毛鐳篥,張麗,李薇,黃媛,王斐,吳衛(wèi)(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京100730)

細(xì)胞因子(cytokine)是由免疫細(xì)胞(如單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等)或某些非免疫細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞等)經(jīng)刺激而合成、分泌的一類(lèi)具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì),能結(jié)合相應(yīng)受體,調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化,參與機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)[1]。細(xì)胞因子分為白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子等六大家族。大量研究表明細(xì)胞因子與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),已在國(guó)內(nèi)被納入眾多指南與共識(shí)中,如《感染相關(guān)生物標(biāo)志物臨床意義解讀專(zhuān)家共識(shí)》、《中國(guó)急性胰腺炎診治指南》、《中國(guó)急診感染性休克臨床實(shí)踐指南》、《中國(guó)膿毒癥早期預(yù)防與阻斷急診專(zhuān)家共識(shí)》、《淋巴瘤相關(guān)噬血細(xì)胞綜合征診治中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)》[2-6]。標(biāo)本的采集方法、抗凝劑的選擇、貯存條件以及其他分析前處理均會(huì)影響細(xì)胞因子的準(zhǔn)確測(cè)定[7],目前,尚無(wú)關(guān)于細(xì)胞因子檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化指南或共識(shí)。本研究主要觀察不同保存溫度及時(shí)間下血清標(biāo)本中細(xì)胞因子,如白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、白介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的穩(wěn)定性,旨在探討血清樣本細(xì)胞因子準(zhǔn)確測(cè)量的可靠條件。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 隨機(jī)選取北京協(xié)和醫(yī)院2022年3月至10月就診的120例患者作為研究對(duì)象,其中男性58 例,女性62例,年齡22～88歲,平均年齡56歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)標(biāo)本自采集至即刻上機(jī)測(cè)定,時(shí)長(zhǎng)在1 h以內(nèi);(2)有低、中、高不同濃度范圍的標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn):乳糜血及溶血標(biāo)本。

1.2儀器與試劑 IMMULITE1000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α檢測(cè)試劑、定標(biāo)液和質(zhì)控品(德國(guó)SIEMENS公司);3.5 mL規(guī)格含分離膠血清管(VACUTTE公司);1.5 mL規(guī)格EP管(XYGEN公司)。

1.3方法 120例研究對(duì)象靜脈血標(biāo)本在1 500×g下離心10 min。離心后根據(jù)保存條件分為5組,包括:(1)室溫原管組40例,標(biāo)本在室溫原管條件下保存,不分裝;(2)室溫分裝組20例,將血清分裝至EP管,在室溫條件下保存;(3)4 ℃原管組20例,樣本置于4 ℃條件下保存,不分裝; (4)4 ℃分裝組20例,將血清分裝至EP管,在4 ℃條件下保存;(5)-20 ℃組20例,將血清分裝至EP管,在-20 ℃條件下保存。第(1)組中的20例標(biāo)本和(2)(3)(4)組分別測(cè)定即刻、6 h、24 h的IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α結(jié)果;第(1)組中的另外20例標(biāo)本用于分析IL-8的穩(wěn)定性,分別測(cè)定即刻、2 h、3 h、4 h、5 h的IL-8結(jié)果;第(5)組-20 ℃組測(cè)定即刻及-20 ℃冷凍6月后的IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α結(jié)果。即刻是指樣本自采集、接收、離心至上機(jī),整個(gè)時(shí)長(zhǎng)控制在1 h左右,也是穩(wěn)定性研究的起始點(diǎn)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。 IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α的檢測(cè)結(jié)果呈非正態(tài)分布,用M(P25,P75)描述,組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,用GraphPad Prism 5.0軟件作圖。根據(jù)SIEMENS廠家說(shuō)明書(shū), IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α參考區(qū)間上限分別為5.9 pg/mL、62 pg/mL、9.1 pg/mL、8.1 pg/mL,檢測(cè)范圍分別為2.0～1 000 pg/mL、2.0～7 500 pg/mL、1.0～1 000 pg/mL、1.7～1 000 pg/mL。穩(wěn)定性比對(duì)判斷標(biāo)準(zhǔn):(1)廠家推薦的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏差在±15%以內(nèi)。(2)根據(jù)CNAS-CL02《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在臨床化學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》,應(yīng)有≥80%的結(jié)果符合要求?？傊?每組結(jié)果的相對(duì)偏差±15%的標(biāo)本數(shù)需≥16個(gè),且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表示比對(duì)通過(guò)。

2 結(jié)果

2.1室溫原管組IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α結(jié)果 室溫原管組中IL-6、IL-10、TNF-α在6 h結(jié)果與即刻相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),比對(duì)通過(guò)率分別為80%、95%、80%,均≥80%; 24 h結(jié)果與即刻相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),比對(duì)通過(guò)率分別為70%、85%、80%,IL-6在24 h的穩(wěn)定性比對(duì)不通過(guò)。IL-8在6 h、24 h的檢測(cè)結(jié)果與即刻相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 6 h和24 h比對(duì)通過(guò)率僅為5%、0,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 室溫原管組中細(xì)胞因子在各時(shí)間點(diǎn)結(jié)果的比較

