10]。本研究中,我們建立了LPS誘導的急性大鼠肺損傷模型,以研究Ani HBr對感染性休克大鼠急性肺損傷的保護作用及潛在的分子機制。

肺系數(shù)能夠指示肺組織損傷的嚴重程度,肺組織W/D比是肺血管通透性的重要指標之一,而肺組織含水量能夠評估肺水腫程度。因此,肺系數(shù)、肺組織W/D比和肺組織含水常用來表征感染性休克大鼠的肺功能[11]。我們的結果顯示,LPS刺激后大鼠的肺系數(shù)、肺組織W/D比和肺組織含水量均顯著升高;相反,經Ani HBr處理后,受損大鼠的肺系數(shù)、肺組織W/D比和肺組織含水量均顯著降低,結果具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。因此,Ani HBr能夠減輕受損大鼠的肺組織損傷,提高肺血管通透性和減少肺水腫,對LPS誘導的感染性休克大鼠肺損傷具有積極的保護作用。研究表明,Ani HBr 能夠介導細胞凋亡,從而發(fā)揮著保護細胞的作用[12]。因此,在本研究中我們通過Western blot實驗檢測了凋亡相關蛋白的表達水平,如抗凋亡蛋白Bcl2和凋亡蛋白Bax和Caspase 3。結果顯示,經Ani HBr處理后凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達明顯下調,而抗凋亡蛋白Bcl-2的含量顯著上調,這表明Ani HBr在LPS誘導的肺損傷大鼠中具有抑制凋亡通路的作用,即Ani HBr能夠減少LPS誘導的細胞凋亡。

既往研究表明,炎性是ALI的重要發(fā)病機制[12,13]。白細胞,特別是中性粒細胞在肺間質和肺泡腔的浸潤和積聚是ALI最重要的病理標志之一[14]。雖然中性粒細胞從循環(huán)中快速、適量地流入肺部對于清除肺泡腔內的微生物病原體和其他有害物質至關重要,但中性粒細胞的過度聚集可能會釋放毒性介質,如促炎細胞因子,它們是啟動炎性級聯(lián)反應、誘導炎性細胞浸潤和加速病理變化的重要原因[15]。HE染色顯示,與Sham組比較,LPS組的肺泡腔及間隔內出現(xiàn)大量中性粒細胞浸潤。然而,與LPS組比較,經Ani HBr處理后受損大鼠的肺泡結構完整性得到明顯改善,炎性細胞浸潤減少。另外,我們通過ELISA法檢測了受損大鼠BALF中相關促炎因子(IL-1β、IL-6 和 TNF-α)的表達水平。結果顯示,與Sham組比較,LPS處理能夠導致受損大鼠BALF中IL-1β、IL-6 和 TNF-α表達顯著增加,而經過Ani HBr干預后LPS誘導的IL-1β、IL-6 和 TNF-α的表達顯著降低。以上結果說明,Ani HBr通過介導一系列的炎性級聯(lián)反應,減輕LPS誘導的炎性反應。值得注意的是,炎性小體核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)在膿毒癥誘導的肺損傷中發(fā)揮著重要作用,抑制NLRP3激活對膿毒癥所致的ALI具有積極的治療效果[16]。另外,核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)是介導炎性和免疫反應的關鍵核轉錄因子,其中p65是NF-κB異源二聚體的一個重要亞基。研究顯示,在革蘭陰性桿菌誘導的膿毒癥中,LPS能夠促進NF-κB p65的活化,進而上調NLRP3,從而發(fā)揮保護細胞的作用[17]。因此,我們通過Western blot實驗檢測了NF-κB p65和NLRP3的蛋白表達。結果顯示,LPS能夠激活NF-κB/NLRP3 通路,而經Ani HBr處理后明顯降低NF-κB和NLRP3蛋白的表達。以上結果表明,Ani HBr通過抑制NF-κB/NLRP3通路介導的炎性反應可能是發(fā)揮肺保護作用的關鍵機制之一,進一步解釋了其治療ALI的潛力。

總之,本研究證實了Ani HBr能夠明顯降低肺系數(shù)、肺組織濕/干重比以及肺組織含水量;維持受損大鼠肺泡結構的完整性,減少細胞凋亡;同時,降低炎性細胞浸潤,并抑制促炎性細胞因子IL-1β、IL-6 和 TNF-α的表達。本研究表明Ani HBr對感染性休克大鼠急性肺損傷具明顯的保護作用,可能與抑制炎性反應相關,其機制或許與NF-κB/NLRP3信號通路相關。