董起鈺,尹筱婕,鐘 聲,范雙龍,方合志,王 婭

(浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,浙江 溫州 325035)

線粒體疾病(也稱線粒體病)是兒童時(shí)期最為常見的一類先天性遺傳代謝病,目前尚無(wú)根本的治療方法。因此,早發(fā)現(xiàn)、早診斷對(duì)于線粒體病的防治至關(guān)重要。由于線粒體病臨床表型的多樣性和復(fù)雜性,導(dǎo)致線粒體病診斷尤為困難,極易漏診誤診,往往需要結(jié)合臨床、病理、生化以及分子檢測(cè)綜合進(jìn)行診斷。其中臨床診斷是線粒體病診斷的基礎(chǔ),但當(dāng)臨床不能確診時(shí),分子診斷對(duì)線粒體病的確診起到了“一錘定音”的作用。本文主要介紹了線粒體病的分子診斷策略和疾病診斷標(biāo)志物。

1 線粒體病

線粒體病最早發(fā)現(xiàn)于1962年,并被定義為一類存在氧化磷酸化(OXPHOS)功能異常的遺傳代謝性疾病。隨著酶生化技術(shù)、細(xì)胞學(xué)、尤其是基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,線粒體病被進(jìn)一步定義為:一類線粒體功能異常所導(dǎo)致的疾病,其中OXPHOS功能缺陷是其主要特征[1]。線粒體病臨床表現(xiàn)多樣,可累及人體多個(gè)臟器[2],疾病亞型多達(dá)300余百種,其中常見的線粒體病有線粒體腦肌病伴乳酸酸中毒和卒中樣發(fā)作綜合征(MELAS)、亞急性壞死性腦病(Leigh綜合征)、Kearns-Sayre綜合征(KSS)、慢性進(jìn)行性眼外肌癱瘓(CPEO)、肌陣攣性癲癇伴肌肉蓬毛樣紅纖維綜合征(MERRF)等。雖然單一的線粒體疾病亞型發(fā)病率低,但總發(fā)病率可高達(dá)1/5000[3],是兒童時(shí)期最為常見的先天性遺傳代謝病。已知有1200余種蛋白定位于線粒體中,其中絕大多數(shù)蛋白質(zhì)由核基因(nDNA)編碼,而線粒體基因(mtDNA)僅編碼了其中的13種亞基,2種rRNA和22種tRNA[4]。因此,線粒體病的遺傳方式可分為nDNA突變介導(dǎo)的孟德爾遺傳方式和mtDNA突變介導(dǎo)的母系遺傳方式。

2 線粒體病的遺傳特點(diǎn)

線粒體是一個(gè)半自主性細(xì)胞器,能夠進(jìn)行自我復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。與nDNA相比,mtDNA具有如下特點(diǎn):①母系遺傳,這是因?yàn)榫釉诎l(fā)育成熟后只有很少的線粒體,且在受精后自行降解,子代中mtDNA幾乎全部來(lái)自于卵細(xì)胞,而表現(xiàn)為母系遺傳。但近年研究也顯示在少數(shù)情況下,父親可以將mtDNA遺傳給后代;②復(fù)制分離,在細(xì)胞分裂過(guò)程中,mtDNA隨機(jī)分配到子細(xì)胞中,導(dǎo)致子細(xì)胞含不同比例的突變mtDNA分子。分裂旺盛的細(xì)胞往往會(huì)排斥突變型mtDNA,使細(xì)胞中野生型mtDNA比例逐漸增加。而在分裂不活躍的細(xì)胞中則出現(xiàn)相反的情況[5];③高突變率,主要因?yàn)閙tDNA無(wú)組蛋白保護(hù),缺乏損傷修復(fù)系統(tǒng),且與線粒體內(nèi)膜相連,極易被呼吸鏈代謝產(chǎn)生的氧自由基損傷;④閾值效應(yīng),突變型mtDNA達(dá)到一定水平導(dǎo)致線粒體產(chǎn)能急劇下降,組織或器官缺乏能量供應(yīng)從而表現(xiàn)出臨床癥狀。能量需求越高的組織器官的閾值越低,對(duì)線粒體功能異常越敏感[6]。