在即刻結(jié)果中,IL-8有5例陽(yáng)性樣本,陽(yáng)性率為25%; 6 h有17例陽(yáng)性標(biāo)本,陽(yáng)性率為85%,假陽(yáng)性率為60%,升高倍數(shù)最高可達(dá)28.8倍;24 h有19例陽(yáng)性樣本,陽(yáng)性率為95%,假陽(yáng)性率為70%,升高的倍數(shù)最高可達(dá)496.8倍。隨放置時(shí)間延長(zhǎng),IL-8明顯升高,假陽(yáng)性率也不斷增加,結(jié)果見(jiàn)表2和圖1。將IL-8在6 h、24 h升高的倍數(shù)與單核細(xì)胞數(shù)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析,結(jié)果r分別為0.313、0.365,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而IL-6、IL-10、TNF-α在6 h、24 h的陽(yáng)性率與即刻結(jié)果一致,陽(yáng)性率并未增加。

圖1 IL-8在6 h和24 h檢測(cè)值與即刻相比變化的倍數(shù)

表2 室溫原管組中IL-8在各時(shí)間點(diǎn)結(jié)果的比較

2.2室溫原管中 IL-8穩(wěn)定性分析 20例血清樣本在室溫放置2 h、3 h、4 h、5 h后,其IL-8結(jié)果與即刻相比,P值分別為0.820、0.461、0.076、0.003,僅放置5 h的結(jié)果與即刻相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其余各組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。比對(duì)通過(guò)率分別為80%、35%、15%、10%;僅2 h的比對(duì)通過(guò)。室溫原管組中IL-8在即刻、2 h、3 h、4 h、5 h的結(jié)果,其陽(yáng)性率分別為15%、20%、25%、35%、45%,隨放置時(shí)間延長(zhǎng),其陽(yáng)性率也在不斷增加,結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3室溫分裝組結(jié)果 室溫分裝組中,IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α在6 h的檢測(cè)結(jié)果與即刻相比,比對(duì)通過(guò)率分別為95%、65%、100%、90%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);24 h的檢測(cè)結(jié)果與即刻相比,比對(duì)通過(guò)率分別為90%、50%、95%、95%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。IL-8在6 h、24 h的比對(duì)通過(guò)率均<80%,比對(duì)不通過(guò),結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 室溫分裝組中細(xì)胞因子在各時(shí)間點(diǎn)結(jié)果的比較(pg/mL)

2.44 ℃原管組結(jié)果 4 ℃原管組中,IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α在6 h的檢測(cè)結(jié)果與即刻相比,比對(duì)通過(guò)率分別為85%、90%、90%、90%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。24 h的檢測(cè)結(jié)果與即刻相比,比對(duì)通過(guò)率分別為80%、55%、90%、95%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。IL-8放置24 h后比對(duì)不通過(guò),其余各組比對(duì)通過(guò)率均≥80%。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 4 ℃原管組中細(xì)胞因子在各時(shí)間點(diǎn)結(jié)果的比較(pg/mL)

2.54 ℃分裝組結(jié)果 4 ℃組中, IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α在6 h的檢測(cè)結(jié)果與即刻相比,比對(duì)通過(guò)率分別為90%、100%、95%、95%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。24 h結(jié)果與即刻相比,比對(duì)通過(guò)率分別為85%、95%、100%、85%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各結(jié)果比對(duì)通過(guò)率均≥80%,見(jiàn)表6。

表6 4 ℃分裝組中細(xì)胞因子在各時(shí)間點(diǎn)結(jié)果的比較

2.6-20 ℃分裝組結(jié)果 -20 ℃分裝組中, IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α放置6個(gè)月后其結(jié)果與即刻相比,P>0.05,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,比對(duì)通過(guò)率均≥80%。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 -20 ℃分裝組中細(xì)胞因子在各時(shí)間點(diǎn)結(jié)果的比較

3 討論

細(xì)胞因子是免疫系統(tǒng)最活躍的分子標(biāo)志,可以幫助臨床預(yù)測(cè)膿毒癥[8]、輔助診斷噬血細(xì)胞綜合征[9]、鑒別革蘭氏陰陽(yáng)性細(xì)菌感染譜[10]以及早期診斷原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)性淋巴瘤[11-12]等疾病。另外細(xì)胞因子可作為新冠肺炎的風(fēng)向標(biāo),特別是IL-6是引發(fā)新冠肺炎細(xì)胞因子風(fēng)暴的關(guān)鍵因子,是引起急性呼吸窘迫綜合和多臟器衰竭的重要原因[13]。早在《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》提到:“重型、危重癥患者常有炎癥因子升高”,建議有條件的進(jìn)行細(xì)胞因子的檢測(cè)[14]。延續(xù)至最新的《新型冠狀病毒感染診療方案(第十版)》中建議對(duì)于重型、危重型且實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)IL-6水平升高者可使用IL-6抑制劑[15]。

