鐘 秀,田 鯤

(1.西藏自治區(qū)人民政府駐成都辦事處醫(yī)院口腔科,四川 成都 610041;2.西南醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院,四川 瀘州 646000;3.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院口腔科,四川 成都 610072)

釉基質(zhì)蛋白包括釉原蛋白(amelogenin,AM)和非釉原蛋白[1,2],全程參與釉質(zhì)礦化的調(diào)控[3,4]。AM占釉基質(zhì)蛋白的90%[5,6],在釉質(zhì)發(fā)育時(shí),其單體分級(jí)自組裝形成納米球、納米鏈及納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),形成引導(dǎo)羥基磷灰石(hydroxyapatite,HA)晶體生長的礦化骨架。牙釉質(zhì)一經(jīng)損害難以再生,目前臨床治療方法大多采用各種人工替代材料進(jìn)行修復(fù),但均難再現(xiàn)天然牙釉質(zhì)的外觀、精妙結(jié)構(gòu)和各種性能。故研究者們將目光投向“仿生礦化”領(lǐng)域,致力于利用生物分子模板在體外引導(dǎo)牙釉質(zhì)再生,其中AM備受關(guān)注。在AM調(diào)控晶體礦化的過程中影響因素眾多,其中pH值是主要影響因素[7]。本研究著重探尋在人AM誘導(dǎo)HA晶體成核、生長的過程當(dāng)中pH值的影響。

1 材料與方法

1.1 材料于2019年6月至2020年2月,收集正畸患者因治療要求拔除的處在釉質(zhì)發(fā)育階段的下頜第三磨牙牙胚,全部取樣均征得患者及其監(jiān)護(hù)人同意,均由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院齒槽外科提供。Trizol RNA分離試劑、質(zhì)粒提取試劑盒、pET-28a(+)載體、大腸桿菌BL21plys(賽默飛世爾科技有限公司)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、Western Blot試劑盒(上海生工生物工程有限公司)、PBS、HCl、NaOH(天津市福晨化學(xué)試劑廠)、磷酸鎢(河南銳欣實(shí)驗(yàn)用品有限公司)、Tris-HCl、MgCl2、CaCl2·H2O 、KH2PO4、KCl、NH4Cl、HEPES、NaF(武漢德晟生化科技公司)。透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)、臺(tái)式掃描電子顯微鏡(phenom公司)、X射線衍射儀(日本Rigaku公司)。本研究獲得我院倫理委員會(huì)審批。

1.2 重組AM的表達(dá)從收集到的第三磨牙牙胚中提取出牙胚細(xì)胞的總RNA,設(shè)計(jì)AM引物如下。AM上游引物序列:5′-CGCGGATCCATGGGGACCTGGATTTT-3′,下游引物序列:5′- CGAGCTCTTAATCCACTTCCTCCCGC-3′。通過RT-PCR反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增得到AM的cDNA片段,與pET-28a(+)載體進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21plys誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE檢測(cè)、Western Blot驗(yàn)證后純化得到AM蛋白。

1.3 蛋白儲(chǔ)備液及人工唾液的配制蛋白儲(chǔ)備液:將純化后的1 ml 0.5 mg/ml的AM溶于0.25 ml預(yù)冷pH=3.5的5 mM PBS中,配制成2 mg/ml的AM儲(chǔ)備液,調(diào)節(jié)初始pH=3.5,4 ℃下溶解24 h以確保蛋白完全溶解,4 ℃下離心20 min去除灰塵和微粒雜質(zhì),-80 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ斯ね僖?含MgCl20.2 mM,CaCl2·H2O 1 mM,KH2PO44 mM,KCl 16 mM,NH4Cl 4.5 mM,HEPES 20 mM,預(yù)冷的0.1 M HC1和0.1 M NaOH分別調(diào)整人工唾液pH至6.4、7.4、8.4、9.4、10.4,使用前加入300 ppm NaF。

