張 第,卓 越,姚豫桐,楊卯竹,黃孝倫,汪 旭

(1.四川省婦幼保健院,四川 成都 610045;2. 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院, 四川 成都 610072)

原發(fā)性肝癌目前已成為我國(guó)第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因,中國(guó)肝癌粗發(fā)病率(crude-incidence-rate)已達(dá)到28.33/10萬[1],嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的生命和健康[2,3]。其病理分型主要分為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、膽管細(xì)胞癌、肝母細(xì)胞癌、混合癌等。其中肝細(xì)胞癌是最為常見的類型,占原發(fā)性肝癌的80%以上。肝細(xì)胞癌的發(fā)生與慢性肝病有直接關(guān)系,至少有>80%的病例合并有乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染,是造成肝癌發(fā)生和進(jìn)展的重要因素[4]。肝癌目前仍以手術(shù)治療為主,肝切除可明顯緩解臨床癥狀,延緩疾病進(jìn)程,延長(zhǎng)患者生存期,術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高達(dá)61.5%,生存率僅為36.9%,即使是小肝癌5年復(fù)發(fā)率也高達(dá)43.5%[5]。因此積極尋找有效的評(píng)估方法,對(duì)HBV相關(guān)性肝癌患者術(shù)后的疾病進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸情況作出預(yù)判,以便盡早制定更加有效的治療方案對(duì)患者進(jìn)行干預(yù),對(duì)提高患者無復(fù)發(fā)生存期和生活質(zhì)量具有非常積極的意義。近年來,基于獲得性免疫功能與各類惡性腫瘤相關(guān)性的研究[6～8],完全跳出以往腫瘤被動(dòng)性治療的框架,著眼于人體自身免疫應(yīng)答反應(yīng),在腫瘤前免疫狀態(tài)評(píng)估、腫瘤的早期診斷、進(jìn)展控制和預(yù)后改善等方面開辟了全新的思維視角。在前期研究中,我們建立了一種基于高通量測(cè)序技術(shù)的TCRβ庫(kù)多樣性指數(shù)TCR D50值,來衡量個(gè)體的獲得性免疫力狀態(tài),并在582名健康供體中獲得了有效性驗(yàn)證[9]。因此我們希望進(jìn)一步通過檢測(cè)TCR多樣性指數(shù)TCR D50,找到簡(jiǎn)便而經(jīng)濟(jì)的預(yù)測(cè)肝癌患者疾病發(fā)展和臨床預(yù)后的有效方法。本研究通過檢測(cè)外周血TCR D50值、CD4、CD8陽(yáng)性T細(xì)胞分布,并與傳統(tǒng)生化指標(biāo)相比較,探討獲得性免疫功能相關(guān)指標(biāo)對(duì)HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌肝切除術(shù)后的預(yù)后轉(zhuǎn)歸預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2020年7月至2021年8月四川省人民醫(yī)院肝膽外科收治的HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者51例,納入標(biāo)準(zhǔn):①結(jié)合影像學(xué)檢查、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)等,均符合肝細(xì)胞癌的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[10];②慢性乙型肝炎病史5年以上,乙肝五項(xiàng)檢測(cè)表面抗原陽(yáng)性;③治療前肝功能Child-Pugh分級(jí)A級(jí),且未接受過任何相關(guān)治療;④簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①其他器官系統(tǒng)惡性腫瘤;②嚴(yán)重心腦的血管疾病、其他感染性疾病及腎功能異常;③有凝血功能障礙或其他血液系統(tǒng)疾病;④消化道活動(dòng)性潰瘍,重度食管胃底靜脈曲張;⑤酒精性或非酒精性脂肪肝、艾滋病或其他病毒性肝炎導(dǎo)致的肝癌。⑥臨床資料不完整。其中男43例,女8例,年齡25～77歲[(53.02±12.95)歲];同時(shí)選取在我院進(jìn)行體檢的健康成人35例為對(duì)照組,其中男20例,女15例,年齡23～73歲[(48.60±15.21)歲]。本研究所有樣品采集均取得受試者知情同意,并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理批準(zhǔn)號(hào):倫審(研)2020年第351號(hào)。

1.2 方法

1.2.1隨訪及分組 隨訪從研究組患者完成首次手術(shù)治療出院開始,對(duì)患者進(jìn)行隨訪,隨訪形式包括電話、門診等,隨訪內(nèi)容包括血清甲胎蛋白檢查、HBV檢測(cè)、血常規(guī)、肝腎功能、影像學(xué)檢查有無腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及生存情況。出院后1月隨訪1次,后每3月隨訪1次,隨訪至患者死亡或完成12個(gè)月為止。將隨訪期間出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡的患者劃為預(yù)后不良組,未出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡的患者劃為預(yù)后良好組。

