張 杰,劉永昌,劉 浩

(山東省煙臺市煙臺山醫(yī)院,山東 煙臺 264001)

肺癌是全球面臨的重大公共衛(wèi)生問題,具有較高死亡率,患者預(yù)后較差,根據(jù)世界衛(wèi)生組織的預(yù)測,中國2025年肺癌死亡人數(shù)將達(dá)到100萬[1]。肺癌中,有八成及以上為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。研究發(fā)現(xiàn)[2],NSCLC發(fā)生、發(fā)展機(jī)制涉及多種基因改變。轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis-associated gene 1, MTA1)通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)控一系列與浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白,參與多種惡性腫瘤的發(fā)展及侵襲過程[3]。切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(ERCC1)具有核苷酸切除修復(fù)功能,參與脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)損傷識別及DNA鏈切割過程,惡性腫瘤增殖引起DNA損傷,ERCC1表達(dá)隨之升高[4]。細(xì)胞角蛋白19片段21-1(cytokeratin 19 fragments antigen 21-1, CYFRA21-1)作為細(xì)胞骨架成分,參與腫瘤細(xì)胞異常分裂過程,在正常組織或良性腫瘤組織中幾乎不表達(dá),但在上皮組織來源的惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)顯著升高[5]。本研究分析CYFRA21-1、MTA1、ERCC1檢測在肺癌患者術(shù)前分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的評估價(jià)值,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2019年1月至2021年12月我院96例NSCLC患者臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn):①行擇期胸腔鏡肺癌根治術(shù),經(jīng)病理檢查確診;②符合美國國家癌癥網(wǎng)絡(luò)2018年發(fā)布的第5版臨床實(shí)踐指南NSCLC診療標(biāo)準(zhǔn)[6];③病理標(biāo)本、病歷數(shù)據(jù)完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①根治術(shù)前行抗腫瘤治療;②根治術(shù)前存在急慢性感染;③非原發(fā)性NSCLC或合并肝細(xì)胞癌等其他惡性腫瘤;④合并強(qiáng)直性脊柱炎等免疫系統(tǒng)疾病;⑤伴心、腎等主要臟器功能不全。

1.2 方法取術(shù)中切除的NSCLC患者癌組織及距手術(shù)切緣>2 cm的癌旁組織,固定液使用pH 7.4的10%福爾馬林,常規(guī)制作石蠟切片(4 μm);采用EnVision兩步法(免疫組化)檢測CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達(dá)情況,常規(guī)脫蠟、梯度水化,微波修復(fù)3次,10 min/次,3%過氧化氫中封閉內(nèi)源過氧化物10 min;分別滴加一抗兔抗人CYFRA21-1多克隆抗體(上海圻明生物科技,稀釋濃度1∶1000)、鼠抗人MTA1單克隆抗體(中國中杉金橋,1∶150)、鼠抗人ERCC-1單克隆抗體(英國Abcam,1∶50),低溫孵育12 h(4 ℃),滴加二抗(丹麥Dako,EnVisionTM試劑盒,生物素標(biāo)記),室溫孵育40 min,使用德國Sigma-Aldrich公司的二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine, DAB)顯色90 s,并使用該公司生產(chǎn)的蘇木精復(fù)染,梯度酒精脫水(無水乙醇至70%乙醇,30 s/梯度),常規(guī)透明、封片。使用雙盲法(由兩名工作年限≥5年的病理醫(yī)師完成)閱片,高倍鏡(×200)下隨機(jī)觀察5次,每次計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,以陽性細(xì)胞比率+染色強(qiáng)度評估表達(dá)強(qiáng)度[7],陽性細(xì)胞比率分別計(jì)分0分(<10%)、1分(10%～30%)、2分(31%～50%)、3分(51%～75%)、4分(>75%);染色強(qiáng)度分別計(jì)分0分(無色)、1分(淡黃)、2分(棕黃)、3分(棕褐),2項(xiàng)相加的總分≥3分即為表達(dá)陽性,表達(dá)強(qiáng)度根據(jù)總分判斷,3分為+,4～5分為++,6～7分為+++。

1.3 觀察指標(biāo)①NSCLC癌組織與癌旁組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達(dá)情況;②NSCLC不同臨床病理特征者癌組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達(dá)情況;③NSCLC癌組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達(dá)強(qiáng)度與病理特征的關(guān)聯(lián)性分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);等級資料比較采用秩和檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達(dá)情況癌組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達(dá)陽性率均高于癌旁組織(P<0.05)。見表1。

表1 癌組織與癌旁組織表達(dá)陽性率比較 [n(%)]

2.2 不同臨床病理特征者癌組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達(dá)陽性率比較淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者癌組織MTA1、ERCC-1陽性率高于未淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(χ2=8.118、5.674,P<0.05),TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者癌組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期者(χ2=9.192、4.358、8.802,P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理特征者表達(dá)陽性率比較 [n(%)]