1.4 AM不同pH值下的體外自組裝實(shí)驗(yàn)取20 μl pH=3.5的2 mg/ml AM儲(chǔ)備溶液,用60 μl 5 mM PBS(pH分別等于5、6、7、8、9)稀釋,調(diào)節(jié)溶液pH分別為5、6、7、8、9,添加5 mM PBS(pH分別等于5、6、7、8、9)定容為200 μl,得到200 μg/ml的不同pH值的AM溶液。分別取出20 μl蛋白溶液滴到碳支持膜正面,室溫下分別孵育5、30 min。取出碳支持膜吸干水分,磷酸鎢染色2.5 min。透射電鏡下觀察碳支持膜上AM的自組裝情況。

1.5 AM在不同pH值下誘導(dǎo)HA晶體生成取20 μl 2 mg/ml的AM儲(chǔ)備液加60 μl 50 mM Tris-HCl溶液(pH=7.4)稀釋,用pH=8.0的50 mM Tris-HCl溶液調(diào)節(jié)pH=7.4,再加入pH=7.4的50 mM Tris-HCl定容到200 μl,得到最終濃度為200 μg/ml、pH=7.4的AM溶液。實(shí)驗(yàn)分組如下:①空白組:細(xì)胞爬片取出后不做任何處理,置于24孔板的2 ml pH=7.4的人工唾液中,密封后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育。②對(duì)照組:細(xì)胞爬片取出后,吸取20 μl 50 mM Tris-HCl溶液(pH=7.4)涂布于細(xì)胞爬片表面,室溫下孵育30 min后轉(zhuǎn)移至24孔板的2 ml pH=7.4的人工唾液中,密封后于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育。③實(shí)驗(yàn)組:細(xì)胞爬片取出后,吸取20 μl 200 μg/ml、pH=7.4的AM溶液涂布于細(xì)胞爬片表面,室溫下孵育30 min后分別轉(zhuǎn)移至24孔板的2 ml pH=6.4(實(shí)驗(yàn)組1)、7.4(實(shí)驗(yàn)組2)、8.4(實(shí)驗(yàn)組3)、9.4(實(shí)驗(yàn)組4)、10.4(實(shí)驗(yàn)組5)的人工唾液中,密封,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育。以上實(shí)驗(yàn)組每天更換新鮮人工唾液,4天后取出牙片,ddH2O反復(fù)清洗3次,室溫自然干燥。

1.6 掃描電鏡及X射線衍射分析采用臺(tái)式掃描電鏡觀察孵育4天后的各組細(xì)胞爬片上沉積物的形貌,操作步驟為:吹凈表面雜質(zhì),導(dǎo)電膠固定樣品,噴金60 s,放入掃描電鏡真空室進(jìn)行觀察并拍照。選擇誘導(dǎo)結(jié)果最佳的實(shí)驗(yàn)組礦化產(chǎn)物進(jìn)行X射線衍射分析,即采用X射線衍射儀對(duì)pH=7.4時(shí)AM誘導(dǎo)4天生成的晶體進(jìn)行結(jié)構(gòu)測(cè)試。

2 結(jié)果

2.1 蛋白表達(dá)結(jié)果純化后的目的蛋白經(jīng)過SDS-PAGE電泳分析,在23 kDa左右的位置出現(xiàn)了明顯藍(lán)色條帶,與AM蛋白理論分子量相符,初步確定表達(dá)純化了目的蛋白。Western Blot檢測(cè)在23 kDa左右的位置也出現(xiàn)了相應(yīng)條帶,進(jìn)一步說明目的蛋白為AM。見圖1。

圖1 目的蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 a:目的蛋白的SDS-PAGE分析圖;b:目的蛋白的Western Blot檢測(cè)圖

2.2 AM在不同pH值下的自組裝結(jié)果AM在pH=5的PBS溶液中孵育5 min后,AM單體形成的多聚體獨(dú)立分布于溶液中(圖2A紅色箭頭);繼續(xù)孵育25 min,多聚體排列形成 “單鏈網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu)(圖2B白色框)。