3 線粒體病的分子診斷與疾病標(biāo)志物

3.1 線粒體病分子診斷由于線粒體病臨床表現(xiàn)的多樣性和復(fù)雜性,給線粒體病的診斷帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。線粒體病的診斷需結(jié)合臨床診斷、肌肉病理學(xué)檢查、生化檢測(cè)以及分子診斷綜合進(jìn)行分析[7]。臨床診斷是線粒體病診斷的基礎(chǔ),但當(dāng)臨床不能確診時(shí),分子診斷起到了決定性作用。1988年,Wallace等首次發(fā)現(xiàn)m.11778G>A是Leber’s遺傳性視神經(jīng)病(LHON)的致病突變[8]。隨后Goto等在1990年發(fā)現(xiàn)了第二個(gè)線粒體病致病突變(m.3243A>G)[9]。過(guò)去十幾年隨著高通量測(cè)序在線粒體病分子診斷中的應(yīng)用,至今已發(fā)現(xiàn)400余個(gè)線粒體致病基因。由于線粒體病基因型-表型間存在一定關(guān)聯(lián),因此可結(jié)合臨床表現(xiàn),針對(duì)性進(jìn)行基因檢查。見表1。

表1 線粒體病相關(guān)基因突變及臨床表現(xiàn)

Leigh綜合征又稱為亞急性壞死性腦病,是由遺傳缺陷導(dǎo)致線粒體功能障礙引起的神經(jīng)退行性病變,發(fā)病率約為1/40000[10]。Leigh綜合征起病早,病程進(jìn)展迅速,預(yù)后較差。病因復(fù)雜,主要由線粒體呼吸鏈復(fù)合體缺陷(ACAD9、NDUFS1、SDHA等核基因或MTND1、MTCO3等線粒體基因突變導(dǎo)致);丙酮酸羧化酶或丙酮酸脫氫酶復(fù)合物缺陷(DLD、PDHA1、TPK1等基因突變導(dǎo)致);輔酶Q等輔助因子合成障礙(COQ9、PDSS2突變導(dǎo)致),患者腦干、雙側(cè)基底節(jié)區(qū)、小腦、脊髓等部位對(duì)稱性局灶性壞死,并表現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、肌力下降或肌張力異常等臨床癥狀。

MELAS綜合征是一種常見的線粒體腦肌病,患者臨床多表現(xiàn)為癲癇、卒中樣發(fā)作、頭痛等,基因檢測(cè)是確診MELAS綜合征的重要標(biāo)準(zhǔn)[11]。自Goto等于1990年首次報(bào)道m(xù).3243A>G突變導(dǎo)致MELAS的病例,更多的mtDNA變異位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn),如m.3271T>C、m.3252A>G、m.3291T>C、m.3260A>G等,其中大部分突變位于mtDNA的tRNA基因區(qū)域。

MERRF綜合征又稱肌陣攣癲癇伴破碎紅纖維綜合征,是線粒體腦肌病的一個(gè)亞型,患者多在兒童期發(fā)病。由于突變基因或位點(diǎn)不同,患者的臨床表型各異,以肌陣攣性癲癇發(fā)作為主要特征, 可伴有智力減退、小腦共濟(jì)失調(diào)等,此外,還會(huì)出現(xiàn)如甲狀腺功能減退等其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。線粒體DNA突變導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化功能缺陷是發(fā)病的根本原因,m.8344A>G、m.8356T>C、m.8361G>A和m.8363G>A是常見的致病性突變,其中m.8344A>G是MERRF相關(guān)的熱點(diǎn)突變。

LHON又稱Leber遺傳性視神經(jīng)萎縮,該病于1871年首次報(bào)道,以雙眼出現(xiàn)無(wú)痛性視力下降為首發(fā)癥狀,隨著病情進(jìn)展,可出現(xiàn)顯著的雙側(cè)視神經(jīng)萎縮,伴隨或不伴隨其他多系統(tǒng)癥狀,如運(yùn)動(dòng)障礙、癲癇、聽力障礙等。約95%的LHON患者由m.11778G>A、m.14484T>C和m.3460G>A這三個(gè)點(diǎn)的突變引起。

Kearns-Sayre綜合征于1958年由Kearns和Sayre首次報(bào)道,是一種以慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹、視網(wǎng)膜色素變性和心臟傳導(dǎo)功能障礙三聯(lián)征為主要特征的線粒體腦肌病。KSS最常見病因是由DNA的重排導(dǎo)致的線粒體DNA單個(gè)或多個(gè)片段缺失,常見的致病性突變位點(diǎn)包括m.4298G>A、m.4308G>A、m. 5703G>A和m.12315G>A等。