2.3 癌組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性分析淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者癌組織MTA1、ERCC-1表達(dá)強(qiáng)度顯著高于未淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(Z=3.590、2.560,P<0.05),TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者癌組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達(dá)強(qiáng)度顯著高于Ⅰ～Ⅱ期者(Z=3.424、2.484、3.163,P<0.05)。見表3。Spearman秩相關(guān)分析顯示,NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與癌組織MTA1、ERCC-1表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)(r=0.496、0.442,P<0.001),TNM分期與癌組織CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)(r=0.690、0.558、0.594,P<0.001)。

表3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期不同者癌組織中CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1表達(dá)強(qiáng)度比較 [n(%)]

3 討論

MTA1基因在人染色體的定位由Nawa等經(jīng)熒光原位雜交法發(fā)現(xiàn),其位于14q32.3,且其互補(bǔ)DNA編碼蛋白包含獨(dú)立閱讀開放框,為其基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用奠定基礎(chǔ),MTA1蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi),無跨膜或膜相關(guān)功能,近年研究顯示[8],MTA1蛋白異常表達(dá)在多種惡性腫瘤中可見。楊昕等[9]研究發(fā)現(xiàn),MTA1在NSCLC患者中的表達(dá)率為79.07%,且MTA1高表達(dá)者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)更高。還有研究指出[10],MTA1高表達(dá)可能對血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)有上調(diào)作用,從而加速腫瘤血管生成,為腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移創(chuàng)造良好環(huán)境,下調(diào)MTA1的表達(dá),可抑制腫瘤進(jìn)展。本研究中,NSCLC患者癌組織MTA1表達(dá)陽性率明顯高于癌旁組織,提示MTA1表達(dá)升高可能參與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展。不僅如此,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM高分期者癌組織MTA1陽性率及表達(dá)強(qiáng)度更高,且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期與均MTA1表達(dá)強(qiáng)度呈正顯著相關(guān),提示MTA1的表達(dá)上調(diào)可能參與了NSCLC的侵襲及轉(zhuǎn)移。然而,MTA1促進(jìn)惡性腫瘤增殖的具體作用機(jī)制尚未闡明,本研究結(jié)果僅表明MTA1可能是NSCLC治療的新靶點(diǎn),還需后續(xù)基于分子生物學(xué)對其作用機(jī)制作進(jìn)一步探究。

ERCC-1為DNA損傷修復(fù)基因,ERCC-1基因敲除的小鼠表現(xiàn)為細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞,且由于是高度單鏈DNA核酸內(nèi)切酶,在表達(dá)出特定蛋白時(shí)才具有DNA損傷修復(fù)功能,近年研究發(fā)現(xiàn)[11],ERCC-1表達(dá)異常與肺癌的發(fā)生有關(guān)。另外,ERCC-1基因被發(fā)現(xiàn)與鉑類藥物耐藥機(jī)制密切相關(guān),因ERCC-1可參與核苷酸切除修復(fù),鉑類化療藥物引起DNA損傷后,ERCC-1高表達(dá)者可迅速修復(fù)細(xì)胞分裂周期中的DNA損傷,導(dǎo)致化療無效,即引起鉑類藥物耐藥,故檢測ERCC-1的表達(dá)水平對指導(dǎo)臨床化療具有重要意義[12]。本研究中,相較于癌旁組織,癌組織ERCC-1表達(dá)陽性率明顯升高,且其表達(dá)強(qiáng)度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期呈明顯正相關(guān),考慮與NSCLC腫瘤細(xì)胞大量增殖、轉(zhuǎn)移時(shí),可引起更多的細(xì)胞DNA損傷,機(jī)體ERCC-1表達(dá)隨之上調(diào)有關(guān)。

CYFRA21-1作為細(xì)胞重要的骨架蛋白,其表達(dá)異?？稍黾蛹?xì)胞異型性,促進(jìn)腫瘤向周圍鄰近組織侵襲,甚至轉(zhuǎn)移[13]。Cheng等[14]指出,CYFRA21-1可參與肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生,其血清檢測目前常用于惡性腫瘤的早篩。本研究中,癌組織CYFRA21-1表達(dá)陽性率較癌旁組織明顯升高,其表達(dá)強(qiáng)度與NSCLC臨床分期呈明顯正相關(guān),與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等無明顯關(guān)聯(lián)性,與目前研究發(fā)現(xiàn)有所不同[15]。該結(jié)果一方面與本研究納入樣本量不足,導(dǎo)致檢驗(yàn)效能偏低有關(guān);另一方面,NSCLC腫瘤細(xì)胞的惡性與侵襲能力與多種基因表達(dá)有關(guān),單一CYFRA21-1的表達(dá)情況不能全面評估其侵襲能力,故其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性較差。

綜上所述,CYFRA21-1、MTA1、ERCC-1可能均參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展,檢測三者的癌組織表達(dá)水平對判斷NSCLC侵襲及轉(zhuǎn)移能力有積極作用,可指導(dǎo)臨床治療。