李隴梅，閆東科，呂平，李雪，王永苓，郭媛

（1.天津職業(yè)大學(xué)，天津 300410；2.杰科(天津)生物醫(yī)藥有限公司，天津 300467；3.天津海友佳音生物科技股份有限公司，天津 300350）

鹵蟲是一種廣泛分布于日曬鹽場鹽池、沿海灘涂和內(nèi)陸鹽湖的小型甲殼類嗜鹽濾食動物。鹵蟲無節(jié)幼體因營養(yǎng)成分含量高且全面、魚蝦蟹幼苗適口性好、游泳速度慢極易被捕獲等優(yōu)點(diǎn)，成為各類水產(chǎn)苗種最佳的活體開口餌料。由于養(yǎng)殖水體中的各期鹵蟲幼體及其成體體長較大不適宜作為水產(chǎn)苗種的開口餌料[1]，而且質(zhì)量不穩(wěn)定、運(yùn)輸貯存和加工費(fèi)用較高，所以各地養(yǎng)殖單位只捕撈鹵蟲滯育卵進(jìn)行生產(chǎn)銷售。而大量的鹵蟲蟲體廢棄在水中，造成了成千上萬噸的鹵蟲蟲體資源浪費(fèi)，增養(yǎng)殖水體也遭到了極大污染。鹵蟲富含淡水魚所需的α-亞麻酸（ALA）、海水魚所需的二十碳五烯酸（EPA），且鹵蟲體內(nèi)二十二碳六烯酸（DHA）含量也非常高。就營養(yǎng)價(jià)值而言，中后期鹵蟲幼體及其成蟲的營養(yǎng)價(jià)值要高于滯育卵孵化出的用于飼養(yǎng)水產(chǎn)苗種的Ⅰ期無節(jié)幼體[2]。因此，開發(fā)利用廢棄鹵蟲蟲體資源已迫在眉睫，創(chuàng)新技術(shù)手段以解決鹵蟲蟲體資源浪費(fèi)的產(chǎn)業(yè)困境已刻不容緩。

目前，多用真空冷凍干燥制備鹵蟲凍干粉，但其中冷凍和干燥兩個(gè)過程均會造成營養(yǎng)成分不同程度的損失，如果對廢棄鹵蟲直接進(jìn)行冷凍干燥，營養(yǎng)物質(zhì)只能保留冷凍干燥前的10%～30%，若將蟲體懸浮于適宜的介質(zhì)中再進(jìn)行冷凍干燥，營養(yǎng)物質(zhì)的保存率可超過70%。因此，選擇合適的凍干保護(hù)劑非常必要[3]。海藻糖和蔗糖，可通過抑制蛋白質(zhì)的展開和提供玻璃基質(zhì)起保護(hù)作用[4]；甘露醇被認(rèn)為是良好的凍干填充劑，應(yīng)用最廣泛；精氨酸可以與蛋白質(zhì)形成大約7 個(gè)氫鍵，因此精氨酸是過去最常用的氨基酸類冷凍干燥保護(hù)劑[5]。

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)研究了海藻糖、甘露醇、蔗糖和精氨酸等4種物質(zhì)對鹵蟲凍干營養(yǎng)物質(zhì)保存率的影響；在此基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)對鹵蟲的凍干保護(hù)劑組分進(jìn)行了優(yōu)化，從而為鹵蟲凍干粉的生產(chǎn)提供了一定的參考依據(jù)[6]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

廢棄鹵蟲，杰科（天津）生物醫(yī)藥有限公司；KH19A 小型高速離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；FD-1D-50 真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；GC-2030 型氣相色譜儀，配備氫火焰離子化檢測器（FID），日本島津公司；970CRT 熒光分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；海藻糖，食品級，西安木果生物科技有限公司；甘露醇，食品級，江蘇華港生物科技有限公司；蔗糖和精氨酸，食品級，伊諾杰康江蘇肽都科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的處理

將保護(hù)劑按比例分別加入到待凍干廢棄鹵蟲溶液中，待保護(hù)劑完全溶解后，放置至無菌托盤內(nèi)備用，每盤100 mL。

1.2.2 凍干處理

將分裝好的樣品放入冷凍干燥機(jī)的預(yù)凍室，使凍干機(jī)的冷阱溫度降至-50 ℃以下。將預(yù)凍好的樣品迅速放入凍干機(jī)的擱板上并蓋上真空罩，開啟真空泵抽真空，使真空度降至1 Pa，并保持12 h；待樣品完全干燥后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

