凌學(xué)民，黃建，駱慧芳，鄧玲娜，周偉新

（深圳市龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院 1.婦科；2.病理科，廣東 深圳 518000 ）

子宮內(nèi)膜異位癥是一種典型的婦科疾病，其經(jīng)典定義是異位部位存在子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)，主要是盆腔腹膜、卵巢和直腸陰道隔。它的癥狀包括痛經(jīng)、性交困難、慢性骨盆疼痛、不規(guī)則子宮出血和/或不孕，對(duì)生殖和一般健康造成嚴(yán)重影響。這種疾病應(yīng)被視為一個(gè)公共衛(wèi)生問題，對(duì)婦女的生活質(zhì)量有重大影響，同時(shí)也是一個(gè)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。子宮內(nèi)膜異位癥影響肝臟和脂肪組織的新陳代謝，導(dǎo)致全身炎癥，從而導(dǎo)致粘連、疤痕、內(nèi)出血、腸道或泌尿功能障礙，并改變大腦中的基因表達(dá)，進(jìn)而使患者出現(xiàn)疼痛敏感和情緒障礙［1］。該疾病的全部影響尚未得到充分認(rèn)識(shí)，而且遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了骨盆［2］。了解其發(fā)病機(jī)制對(duì)于正確診斷和做出最有效的判斷和治療至關(guān)重要。盡管有許多有關(guān)這種病理的數(shù)據(jù)，關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥起源的統(tǒng)一機(jī)理仍然令人費(fèi)解。眾所周知，子宮內(nèi)膜異位組織的發(fā)育和發(fā)展與雌激素關(guān)系密切。雌激素通過激活c-myc 和cyclin D1 等來參與細(xì)胞增殖。c-myc 作為一種原癌基因，可以通過激活細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，具有深刻的促有絲分裂作用。它既可以激活或抑制基因表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞增殖。有研究指出，患有子宮內(nèi)膜異位癥的組織中檢測(cè)到c-myc 表達(dá)有較大程度的增多［3］。不少研究指出，該病的形成可能與細(xì)胞的凋亡和增殖發(fā)生差錯(cuò)相關(guān)，其中凋亡抑制蛋白（IAPs）發(fā)揮了十分關(guān)鍵的作用，Livin 作為其中重要的一員被認(rèn)為在抑制凋亡引起的細(xì)胞死亡以及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期中發(fā)揮作用，在癌癥形成和/或進(jìn)展過程中，有時(shí)會(huì)檢測(cè)到異常的Livin 表達(dá)，據(jù)報(bào)道，Livin 在幾種癌癥類型中過表達(dá)，其中與惡性腫瘤和化療耐藥性相關(guān)，如腎上腺皮質(zhì)腫瘤、前列腺癌、甲狀腺乳頭狀癌等［4］。本實(shí)驗(yàn)主要為探究Livin 和c-myc 在子宮內(nèi)膜異位癥形成過程中的變化，為臨床上該疾病的醫(yī)治、預(yù)測(cè)預(yù)后和靶向基因治療尋找新的生物學(xué)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采集2015 年1 月至2017 年12 月于深圳市龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院婦科就診的72 名患者，將行開腹或接受腹腔鏡手術(shù)后經(jīng)病理學(xué)分析確診為子宮內(nèi)膜異位癥的婦女為實(shí)驗(yàn)組（n=36），將子宮內(nèi)膜正常的不育癥患者選作對(duì)照組（n=36）。實(shí)驗(yàn)組年齡25～40 歲，平均（32.6±5.9）歲；對(duì)照組年齡25～43 歲，平均（30.2±6.3）歲。兩組體重指數(shù)（BMI）均為正常水平（≤25 kg/m2）。所有參與者均承諾配合研究并簽署知情協(xié)議。

實(shí)驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)：①都為絕經(jīng)前婦女，經(jīng)過病理學(xué)分析進(jìn)一步確認(rèn)為子宮內(nèi)膜異位癥；②在手術(shù)前3 個(gè)月內(nèi)均未服用任何甾體激素類藥物，至少3 個(gè)月沒有服用避孕藥；③患者未妊娠及哺乳，無全身疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①婦科感染，全身炎癥或自身免疫性疾病，以及用免疫抑制藥物持續(xù)治療；②患者存在內(nèi)分泌失調(diào)相關(guān)疾病，或有腫瘤病史。

