覃元鋒

【摘要】? 近年來，由支原體引起的泌尿生殖道感染呈上升趨勢(shì)，且耐藥菌株逐年增加。如何快速、簡便、準(zhǔn)確地對(duì)引起泌尿生殖道感染的主要病原體一泌尿生殖道支原體進(jìn)行檢測(cè)，是臨床實(shí)驗(yàn)室工作者的重要研究課題之一。本文對(duì)國內(nèi)泌尿生殖道支原體的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法現(xiàn)狀作一綜述，為臨床實(shí)驗(yàn)室選擇適合的泌尿生殖道支原體檢測(cè)方法提供參考，并期待更為簡便、快速和準(zhǔn)確的檢測(cè)方法出現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】? 泌尿生殖道支原體；檢測(cè)方法；現(xiàn)狀；進(jìn)展

中圖分類號(hào)：R446.5? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-1721（2023）13-0123-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.13.038

近年來，由支原體引起的泌尿生殖道感染呈上升趨勢(shì)，且由于國內(nèi)長期以來存在著抗生素不合理應(yīng)用現(xiàn)象，導(dǎo)致耐藥菌株逐年增加[1-2]。因此，如何快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出泌尿生殖道支原體，為臨床提供鑒定及藥敏試驗(yàn)結(jié)果是臨床檢驗(yàn)微生物實(shí)驗(yàn)室工作人員面臨的一個(gè)難題。本文就目前泌尿生殖道支原體的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法綜述如下，為臨床實(shí)驗(yàn)室選擇適合的檢測(cè)方法提供參考。

1? ? 支原體的概念及特點(diǎn)

支原體（mycoplasma）是一群介于細(xì)菌和病毒之間，有獨(dú)立的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但缺乏細(xì)胞壁而呈現(xiàn)出高度多形性的最小的一種原核細(xì)胞型微生物，常見的細(xì)胞形態(tài)為球形、球桿狀或絲狀，個(gè)體極為微小，大小一般低于1.0 μm。其能夠通過濾菌器，是目前所知道的能夠在人工培養(yǎng)基中生長繁殖的最小微生物，因其缺乏細(xì)胞壁的特性，導(dǎo)致針對(duì)細(xì)胞壁合成的青霉素等抗生素?zé)o效[3]。

支原體在自然界廣泛存在，是人體的常居菌群之一，即可以作為正常菌群寄居在人體內(nèi)，也可以引起人類的各種感染。目前已知的支原體共有80余種，但臨床上最常見的致病性支原體是解脲型支原體（ureaplasma uralyticum，Uu）、人型支原體（mycoplasma hominis，Mh）和生殖支原體（mycoplasma genitalium，Mg），三者合稱為泌尿生殖道支原體（MG），約占非淋性尿道炎的20%～30%[4]。自1980年首次從人體內(nèi)分離出泌尿生殖道支原體后，隨著研究和檢測(cè)方法的深入，由泌尿生殖道支原體引起的感染真實(shí)而廣泛地展現(xiàn)在人們面前[5]。

泌尿生殖道支原體不僅可引起男女性非特異性尿道炎、慢性前列腺炎、附睪炎和陰道炎等疾病，也是造成女性不孕不育和流產(chǎn)的重要原因之一[6-9]。據(jù)相關(guān)資料顯示，泌尿生殖道支原體的感染與不潔性行為有關(guān)[10-11]。

2? ? 支原體的直接染色和鏡檢

在較早的臨床檢驗(yàn)中，一般是把臨床送檢的尿道拭子、陰道拭子、宮頸分泌物等標(biāo)本直接進(jìn)行涂片，待涂片晾干后按常規(guī)方式進(jìn)行滅活固定，然后進(jìn)行染色。常用的染色方法一般采用革蘭染色或Giemsa染色，但革蘭染色不易著色，常常導(dǎo)致在鏡下難以清晰地觀察到支原體；Giemsa染色呈現(xiàn)出紫藍(lán)色，在鏡下呈現(xiàn)出各種不規(guī)則的形態(tài)。

由于送檢的標(biāo)本多為非無菌標(biāo)本，混雜著人體組織碎片、人體分泌物和眾多的其他微生物等異物，導(dǎo)致鏡下難以分辨出支原體，從而極大地降低了陽性檢出率，特異性較差，無較大的檢測(cè)意義，因此只可以作為提示作用，現(xiàn)臨床實(shí)驗(yàn)室已很少使用[12]。