3.2 線粒體病分子診斷技術(shù)mtDNA突變形式有多種,包括點(diǎn)突變、重復(fù)和缺失等,其中主要以點(diǎn)突變?yōu)橹?。mtDNA突變的檢測(cè)方法主要包括PCR-RFLP和PCR-ASO等。對(duì)于A3243G、T8993G等常見的線粒體DNA點(diǎn)突變,通常使用PCR-RFLP法。該方法是通過(guò)PCR擴(kuò)增一段含有突變位點(diǎn)的mtDNA,然后再使用合適的限制性內(nèi)切酶,酶切PCR產(chǎn)物,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到特異性的電泳譜帶,野生型mtDNA所得的PCR產(chǎn)物會(huì)被切成2個(gè)片段,從而鑒定該位點(diǎn)是否發(fā)生突變。該方法較簡(jiǎn)便,特異性高,適合同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本,并且通過(guò)掃描野生型及突變型DNA條帶信號(hào)強(qiáng)度可以粗略計(jì)算突變型mtDNA的比例。但此方法耗時(shí),結(jié)果不穩(wěn)定,限制性內(nèi)切酶可能消化不完全。此外,PCR-RFLP法可能無(wú)法檢測(cè)到低百分比(<15%)的異質(zhì)性。為了更有效地診斷線粒體病,可使用多重PCR /等位基因特異性寡核苷酸(ASO)點(diǎn)印跡雜交方法?；颊逥NA樣本含有野生型或突變型mtDNA,將其PCR產(chǎn)物與相應(yīng)的核酸探針雜交,野生型的mtDNA只結(jié)合正常探針,同質(zhì)突變型的mtDNA只結(jié)合突變探針,而異質(zhì)突變型的mtDNA將與野生型和突變型ASO探針雜交。該方法靈敏度高,能同時(shí)分析多個(gè)位點(diǎn)突變。對(duì)于低百分比的突變異質(zhì)性也可以檢測(cè)。但不能進(jìn)行定量檢測(cè)。

對(duì)于大片段缺失可采用Southern雜交進(jìn)行檢測(cè),基本原理是經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后的DNA片段,瓊脂糖凝膠電泳及變性后,轉(zhuǎn)移至固相支持物上,與相應(yīng)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。使用Southern雜交時(shí)需注意檢測(cè)樣本的選擇。由于mtDNA缺失的線粒體病患者,其不同組織中含有的突變型mtDNA比例不同,在肌肉和腦等組織中突變型mtDNA比例較高,但在血液中可能檢測(cè)不到。

對(duì)于一些尚不清楚的點(diǎn)突變可采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、變性高效液相層析(dHPLC)、變性梯度凝膠電泳(DDGE)及DNA測(cè)序等進(jìn)行檢測(cè)。SSCP是基于單鏈DNA構(gòu)象的差別來(lái)檢測(cè)突變。相同長(zhǎng)度的單鏈DNA由于堿基序列不同,形成不同的空間構(gòu)象,在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中表現(xiàn)為不同的遷移率,區(qū)分野生型DNA和突變型DNA。SSCP操作簡(jiǎn)單,能夠快速、有效地檢測(cè)各種類型的突變,如點(diǎn)突變、缺失和重復(fù)等,但如果突變導(dǎo)致空間構(gòu)象變化微小,遷移率相差無(wú)幾,會(huì)出現(xiàn)假陰性,進(jìn)而影響檢測(cè)的靈敏度。dHPLC方法可以篩查未知單核苷酸多態(tài)性和突變,具有高通量、自動(dòng)化、特異性高、快速等優(yōu)點(diǎn),是分析異質(zhì)性突變首選的檢測(cè)方法。該方法主要通過(guò)PCR擴(kuò)增得到相同長(zhǎng)度的DNA片段,突變型DNA片段和野生型DNA片段只有一個(gè)位點(diǎn)的差異,退火后可形成同源雙鏈和異源雙鏈,兩者在層析柱中的移動(dòng)速度不同,異源雙鏈因有錯(cuò)配區(qū)的存在而更易變性,在色譜柱中的保留時(shí)間短于同源雙鏈,故先被洗脫下來(lái),野生型和突變型得以區(qū)分,由此達(dá)到檢測(cè)基因突變的目的。目前也有許多研究將DDGE變性高效液相層析技術(shù)用于檢測(cè)mtDNA突變[12]。因不受其他篩選方法敏感性和特異性的限制,DNA測(cè)序技術(shù)是進(jìn)行突變分析最直接和最準(zhǔn)確的方法,已成為檢測(cè)基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)。DNA測(cè)序技術(shù)主要包括第一代測(cè)序技術(shù)(Sanger測(cè)序)、第二代測(cè)序技術(shù)(NGS)和第三代測(cè)序技術(shù)。近年來(lái),NGS被廣泛用于研究mtDNA缺陷,主要適用于檢測(cè)mtDNA大片段缺失和異質(zhì)率,已成為mtDNA遺傳分析的首選方法[14～18]。NGS主要包括全基因組測(cè)序(WGS)和全外顯子測(cè)序(WES),其中WGS是對(duì)生物體整個(gè)基因組序列進(jìn)行測(cè)序,可以獲得完整的基因組信息,能夠鑒定出基因組上任何類型的突變,覆蓋內(nèi)含子和外顯子區(qū)域,能同時(shí)分析線粒體基因組項(xiàng)目以及動(dòng)態(tài)突變項(xiàng)目。不同于WGS,WES關(guān)注基因組的外顯子區(qū)域,即蛋白質(zhì)編碼區(qū)域,是目前更適用于臨床的高深度測(cè)序技術(shù)。雖然外顯子組只占基因組的1%～2%,卻包含約85%的致病突變。與全基因組測(cè)序相比,全外顯子測(cè)序檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域明確,更加經(jīng)濟(jì)高效,對(duì)研究SNP、InDel等具有較大的優(yōu)勢(shì),可以憑借高深度測(cè)序鑒定到全基因組測(cè)序所沒(méi)有鑒定到的突變,但不能檢測(cè)大片段缺失。DNA測(cè)序技術(shù)促進(jìn)了突變鑒定速度的提高以及新致病基因的發(fā)現(xiàn),助力了線粒體病快速診斷[13]?？傊?這些技術(shù)推動(dòng)了線粒體病分子診斷的迅速發(fā)展,為臨床快速確診提供了更精準(zhǔn)的信息。