1.2 方法

采用免疫組化染色（SP 法）：Pipelle 抽吸刮匙從子宮體獲得子宮內(nèi)膜樣本，并用冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌幾次以去除血液。同時(shí)，將子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜異位病變組織固定在10%的甲醛溶液中，然后嵌入石蠟中進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。具體為將子宮內(nèi)膜標(biāo)本進(jìn)行5 μm 厚連續(xù)切片，并置于恒溫箱內(nèi)，將溫度設(shè)置為60℃并烘烤20 min，然后取出浸泡于二甲苯中20 min，然后使用無水酒精進(jìn)行水化，并逐級(jí)降酒精濃度，每個(gè)濃度中各水化3～5 min，然后使用PBS 緩沖液洗滌標(biāo)本3 次，共持續(xù)15 min，將其放置于濃度為0.01 mol/L 的枸櫞酸緩沖溶液內(nèi)并升溫煮沸20 min，撈出讓其自然冷卻至室溫并放置至少20 min 以完成抗原修復(fù)過程。使用PBS 緩沖液清洗標(biāo)本3次，使用經(jīng)PBS 稀釋的正常羊血清在室溫下封閉10～15 min，加入稀釋到適當(dāng)濃度的一抗置于4℃冰箱過夜，用PBS 洗滌三次后加入經(jīng)1% FBS/PBS稀釋到適當(dāng)濃度的二抗，使其室溫放置1 h，PBS緩沖液洗滌3 次后加入酶溶液，然后于37℃放置0.5 h，經(jīng)PBS 清洗后加顯色劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，待染色充分后用自來水終止顯色，封片后進(jìn)行鏡檢。

1.3 結(jié)果判定

將處理后樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)評(píng)估，通過鏡檢確定每個(gè)樣本中的陽性染色細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。在所有情況下，觀察者對(duì)每個(gè)樣本的一個(gè)切片中的1 000 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了評(píng)估。當(dāng)＜5% 的細(xì)胞呈陽性時(shí)，染色被視為陰性，以“-”表示。5%～25%（包括25%）為弱陽性，以“+”表示，25%～50%（包含50%）為中等強(qiáng)度陽性，以“++”表示，＞50%為強(qiáng)陽性，以“+++”表示，比較兩組參與者子宮內(nèi)膜Livin 和c-myc 的表達(dá)差異，同時(shí)觀察子宮內(nèi)膜異位癥組織中Livin 與c-myc 表達(dá)水平之間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Livin 和c-myc 在子宮內(nèi)膜異位癥患者和健康人中的表達(dá)差異行χ2檢驗(yàn)，子宮內(nèi)膜異位癥中Livin 和Pc-myc 表達(dá)的相互關(guān)系通過Spearman 秩相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Livin 在兩組子宮內(nèi)膜中的表達(dá)差異比較

通過鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Livin 在實(shí)驗(yàn)組的陽性表達(dá)率為80.6%，明顯高于對(duì)照組（22.2%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=24.519,P＜0.001），見表1。

表1 Livin 在兩組子宮內(nèi)膜中的表達(dá)差異比較（n=36）

2.2 c-myc 在兩組子宮內(nèi)膜中的表達(dá)差異比較

通過鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Livin 在實(shí)驗(yàn)組的陽性表達(dá)率為52.8%，明顯超過對(duì)照組（0.0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=22.255,P＜0.001），見表2。

表2 c-myc 在兩組子宮內(nèi)膜中的表達(dá)差異比較（n=36）

2.3 子宮內(nèi)膜異位癥中Livin 與c-myc 表達(dá)水平之間的關(guān)系

通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，子宮內(nèi)膜異位癥中Livin 和c-myc 的表達(dá)水平之間具有顯著正相關(guān)性（r=0.403,P=0.015），見表3。

表3 子宮內(nèi)膜異位癥組織中Livin、c-myc 表達(dá)的相關(guān)性（例）

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是一種和盆腔疼痛和不孕有關(guān)的疾病，幾乎只發(fā)生在生殖年齡，目前臨床醫(yī)生和研究者對(duì)其病因和生理學(xué)了解甚少。盡管它普遍存在，但診斷通常會(huì)延遲數(shù)年，誤診很常見，有效治療的時(shí)間也會(huì)延長(zhǎng)。子宮內(nèi)膜異位癥診斷不足，從癥狀發(fā)作到最終診斷的平均潛伏期為6.7年，部分原因是需要手術(shù)診斷［5］。該疾病能使人衰弱，針對(duì)個(gè)體來說，會(huì)給其生活帶來許多問題。準(zhǔn)確的臨床診斷能幫助醫(yī)生對(duì)該病做出正確的識(shí)別和給予及時(shí)的幫助。與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的重大個(gè)人和公共健康問題強(qiáng)調(diào)了了解其發(fā)病機(jī)制和病理生理學(xué)對(duì)預(yù)防和開發(fā)敏感的非手術(shù)診斷分析和有效治療的重要性。目前該病的相關(guān)機(jī)理并未明確，但關(guān)于月經(jīng)逆行、間皮或腹膜化生以及存活子宮內(nèi)膜細(xì)胞植入的理論已被廣泛接受。最近的報(bào)告指出，子宮內(nèi)膜異位癥患者在位子宮內(nèi)膜上皮的生存能力異常，可能致使其持續(xù)生長(zhǎng)［3］。目前已有大量的探索發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡同該病的發(fā)病進(jìn)程相關(guān)［6-7］。但關(guān)于其發(fā)病原因及機(jī)理的統(tǒng)一理論仍然令人費(fèi)解。