圖2 AM在不同pH值下自組裝的透射電鏡結(jié)果 a、b:pH=5; c、d:pH=6; e、f:pH=7; g、h:pH=8; i、j:pH=9

AM在pH=6的PBS溶液中孵育5 min,多聚體均勻散在分布,直徑約為10 nm(圖2C紅色箭頭);繼續(xù)孵育25 min,有“雙鏈網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu)(圖2D紅色框)生成,邊界較5 min時(shí)顏色更深更清晰(圖2D白色箭頭)。

AM在pH=7的PBS溶液中孵育5 min后,多聚體大部分散在均勻分布,少部分進(jìn)一步聚集,有形成納米球趨勢(shì)(圖2E紅色箭頭);繼續(xù)孵育25 min,納米球結(jié)構(gòu)不明顯,但多聚體的聚集趨勢(shì)比pH=6時(shí)大,有“多鏈網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu)(圖2F紅色框)生成,邊界較5 min時(shí)顏色更深更清晰(圖2F白色箭頭)。

AM在pH=8的PBS溶液中孵育5 min后,單體形成的多聚體大部分散在均勻分布,邊界較pH=7和pH=6時(shí)光滑清晰(圖2G紅色箭頭),少部分有進(jìn)一步聚集趨勢(shì)(圖2G紅色框);繼續(xù)孵育25 min,可見非常明顯的納米球生成,直徑約50 nm(圖2H白色框)。這些納米球進(jìn)一步聚集形成更大的球形多聚物(圖2H紅色框)、“串珠狀” 結(jié)構(gòu)(圖2H藍(lán)色框)等,并且有進(jìn)一步組裝成網(wǎng)狀趨勢(shì)(圖2H黑色框)。

AM在pH=9的PBS溶液中孵育5 min后,部分多聚體仍然單獨(dú)分布,另一部分有聚集形成納米球趨勢(shì)(圖2I紅色箭頭);繼續(xù)孵育25 min,有明顯直徑較大的“納米球”結(jié)構(gòu)生成,約100～150 nm(圖2J紅色框),大部分散在分布,少部分進(jìn)一步聚集成“球狀”(圖2J黑色框)或“串珠狀” (圖2J白色框)。見表1及圖2。

表1 AM在不同pH值下的自組裝結(jié)果

2.3 AM在不同pH值下的礦化結(jié)果

2.3.1空白組及對(duì)照組的礦化結(jié)果 空白組細(xì)胞爬片僅可見無結(jié)構(gòu)的片狀、板狀礦化物沉積;對(duì)照組細(xì)胞爬片可見由礦物離子形成的圓形的鈣化球沉積,排列散亂無規(guī)則。與HA晶體及釉柱的針狀、棒狀結(jié)構(gòu)完全不同。見圖3。

圖3 空白組及對(duì)照組礦化4天后的掃描電鏡結(jié)果 a、b:空白組;c、d:對(duì)照組

2.3.2AM在不同pH值的人工唾液中的礦化結(jié)果 AM在pH=6.4的人工唾液中礦化4天后,誘導(dǎo)生成了直徑為0.4～0.6 μm的粗大柱狀礦化產(chǎn)物(圖4A、B白色箭頭),柱狀晶體內(nèi)無針狀纖維的分級(jí)結(jié)構(gòu),與HA晶體的分級(jí)構(gòu)造不同。同時(shí)可見散在的圓球形鈣化小球(圖4B紅色框)。

圖4 AM在不同pH值的人工唾液中礦化4天后的掃描電鏡結(jié)果 a、b:pH=6.4; c、d:pH=7.4; e、f:pH=8.4; g、h:pH=9.4; i、j:pH=10.4