1.2.2術(shù)前免疫功能檢測(cè) 使用 FACS Caliber流式細(xì)胞儀(碧迪醫(yī)療器械有限公司)于患者入院后(治療前)、體檢人群于體檢時(shí),檢測(cè)血清CD3+淋巴細(xì)胞、CD4+及CD8+的細(xì)胞計(jì)數(shù),并分別計(jì)算CD3、CD4、CD8陽(yáng)性T細(xì)胞百分比和CD4/CD8+比值。使用乙二胺四乙酸(EDTA)作為抗凝血?jiǎng)┑淖享敼懿杉茉囌叩耐庵苎獦?biāo)本,應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基(天津昊陽(yáng)生物制造有限公司)按照說明書進(jìn)行淋巴細(xì)胞分離、RNA純化和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增TCRβ基因,使用Ion 530 Chip Kit(賽默飛世爾科學(xué)公司)在Thermal-Fisher Ion S5系統(tǒng)上進(jìn)行TCRβ可變區(qū)測(cè)序和數(shù)據(jù)分析計(jì)算。同時(shí)采集外周靜脈血進(jìn)行常規(guī)血液成分分析及血清生化指標(biāo)檢測(cè),包括淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(LYMP)、血清白蛋白(ALB)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和總膽紅素(TB)。采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清腫瘤標(biāo)志物AFP水平。

1.2.3TCR多樣性指數(shù)(TCR D50) TCRβ庫(kù)的多樣性指數(shù)用多樣性50 (diversity 50,D50)值來衡量,D50值定義為一個(gè)樣本中優(yōu)勢(shì)TCRβ CDR3克隆類型占總TCRβ序列累計(jì)50%的百分比[9]。定義樣本中總TCRβ序列數(shù)為N,所有唯一的TCRb CDR3氨基酸序列類型數(shù)為c。每個(gè)唯一CDR3序列相關(guān)的功能TCRb序列定義為N1、N2、…、NC,按大小排序?yàn)镹1≥N2≥…≥NC-1≥NC。當(dāng)(N1+N2+……+NH-1)≤0.5×N (N1+N2 +……+NH)≥0.5×N, D50=H/C。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示,比較行χ2檢驗(yàn);計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較行方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。采用Pearson法分析患者外周血TCR多樣性指數(shù)、CD4/CD8+比值及與生化指標(biāo)的相關(guān)性;受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)價(jià)TCR多樣性指數(shù)、CD4/CD8+比值及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)能力。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況所有研究組患者均獲得完整隨訪,沒有失訪者出現(xiàn)。術(shù)后有22例(43.14%)患者出現(xiàn)預(yù)后不良,包括18例復(fù)發(fā)、死亡4例,納入預(yù)后不良組;29例(56.86%)未出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡,納入預(yù)后良好組。

2.2 研究組與對(duì)照組TCR多樣性指數(shù)、CD4/CD8+比值比較研究組TCR多樣性指數(shù)、CD4/CD8+比值均顯著低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見表1。

2.3 對(duì)照組與不同預(yù)后組患者免疫功能指標(biāo)的比較對(duì)照組與不同預(yù)后組患者TCR多樣性指數(shù)、CD4/CD8+比值等比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),預(yù)后不良組TCR D50值、CD4陽(yáng)性T細(xì)胞百分比、CD4/CD8+比值顯著下降,而CD8陽(yáng)性T細(xì)胞百分比顯著上升(P<0.05)。見表2。

表2 對(duì)照組與不同預(yù)后組患者免疫功能指標(biāo)的比較

2.4 對(duì)照組與不同預(yù)后組患者血液生化指標(biāo)水平比較對(duì)照組與肝癌患者的AFP、ALT、AST、ALB、TB及LYMP比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而不同預(yù)后組之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 對(duì)照組與不同預(yù)后組患者血液生化指標(biāo)水平比較

2.5 TCR多樣性指數(shù)、CD4/CD8+比值及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)疾病預(yù)后的預(yù)測(cè)能力TCR多樣性指數(shù)、CD4/CD8+比值、二者聯(lián)合預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的曲線下面積(AUC)分別為0.872、0.832、0.945。敏感度分別為86.20%、96.60%、86.40%;特異度分別為77.30%、59.10%、93.10%。見表4。

表4 TCR多樣性指數(shù)、CD4/CD8+比值及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)疾病預(yù)后的預(yù)測(cè)能力