Livin 是IAPs 家族的重要成員，IAP 是具有抗凋亡能力的蛋白質(zhì)，與細(xì)胞凋亡和增殖關(guān)系密切。Livin 蛋白有兩個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域，為具有鋅結(jié)合環(huán)的BIR 的結(jié)構(gòu)域和RING 結(jié)構(gòu)域。BIR 是球狀結(jié)構(gòu)，是Livin 蛋白的重要組成成分，RING 結(jié)構(gòu)域能夠在其羧基末端協(xié)調(diào)兩個(gè)鋅原子。BIR 結(jié)構(gòu)域是抑制活性所必需的，并與胱天蛋白酶或APAF1 反應(yīng)，APAF1 與細(xì)胞色素C 一起介導(dǎo)胱天蛋白酶9的激活，而鋅結(jié)合環(huán)結(jié)構(gòu)域有時(shí)會(huì)提高抗凋亡活性，但不能單獨(dú)抑制凋亡［4］。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)表明，Livin 蛋白在凋亡過程、催化活性調(diào)節(jié)、酶抑制劑活性、JNK 級(jí)聯(lián)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要功能。此外，Livin 還促進(jìn)凋亡抑制劑拮抗劑的降解［4］。許多研究發(fā)現(xiàn)Livin 可以通過多種途徑來抵抗細(xì)胞凋亡，其表達(dá)水平亦可能與預(yù)后不良有關(guān)［8-9］。LIU 等［10］應(yīng)用免疫組化法研究Livin在不同卵巢子宮內(nèi)膜異位組織中（癌組織，良性腫瘤和普通異位癥組織）的表達(dá)差異。研究表明Livin 在癌組織中的表達(dá)水平較其他兩組明顯增多，表明Livin 表達(dá)水平的上調(diào)與癌變的出現(xiàn)有一定的聯(lián)系。有研究指出［11］，發(fā)生子宮內(nèi)膜異位癥的女性內(nèi)膜組織中的Livin 的表達(dá)水平明顯超過正常內(nèi)膜，當(dāng)它附著于子宮外的細(xì)胞上可以使細(xì)胞異常增殖，導(dǎo)致異位造的出現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，Livin 在子宮內(nèi)膜異位癥患者組織中的陽性表達(dá)率（80.6%）顯著高于正常對(duì)照組（22.2%），表明Livin 的高水平表達(dá)可能與該病的發(fā)生息息相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道［12］實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

病灶粘連、肌動(dòng)蛋白骨架調(diào)節(jié)、MAPK 和TGFβ/SMAD 信號(hào)通路可能是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制的重要分子機(jī)制［13］。子宮內(nèi)膜異位癥的特征是在雌激素的調(diào)節(jié)下異位部位的子宮內(nèi)膜組織生長(zhǎng)，在包括人類乳腺癌細(xì)胞系在內(nèi)的不同細(xì)胞類型中，雌二醇可上調(diào)與細(xì)胞增殖有關(guān)的幾個(gè)基因，如c-myc。它在子宮內(nèi)膜中的作用尚不清楚，一些研究結(jié)果表明，在子宮內(nèi)膜異位癥中，異位內(nèi)膜以雌激素依賴的方式生長(zhǎng)和退化。更重要的是，子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位子宮內(nèi)膜不僅含有雌二醇受體，還含有P450arom，這是一種催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的酶，在該組織中引發(fā)雌激素微環(huán)境，可能通過內(nèi)分泌途徑起作用［3］。c-myc 作為與增殖相關(guān)的雌激素調(diào)節(jié)基因，是目前研究最廣泛的原癌基因之一，它能編碼細(xì)胞生長(zhǎng)和分化所需的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，可使細(xì)胞發(fā)生增殖或者凋亡。c-myc 能調(diào)整細(xì)胞增殖過程，在用有絲分裂原刺激細(xì)胞后，觀察到c-myc 原癌基因表達(dá)的快速增加，并且c-myc 誘導(dǎo)足以將靜止細(xì)胞驅(qū)動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞周期。已經(jīng)證明，c-myc 在子宮中被雌激素上調(diào)，其啟動(dòng)子含有非典型雌激素反應(yīng)順式作用元件［14］。近年來的許多實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，c-myc 基因在腹膜子宮內(nèi)膜中呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)［14］。本研究對(duì)正常子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜異位癥樣本中c-myc 的蛋白分布進(jìn)行免疫組化分析。同種型匹配的抗兔抗體作為陰性對(duì)照，結(jié)果顯示c-myc 在子宮內(nèi)膜異位癥組中呈高度表達(dá)狀態(tài)，與研究結(jié)果［15-16］基本一致。

本研究結(jié)果同時(shí)顯示，Livin 與c-myc 這兩種分子參與了這些女性異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖的調(diào)控，且它們之間存在正相關(guān)聯(lián)系，提示二者之間可能以正反饋調(diào)節(jié)方式共同影響該病的發(fā)生發(fā)展。因此，對(duì)Livin 與c-myc 的聯(lián)合檢測(cè)在未來有機(jī)會(huì)作為子宮內(nèi)膜異位癥診斷的新指標(biāo)，并有希望作為本病預(yù)防和治療的新方向，但還需要進(jìn)行更多的研究來探索這些分子之間復(fù)雜而嚴(yán)格的相互作用。