AM在pH=7.4的人工唾液中礦化4天后,生成了直徑為100～150 nm,長度為2～2.5 μm的針狀晶體(圖4D白色箭頭),針狀晶體進(jìn)一步接近平行地捆綁聚集成直徑為0.5～2 μm的晶體束(圖4C、D紅色方框)。這種由納米級(jí)微纖維進(jìn)一步組裝成更粗的晶體束纖維的過程與牙釉質(zhì)七級(jí)結(jié)構(gòu)中HA晶體納米到微米級(jí)結(jié)構(gòu)的組成過程十分相符。

AM在pH=8.4的人工唾液中誘導(dǎo)礦化4天后,生成了“花蕾狀”結(jié)構(gòu)(圖4E、F紅色框),由直徑約為80～100 nm,長度約為300～500 nm的針狀晶體聚集而成(圖4F白色箭頭),相互之間成角大。

AM在pH=9.4的人工唾液中誘導(dǎo)礦化4天后生成的晶體相對(duì)無序,雖然生成了“針狀”納米級(jí)纖維,但直徑僅為50～90 nm,長度100～400 nm(圖4H白色箭頭),少部分聚集捆綁成“花蕾狀”結(jié)構(gòu)(圖4G紅色框),大部分呈“叢狀”(圖4H白色框)。

AM在pH=10.4的人工唾液中誘導(dǎo)礦化4天后,生成的晶體較前幾組更短更細(xì),直徑約為20～40 nm,長度僅約80～100 nm(圖4J白色箭頭),排列疏松且無明顯取向,呈“叢狀”(圖4J白色框),也有較小的“仙人球狀” 結(jié)構(gòu)(圖4K紅色框),與HA晶體近似平行排列的取向差別較大。

2.4 X射線衍射結(jié)果AM在pH=7.4的人工唾液中礦化4天后所得沉積物的X射線衍射光譜在2 θ衍射角為 25.8°,31.8°,33°和46.7°時(shí)出現(xiàn)衍射峰,與HA晶體(002)、(211)、(300)和(222)的特征峰一致,表明新沉積的礦物質(zhì)是HA晶體。見圖5。

圖5 AM在pH=7.4時(shí)礦化產(chǎn)物的X射線衍射結(jié)果

3 討論

AM主要由疏水性N末端、疏水性中央?yún)^(qū)域和親水性C末端三部分組成[8,9],其中C末端以及N末端高度保守,是AM的主要功能域。AM自組裝形成納米球、微帶和納米鏈[10],被認(rèn)為是引導(dǎo)HA晶體形成的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力[11],而其鈣結(jié)合基序-N端16位絲氨酸的磷酸化可以提高結(jié)合鈣離子的能力,C末端結(jié)構(gòu)域帶高電荷,以有利的方式自身定位,允許其與HA晶體表面的離子相互作用,引導(dǎo)晶體形成[12]。

AM的自組裝特性高度依賴pH值[13],在溶液中以pH依賴的方式自組裝成超分子結(jié)構(gòu)[14]。低pH值與AM的等電點(diǎn)相差甚遠(yuǎn),酸性氨基酸側(cè)鏈可以大部分被質(zhì)子化,而其C端肽具有高濃度的酸性氨基酸,可通過帶負(fù)電和帶正電的氨基酸之間的靜電相互結(jié)合相互作用,C端肽酸性氨基酸的質(zhì)子化可能會(huì)影響蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-礦物質(zhì)的相互作用和自組裝模式,從而影響AM的自組裝及其對(duì)礦物質(zhì)形成的調(diào)節(jié)作用[15]。