隨著技術(shù)的發(fā)展，除了光學(xué)顯微鏡之外，電子顯微鏡、原子力顯微鏡、掃描顯微鏡等技術(shù)的出現(xiàn)極大地提高了分辨率水平。借助這些顯微鏡不僅能夠觀察到支原體的超微結(jié)構(gòu)，并且能夠直接觀察到支原體所致的機(jī)體組織病理改變情況，具有操作簡便、快速、需要標(biāo)本量少、試驗(yàn)耗材成本低等優(yōu)點(diǎn)，但由于這些顯微鏡價(jià)格昂貴，對(duì)操作者的技術(shù)水平要求較高，因此難以在臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行推廣。

3? ? ?分離培養(yǎng)法

3.1? ? 液體培養(yǎng)法? ? 液體培養(yǎng)法是WHO推薦使用的首選檢測(cè)方法[1]，該方法對(duì)日常培養(yǎng)環(huán)境要求不高，操作簡便，能夠同時(shí)獲得鑒定和藥敏試驗(yàn)結(jié)果。其原理是泌尿生殖道支原體在生長過程中產(chǎn)生的尿素酶分解尿素或精氨酸產(chǎn)生堿，使培養(yǎng)基的pH值升高，進(jìn)而導(dǎo)致培養(yǎng)基中酚紅指示劑變?yōu)榧t色來判斷培養(yǎng)結(jié)果。

由于液體培養(yǎng)法方便快速，且具有較高準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，自上世紀(jì)90年代法國梅里埃公司生產(chǎn)出了支原體IST檢測(cè)試劑盒后，國內(nèi)紛紛跟進(jìn)，2000年左右已廣泛應(yīng)用于臨床，可于48 h內(nèi)獲得Uu和Mh的鑒定和藥敏試驗(yàn)結(jié)果[3]，但該試劑盒未支持Mg的鑒定和藥敏試驗(yàn)。值得一提的是：Uu可以形成生物膜，改變細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而提高對(duì)抗生素的耐藥性[13-15]。由于臨床上常用的檢驗(yàn)標(biāo)本為宮頸分泌物或男性尿道分泌物，極易混雜有其他細(xì)菌，因此常常造成假陽性導(dǎo)致培養(yǎng)結(jié)果偏高，這是目前難以解決的問題。

泌尿生殖道支原體由于細(xì)胞壁缺陷，天然耐受所有的β-內(nèi)酰胺類、磺胺類和利福平等抗生素，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素、紅霉素和克林霉素也因菌種的不同而呈現(xiàn)出不同的耐藥性[12]。

3.2? ? 固體培養(yǎng)法? ? 支原體對(duì)營養(yǎng)的要求較高，對(duì)低滲透壓敏感，除與常見細(xì)菌一樣需要基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)之外，還需要加入10%～20%的馬或小牛血清、酵母浸液、青霉素G和pH指示劑等。但馬鳳玲[16]報(bào)道在耐青霉素菌株存在的情況下，耐藥菌株可以無視培養(yǎng)基中青霉素G的抑制而大量繁殖，進(jìn)而導(dǎo)致支原體培養(yǎng)的陽性率降低。

固體培養(yǎng)能夠在培養(yǎng)基上培養(yǎng)出支原體“油煎蛋”樣特征性的菌落，以及其獨(dú)特棕褐色顆粒菌落特征，培養(yǎng)結(jié)果直觀而準(zhǔn)確，因此被視為泌尿生殖道支原體檢測(cè)方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

在上世紀(jì)80年代，Tully等創(chuàng)建了SP-4培養(yǎng)基，首次從男性尿道分泌物中培養(yǎng)分離出生殖道支原體，為臨床實(shí)驗(yàn)室提供了一種實(shí)用的生殖道支原體檢測(cè)方法[17-19]。后來Davies等在SP-4培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一定程度的改良和優(yōu)化，促進(jìn)生殖道支原體的生長，能夠在3 d左右獲得生殖道支原體菌落。由于Uu培養(yǎng)所需的pH值范圍為5.5～6.5，較其他生殖道支原體低，因此配制Uu培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意，以免影響Uu的檢測(cè)陽性率[20]。

4? ? 免疫學(xué)檢測(cè)方法

支原體免疫學(xué)檢測(cè)方法在臨床實(shí)驗(yàn)室中常用的有凝集反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等，雖然試驗(yàn)方法眾多，但本質(zhì)上不是使用抗原檢測(cè)抗體，就是使用抗體檢測(cè)抗原，應(yīng)用最多的檢測(cè)方法是使用抗原檢測(cè)患者體內(nèi)存在的抗體。Taylor-Robinson等報(bào)道應(yīng)用間接MIF檢測(cè)非淋球菌性泌尿生殖道炎是一種具有高度敏感性、特異性，并且簡便易行的檢測(cè)方法[21]。Jensen等使用EIA檢測(cè)男性血液樣本中的MG抗體，但檢測(cè)效果不理想[22]。每一種試驗(yàn)方法均有其特點(diǎn)和不同的針對(duì)性，例如代謝抑制試驗(yàn)適用于Mh和Mg的檢測(cè)，但不適用于對(duì)Uu感染的檢測(cè)[2，23-24]。