細(xì)胞因子檢測(cè)的標(biāo)本類(lèi)型多樣,包括血清、血漿、腦脊液、尿液、肺泡灌洗液、胸腹水、腹透液等,如何對(duì)不同類(lèi)型的標(biāo)本進(jìn)行規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)化的前處理,以保證檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性,非常值得摸索及探討[7]。鑒于尚未出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的分析規(guī)程,本實(shí)驗(yàn)分析了不同溫度不同保存時(shí)間對(duì)血清管IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α測(cè)定結(jié)果的影響。

IL-8作為促炎因子,由巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞分泌,可吸引中性粒細(xì)胞,而中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的釋放又能誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞IL-8基因的表達(dá),形成惡性循環(huán),在慢性阻塞性肺炎及哮喘中有重要的臨床意義[16]。在本實(shí)驗(yàn)中,IL-8在原管室溫條件下放置時(shí),其假陽(yáng)性率會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,放置6 h和24 h時(shí),假陽(yáng)性率分別為45%、55%,與既往文獻(xiàn)相似[7],可能因?yàn)椴捎醚骞軙r(shí),血液凝固過(guò)程中的凝血酶誘導(dǎo)了Rho/JNK級(jí)聯(lián)(Rho是凝血酶信號(hào)通路的關(guān)鍵中介,JNK的激活依賴于Rho的刺激),這種級(jí)聯(lián)可導(dǎo)致IL-8的轉(zhuǎn)錄和激活,刺激單核細(xì)胞表達(dá)IL-8[17],亦有研究表明,單核細(xì)胞要產(chǎn)生和釋放更高水平的IL-8,需要血小板的增強(qiáng)作用[18],因此單核細(xì)胞的數(shù)量并非是導(dǎo)致IL-8升高的唯一因素。本實(shí)驗(yàn)中IL-8隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高的倍數(shù)雖然與單核細(xì)胞的數(shù)量無(wú)關(guān),但在肺泡灌洗液中IL-8的升高與肺泡中的單核-巨噬細(xì)胞的數(shù)量有關(guān),可能與單核細(xì)胞不同成熟階段有關(guān)[7]。需要注意的是,雖然使用了含分離膠的血清管,但顯然并不能阻止單核細(xì)胞持續(xù)分泌IL-8至血清中。在IL-8的穩(wěn)定性分析實(shí)驗(yàn)中,雖然室溫放置2 h、3 h、4 h的結(jié)果與即刻相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但3 h和4 h的穩(wěn)定性比對(duì)通過(guò)率<80%,不能滿足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量要求,而2 h的比對(duì)通過(guò)率為80%,結(jié)合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際日常工作,IL-8室溫放置2 h是可接受的,這點(diǎn)在廠家說(shuō)明書(shū)中也有體現(xiàn)。IL-6、IL-10、TNF-α在本實(shí)驗(yàn)中的分析結(jié)果較穩(wěn)定,因此若聯(lián)合檢測(cè)多項(xiàng)細(xì)胞因子時(shí),由于IL-8的不穩(wěn)定性,室溫條件下建議2 h內(nèi)上機(jī)測(cè)定。關(guān)于24 h內(nèi)的穩(wěn)定性,只有4 ℃分裝組的所有CK結(jié)果的比對(duì)通過(guò)率均≥80%,故建議2～24 h可采取4 ℃分裝保存。在-20 ℃分裝時(shí),CK保存6個(gè)月復(fù)融檢測(cè)時(shí),結(jié)果依舊穩(wěn)定,本實(shí)驗(yàn)IL-8在-20 ℃分裝凍存后,中位數(shù)結(jié)果從26.1 pg/mL升高為36.2 pg/mL,可能與在室溫復(fù)融時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有關(guān)。因此建議復(fù)融后及時(shí)檢測(cè)。有文獻(xiàn)報(bào)道[19], IL-6、IL-10、TNF-α在-20 ℃反復(fù)凍融結(jié)果穩(wěn)定,但I(xiàn)L-8在-20 ℃有限次凍融穩(wěn)定,建議避免多次凍融。本實(shí)驗(yàn)雖未分析延遲離心對(duì)細(xì)胞因子的影響,但研究證實(shí)血清樣本在室溫放置24 h后再離心檢測(cè),IL-6及IL-8明顯增高,因此有必要減少離心前時(shí)間[20]。

采用血清樣本聯(lián)合檢測(cè)多項(xiàng)細(xì)胞因子IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α?xí)r,標(biāo)本自采集至上機(jī),時(shí)間控制在2 h內(nèi),可采取室溫原管放置;2～24 h內(nèi)推薦4 ℃分裝;-20 ℃時(shí)6個(gè)月內(nèi)細(xì)胞因子結(jié)果穩(wěn)定可靠。日常工作中,采用血清樣本測(cè)定細(xì)胞因子時(shí),如果不能滿足2 h內(nèi)及時(shí)上機(jī),為避免IL-8的假陽(yáng)性,建議分裝凍存。各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際情況選擇不同保存方式。