近年來,研究者們嘗試使用AM作為仿生礦化模板體外誘導(dǎo)HA晶體的生成,對(duì)AM的結(jié)構(gòu)、功能和作用的研究已經(jīng)取得了重大進(jìn)展。Fan等[16]發(fā)現(xiàn)重組豬AM rP172在pH=4.8,37 ℃條件下誘導(dǎo)生成了納米棒狀結(jié)構(gòu);Uskokovic等[17]使用重組人AM rH174在pH=7.4、37 ℃條件下誘導(dǎo)生成了片狀晶體;Ruan等[18]發(fā)現(xiàn)重組豬AM rP172-殼聚糖水凝膠在300 ppm F-、pH=7.0、37 ℃條件下生成了形態(tài)接近HA晶體的針狀納米結(jié)構(gòu);Prozorov[19]研究表明重組鼠AM rM179在pH=7.4、37 ℃條件下可生成彎曲的條狀晶體。些許實(shí)驗(yàn)條件的差異得到形貌各異的晶體結(jié)構(gòu),說明在AM調(diào)控晶體礦化的過程中影響因素眾多,如誘導(dǎo)溫度、F-強(qiáng)度、pH值、磷酸化等。其中,pH值是主要影響因素,但影響細(xì)節(jié)仍然存在爭(zhēng)議,且礦化模板大多使用動(dòng)物蛋白,其蛋白的分泌軌跡、組裝方式以及作用機(jī)制與人AM有所區(qū)別。故本研究在體外表達(dá)了人的AM全長,并依據(jù)人AM在不同pH值下的體外自組裝行為設(shè)置pH梯度,觀察人AM在不同pH值下的體外礦化能力。

自組裝實(shí)驗(yàn)表明AM在酸性條件下無明顯聚集趨勢(shì),在中性、堿性條件下有典型納米球結(jié)構(gòu)生成。當(dāng)pH=7時(shí),聚集趨勢(shì)變明顯,直至pH=8時(shí)出現(xiàn)典型的自組裝過程,但在這區(qū)間自組裝行為變化的臨界點(diǎn)并不清晰。故在設(shè)計(jì)進(jìn)一步AM的體外礦化實(shí)驗(yàn)時(shí):①擯棄過低的pH值(pH=5、6);②在pH值7～8選擇pH=7.4(體內(nèi)釉質(zhì)發(fā)育分泌期的生理性pH);③設(shè)置梯度為1;④設(shè)置略偏酸性的pH=6.4增加容錯(cuò)率;⑤堿性條件設(shè)置幾個(gè)pH值(堿性條件仍可見納米球生成)。最終設(shè)計(jì)AM礦化實(shí)驗(yàn)的pH梯度為6.4、7.4、8.4、9.4、10.4。

AM在pH=6.4時(shí)誘導(dǎo)生成的柱狀晶體內(nèi)無針狀纖維的分級(jí)結(jié)構(gòu),與HA晶體的分級(jí)構(gòu)造不同,這與AM在酸性條件下自組裝過程不明顯的結(jié)果相符。AM在pH=7.4時(shí)在細(xì)胞爬片上誘導(dǎo)生成了直徑為100～150 nm,長度為2～2.5 μm的針狀晶體,這些針狀晶體接近平行地進(jìn)一步捆綁聚集成直徑為0.5～2 μm的晶體束。這種由納米級(jí)微纖維進(jìn)一步組裝成更粗的晶體束纖維的過程與牙釉質(zhì)七級(jí)結(jié)構(gòu)中HA晶體納米到微米級(jí)結(jié)構(gòu)的組成過程十分相符,同時(shí)與自組裝實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)在pH=7上升至pH=8之間出現(xiàn)AM典型功能性自組裝過程的結(jié)論一致。AM在pH為8.4、9.4、10.4的堿性環(huán)境下,生成的針狀晶體直徑逐漸變小,長度也逐漸變短,且排列取向逐步趨向散亂,與HA晶體的排列差別較大,這與堿性條件下AM自組裝形成的納米球大部分散在分布的結(jié)果一致。

綜上所述,AM的自組裝過程和礦化能力對(duì)pH值非常敏感,在pH=7～8開始出現(xiàn)典型的多級(jí)自組裝行為,在pH=7.4時(shí)可以成功誘導(dǎo)出與天然牙釉質(zhì)相似的HA晶體。這一研究結(jié)果能為設(shè)置AM體外誘導(dǎo)牙釉質(zhì)再礦化的最佳條件奠定基礎(chǔ)。