3.3 線粒體疾病標(biāo)志物與線粒體功能障礙相關(guān)的多種生化物質(zhì)統(tǒng)稱為線粒體疾病標(biāo)志物,包括腦脊液乳酸、丙酮酸、血氨基酸、尿有機(jī)酸等,上述標(biāo)志物水平的檢測(cè)對(duì)線粒體病診斷具有重要意義。

乳酸/丙酮酸比值。線粒體病患者安靜時(shí)腦脊液、血清和尿液中的乳酸水平通常升高,導(dǎo)致乳酸與丙酮酸比值隨之變化,一般認(rèn)為安靜時(shí)乳酸與丙酮酸比值大于20,提示患者線粒體呼吸鏈復(fù)合體功能缺陷和丙酮酸代謝受損[19]。但值得注意的是,運(yùn)動(dòng)和抽血應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致患者血乳酸水平急劇上升,因此測(cè)定乳酸水平時(shí)需排除該干擾因素。

血漿氨基酸及尿有機(jī)酸。血漿氨基酸及尿有機(jī)酸檢測(cè)一定程度上也可幫助鑒別線粒體病。目前在臨床上多采用串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行血漿氨基酸和尿有機(jī)酸檢測(cè)。患者血漿中丙氨酸水平異常升高,提示線粒體功能障礙。臨床上一般將丙氨酸與酪氨酸等必需氨基酸進(jìn)行比較,以明確丙氨酸水平的相對(duì)值是否升高。MELAS綜合征患者的血漿瓜氨酸水平降低[20];部分丙酮酸脫氫酶缺陷患者的纈氨酸等支鏈氨基酸水平升高。有機(jī)酸作為機(jī)體代謝的副產(chǎn)物,在線粒體病患者尿液中的水平會(huì)出現(xiàn)異常改變,如Barth綜合征患者尿液中3-甲基葡聚糖酸水平明顯升高;SUCLA2缺乏征患者甲基丙二酸水平明顯升高;MEGD(H)EL綜合征患者3-甲基戊烯二酸水平升高。

此外,有報(bào)道線粒體患者體內(nèi)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF21)[21]和生長(zhǎng)分化因子15(GDF15)[22]水平升高,但也有文章指出FGF21和GDF15在肝臟受損的非線粒體病患者體內(nèi)也會(huì)異常升高[23],二者在繼發(fā)性線粒體病診斷過(guò)程中的靈敏度較以往報(bào)道低[24],因此并不能將二者作為線粒體病的特異性指標(biāo),僅可作為輔助診斷依據(jù)。

4 小結(jié)

目前線粒體病的診斷需結(jié)合臨床診斷、病理檢查、生化檢測(cè)以及分子診斷綜合進(jìn)行分析。在臨床疑診時(shí),分子診斷對(duì)線粒體病的確診起到了關(guān)鍵性作用。此外,檢測(cè)線粒體疾病標(biāo)志物水平也有助于線粒體病的及時(shí)診斷。隨著分子生物學(xué)和高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,相信未來(lái)會(huì)發(fā)現(xiàn)更多線粒體病致病新基因和新突變,也會(huì)有更加方便和精準(zhǔn)的技術(shù)用于線粒體病的生化檢測(cè),并通過(guò)大量的臨床研究發(fā)現(xiàn)更多可靠的線粒體疾病標(biāo)志物,從而提高線粒體病的診斷效率。