3 討論

多樣化的TCR組庫(kù)生成是獲得性免疫的基礎(chǔ)[11,12]。經(jīng)上海交通大學(xué)、天津轉(zhuǎn)化基因組學(xué)中心等聯(lián)合發(fā)布的一項(xiàng)研究表明,健康成人的TCR組庫(kù)比患病人群更具有多樣性[13]。與前期研究結(jié)果完全一致,而健康人群的TCR多樣性指數(shù)值還會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而下降[9]。在慢性炎癥背景下,T細(xì)胞的激活最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡,某些TCR克隆可能被完全消除,進(jìn)一步影響TCR的多樣性。在癌癥患者中,由于腫瘤抗原、化療和放療的長(zhǎng)期刺激下,腫瘤特異性T細(xì)胞可能被消除或耗盡,從而導(dǎo)致TCR多樣性進(jìn)一步下降。因此HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者在年齡、慢性炎癥和腫瘤三重因素的影響下,TCR多樣性急劇下降,獲得性免疫功能進(jìn)一步降低,最終造成不良的臨床結(jié)局。這與本研究所觀察到的結(jié)果一致,HBV相關(guān)性肝癌患者TCR多樣性指數(shù)D50較健康人群顯著下降(P<0.05)。這一結(jié)果在不同預(yù)后組患者中更加凸顯,預(yù)后良好組患者的TCR多樣性指數(shù)與健康人群無顯著性差異,而在預(yù)后不良組患者中,該指數(shù)明顯下降,且與健康人群及預(yù)后良好組患者均存在顯著差異(P<0.05),表明獲得性免疫功能狀態(tài)與HBV相關(guān)性肝癌的臨床結(jié)局密切相關(guān)。一項(xiàng)來自64例肺癌患者的研究顯示,與治療前相比,治療后TCR多樣性的增加預(yù)示著更多的臨床獲益[14]。在另一項(xiàng)有關(guān)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的研究中,治療前基線狀態(tài)下外周血中高度多樣性的TCR組庫(kù)與更好的治療效果相關(guān)[7]。與本研究結(jié)果一致。另一方面,CD8+T細(xì)胞又被稱為細(xì)胞毒性T細(xì)胞,是機(jī)體清除HBV感染的主要效應(yīng)細(xì)胞[15]。本研究顯示與健康人群相比,HBV相關(guān)性肝癌患者外周血CD8+T細(xì)胞水平無顯著差異,表明現(xiàn)階段患者與健康人群的細(xì)胞免疫應(yīng)答能力基本相當(dāng),但顯著降低的CD4/CD8+比值,似乎提示了特異性T淋巴細(xì)胞正在被激活和消耗。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn),預(yù)后良好組患者的CD4、CD8陽(yáng)性細(xì)胞百分比及CD4/CD8+比值與健康人群無顯著性差異,但在預(yù)后不良組患者中,CD8+T細(xì)胞比例顯著上升,而CD4+T細(xì)胞比例及CD4/CD8+比值顯著降低(P<0.05),與機(jī)體獲得性免疫功能的進(jìn)一步惡化有關(guān)[16]。

同時(shí),我們選取具有代表性的傳統(tǒng)生化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)與比對(duì),發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,預(yù)后良好和不良組患者的AFP、ALT、AST、ALB、TB及LYMP均存在顯著差異(P<0.05),而不同預(yù)后組之間上述指標(biāo)均無顯著性差異。因此與常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查和腫瘤特異性生物標(biāo)志物相比,患者獲得性免疫功能的相關(guān)指標(biāo)對(duì)判斷疾病進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸具有明顯優(yōu)勢(shì)。這也在一定程度上提示了臨床醫(yī)生,常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果并不能準(zhǔn)確反映腫瘤的嚴(yán)重程度和預(yù)后,關(guān)注獲得性免疫功能狀態(tài),才能從根本上把握疾病的發(fā)生和發(fā)展。

本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示,TCR多樣性指數(shù)預(yù)測(cè)HBV相關(guān)性肝癌患者預(yù)后的AUC為0.872,敏感度86.20%、特異度77.30%,截?cái)嘀禐?.0535,與前期研究中,定義的TCR多樣性指數(shù)臨界值0.05一致[9]。CD4/CD8+比值預(yù)測(cè)患者預(yù)后的AUC為0.832,敏感度96.60%、特異度59.10%,截?cái)嘀禐?.185。顯示了外周血淋巴細(xì)胞分群對(duì)于患者獲得性免疫功能狀態(tài)的監(jiān)測(cè)敏感度更高但缺乏特異性。TCR多樣性指數(shù)、CD4/CD8+比值聯(lián)合預(yù)測(cè)患者預(yù)后的AUC為0.945,敏感度86.40%、特異度93.10%,特異度明顯高于單獨(dú)預(yù)測(cè),表明治療前應(yīng)用TCR多樣性指數(shù)和CD4/CD8+比值聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于HBV相關(guān)性肝癌患者的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值更高,可能作為評(píng)估患者不良預(yù)后的新指標(biāo)。

綜上,TCR多樣性指數(shù)D50值和CD4/CD8+比值在預(yù)后不良的HBV相關(guān)性肝癌患者中均呈現(xiàn)明顯降低,二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值,可作為臨床上評(píng)估肝癌患者肝切除術(shù)后不良預(yù)后的重要指標(biāo),幫助臨床醫(yī)師及時(shí)評(píng)估患者疾病進(jìn)程,及早制定干預(yù)方案,以進(jìn)一步改善患者預(yù)后。