由于人體正常寄居著口腔支原體、咽支原體等眾多的支原體，導(dǎo)致人體內(nèi)存在著不同強(qiáng)度的支原體抗體，而這些支原體抗體與Uu感染產(chǎn)生的抗體在目前科學(xué)技術(shù)下難以區(qū)分，且檢測(cè)的抗體均為定性檢測(cè)，未能進(jìn)行定量檢測(cè)，從而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果缺乏特異性，在臨床上只存在指導(dǎo)性意義，無確診意義，有誤導(dǎo)臨床的可能[25]。

雖然免疫學(xué)檢測(cè)方法具有操作簡便、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但至今沒有適合的血清學(xué)檢驗(yàn)方法能夠達(dá)到確診的效果。

5? ? 分子生物學(xué)方法

5.1? ? DNA探針技術(shù)? ? DNA探針技術(shù)是通過直接檢測(cè)病原體的特異性DNA從而判斷出病原體的存在與否。1988年人們使用該技術(shù)檢測(cè)男性患者尿道中的生殖道支原體獲得良好的效果，由于該技術(shù)具備省時(shí)、省力、有較高的敏感性和特異性，能夠解決免疫學(xué)檢測(cè)方法上難以區(qū)分交叉抗體的問題等優(yōu)點(diǎn)，使其迅速地在世界范圍內(nèi)推廣使用，也逐漸成為臨床實(shí)驗(yàn)室的重要檢測(cè)手段之一[18]。

5.2? ? 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）由Mullis于1983年發(fā)明，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室。其工作原理類似于DNA的天然復(fù)制，通過對(duì)處理過的標(biāo)本進(jìn)行變性—退火—延伸等擴(kuò)增，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)將靶核酸擴(kuò)增放大幾百萬倍，進(jìn)而檢測(cè)出特定的檢測(cè)目標(biāo)。

PCR檢測(cè)技術(shù)是目前臨床上公認(rèn)的檢測(cè)支原體的最佳方法，靈敏度和特異性均較高，而且具有快速、簡便等特點(diǎn)[12，26]，但對(duì)標(biāo)本的要求較高，容易受到污染的影響導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽性，這是目前需要解決的難題之一。歐洲[27]和英國[28]推薦男性采用首段尿液進(jìn)行檢測(cè)，與我國臨床實(shí)驗(yàn)室常用的男性尿道拭子不同，兩種標(biāo)本的準(zhǔn)確性和特異性對(duì)比目前國內(nèi)報(bào)道還是不多。英國[29]推薦女性標(biāo)本采用陰道拭子，但國內(nèi)使用宮頸拭子居多。

基于PCR技術(shù)發(fā)展起來的FQ-PCR、SAT、LAMP和RDB等檢測(cè)技術(shù)，除了具備原PCR技術(shù)的特點(diǎn)之外，還具有一定的創(chuàng)新性，也逐漸成為實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的重要技術(shù)[12]。尤為值得一提的是LAMP，該技術(shù)是采用基因擴(kuò)增與免疫層析技術(shù)相結(jié)合建立起來的一種Uu檢測(cè)方法，除具備PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)還不需要昂貴的特殊儀器，且試劑價(jià)格更為低廉，適用于廣大基層醫(yī)院開展[1]。

6? ? 質(zhì)譜儀檢測(cè)技術(shù)

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF MS）是近年發(fā)展起來的一種檢測(cè)方法，可以對(duì)培養(yǎng)出來的菌落進(jìn)行快速鑒定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，操作簡便，成本較低，雖然目前在檢測(cè)支原體耐藥性方面對(duì)藥物檢測(cè)的種類有限，但隨著技術(shù)的發(fā)展和質(zhì)譜儀的普及，其必然成為臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)泌尿生殖道支原體的常用方法[29]。

由泌尿生殖道支原體引起的感染在臨床表現(xiàn)上缺乏特異性，因此其診斷依賴于臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果。目前國內(nèi)檢測(cè)泌尿生殖道支原體的試驗(yàn)方法眾多，但培養(yǎng)法是公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)，而由于培養(yǎng)的困難性，臨床上應(yīng)用最多的還是商品化的支原體鑒定、藥敏試劑盒。在已經(jīng)建立了PCR實(shí)驗(yàn)室的醫(yī)院基本上都開展了泌尿生殖道支原體檢測(cè)，但每種檢驗(yàn)方法均存在著一定的不足，期待更為快速、簡便和準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法出現(xiàn)。

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（收稿日期：2023-02-23）