（1）海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。分別設(shè)計(jì)海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、10%、20%、25%，蔗糖、甘露醇、精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%、4%、1%，并補(bǔ)充磷酸緩沖液使添加物總量與鹵蟲等重。（2）蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。分別設(shè)計(jì)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、10%、20%、25%，海藻糖、甘露醇、精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%、4%、1%，并補(bǔ)充磷酸緩沖液使添加物總量與鹵蟲等重。（3）甘露醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)。分別設(shè)計(jì)甘露醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、8%、12%、16%，海藻糖、蔗糖、精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%、5%、1%，并補(bǔ)充磷酸緩沖液使添加物總量與鹵蟲等重。（4）精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。分別設(shè)計(jì)精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，海藻糖、蔗糖、甘露醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%、5%、4%，并補(bǔ)充磷酸緩沖液使添加物總量與鹵蟲等重。

1.3 測定方法

ω-3 多不飽和脂肪酸的測定依據(jù)《DHA、EPA含量測定 氣相色譜法》（GB/T 38095—2019）；維生素C（Vc）含量的測定依據(jù)《飼料添加劑 維生素C（L-抗壞血酸）》（GB/T 7303—2018）。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻糖單因素分析

凍干樣品DHA、EPA 和VC含量如圖1所示。從圖1中可以看出，隨著海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，凍干鹵蟲中的DHA、EPA 和VC 含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當(dāng)海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到20%時(shí)，各指標(biāo)含量達(dá)到峰值：DHA 含量為2.7 g/kg，EPA 含量為1.2 g/kg，VC含量為28.5 mg/kg。

圖1 海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對鹵蟲凍干的影響

2.2 蔗糖單因素分析

凍干樣品DHA、EPA 和VC含量如圖2 所示。從圖2 中可以看出，隨著蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，凍干鹵蟲中的DHA、EPA 和VC含量變化趨勢不一致，當(dāng)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到10%時(shí)，Vc 和EPA 含量達(dá)到最大值，分別為28.1 mg/kg 和1.4 g/kg；當(dāng)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到20%時(shí)，DHA 含量達(dá)到最大值，為2.8 g/kg。

圖2 蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對鹵蟲凍干的影響

2.3 甘露醇單因素分析

凍干樣品DHA、EPA 和VC含量如圖3 所示。從圖3 中可以看出，隨著甘露醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，凍干鹵蟲中的DHA、EPA 和VC含量變化趨勢基本為先升高后降低，當(dāng)甘露醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到8%時(shí)，DHA 含量達(dá)到最大值為3.3 g/kg；當(dāng)甘露醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到12%時(shí)，VC和EPA 含量達(dá)到最大值，分別為24.7 mg/kg和1.2 g/kg。

2.4 精氨酸單因素分析

凍干樣品DHA、EPA 和VC含量如圖4 所示。從圖4 中可以看出，隨著精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，凍干鹵蟲中桿菌的DHA、EPA 和VC 含量變化趨勢為先升高后降低，當(dāng)精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到1.5%時(shí)，EPA 含量達(dá)到最大值，為1.3 g/kg；當(dāng)精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2.0%時(shí)，DHA 和VC含量達(dá)到最大值，分別為3.3 g/kg 和5.4 mg/kg。

圖4 精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對鹵蟲凍干的影響

2.5 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，采用4 因素3 水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、甘露醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）、精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（D）4個(gè)因素進(jìn)行考察，分析篩選出影響較大的因素及最佳凍干保護(hù)劑配方，各種保護(hù)劑水平設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1，其中響應(yīng)值Y為DHA 含量，Y′為EPA 含量，Y′′為維生素C含量。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表1極差R、R′、R′′分析可知，4 種保護(hù)劑對凍干的DHA、EPA、維生素C 含量的影響作用是一致的，其中海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對營養(yǎng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)對營養(yǎng)成分的影響最大。根據(jù)極差分析，含量最高組的最佳組合為A2B2C1D3，因?yàn)檫@個(gè)組合不在已做的9次試驗(yàn)中，所以對A2B2C1D3進(jìn)行了單獨(dú)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)凍干鹵蟲的三種營養(yǎng)成分的保存率為90%以上，均高于表1中的含量，所以最佳組合為A2B2C1D3，即最佳凍干保護(hù)劑配方為20%海藻糖+15%蔗糖+8%甘露醇+2%精氨酸。加入該保護(hù)劑后，鹵蟲中DHA、EPA、VC 的含量分別為4.8 g/kg、2.2 g/kg、38.3 mg/kg。

3 結(jié)論

廢棄鹵蟲的最佳保護(hù)劑配方為20%海藻糖+15%蔗糖+8%甘露醇+2%精氨酸。加入凍干保護(hù)劑后，檢測二十二碳六烯酸（DHA）為4.8 g/kg，二十碳五烯酸（EPA）為2.2 g/kg，維生素C 含量為38.3 mg/kg。