楊 平,龔建民,梁 軍,嚴 虹

(1. 南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院 a.檢驗科,b.風濕免疫科,江蘇 南京 210008;2. 長江大學生命科學學院,湖北 荊州 434025;3. 南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心,江蘇 南京 210011)

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以全身性炎癥和關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形為主要特征的自身免疫性疾病,并且可累及到肺部、心臟和眼睛等關(guān)節(jié)外器官[1]。目前臨床用于RA診斷的實驗室指標主要是抗瓜氨酸蛋白抗體(anti-citrullinated protein antibody,ACPA)和類風濕因子[2](rheumatoid factor,RF)。RF在70%～80%的RA患者中均可檢測到,但其特異性較低[3];ACPA則更具有特異性,通常與RF同時升高[4]。然而,據(jù)報道仍有15%～25%的RA患者的兩類抗體均陰性[5],這無疑對臨床醫(yī)生的診療提出了挑戰(zhàn),尤其是在早期鑒別階段。更重要的是,ACPA陰性RA與ACPA陽性RA從病因、病理到疾病免疫微環(huán)境都有所不同[6～8]。因此,探尋RA新型標志物鑒定不僅對RA的早期識別至關(guān)重要,而且有助于揭示RA潛在的致病機制。新近表觀遺傳學研究表明微小RNA(microRNA,miRNA)與RA的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[9～11]。外泌體是細胞來源的直徑約為30～100 nm的具有膜結(jié)構(gòu)的微囊泡,可以介導體內(nèi)細胞間的遠程通訊,其中間充質(zhì)干細胞來源的外泌體被報道可以用于RA的治療[12]。外泌體也是循環(huán)miRNA的重要載體,可有效保護miRNA免受降解。然而,關(guān)于外泌體miRNA是否能夠作為RA診斷的標志物以及如何參與RA的發(fā)病尚不明確。因此,本研究擬通過對RA患者血清外泌體進行小RNA測序篩選結(jié)合大樣本qPCR進行驗證,初步探討外泌體miRNA在RA診療中的潛在臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2021年2月至2022年6月在南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院風濕免疫科就診的RA患者132例,其中男31例,女101例。RA患者全部符合美國風濕病學會及歐洲抗風濕病聯(lián)盟(ACR/EULAR)2010年共同修訂的RA診斷標準。選擇同期來院體檢健康志愿者127例為對照組(HC組),其中男25例,女102例,排除糖尿病、惡性腫瘤以及其他自身免疫性疾病。兩組間年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。RA患者和對照組各選擇24例作為訓練集,剩余108例RA患者和103例對照組作為測試集;同時收集10例正常體檢患者,14例RA患者,10例強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)患者,12例系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)患者,11例銀屑病關(guān)節(jié)炎(psoriatic arthritis, PsA)患者用于小RNA標志物的特異性分析。同時,收集了9例嚴格入組的經(jīng)甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)穩(wěn)定劑量治療的成年活動性類風濕關(guān)節(jié)炎患者,分別檢測其治療前基線水平和治療后第29天的血清外泌體miRNA水平。收集RA患者腫脹關(guān)節(jié)數(shù)(tender joint count,TJC28)、疼痛關(guān)節(jié)數(shù)(swollen joint count,SJC28)、疾病活動評分(disease activity score,DAS28)-CRP、DAS28-ESR、患者總體評價,根據(jù)美國風濕病學會(ACR)改善標準對RA患者治療的臨床效果進行評估。本研究經(jīng)南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院倫理委員會審核批準(項目編號:2021-280-01)。

表1 RA組和HC組一般臨床資料比較

1.2 樣本采集與檢測方法所有受試者均空腹靜脈采血,ESR檢測用枸櫞酸鈉抗凝管,其余項目用帶分離膠血清管,以3000×g相對離心力的速度離心10 min,分離血清,所收標本放于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.3 外泌體RNA提取以及小RNA測序分析

1.3.1外泌體分離 使用Exo-Quick-TCTM、Total Exosome Isolation(Invitrogen)試劑盒獲得外泌體。根據(jù)試劑盒提供說明嚴格進行以下步驟:將血清16000 g離心30 min取上清,將血清與沉降試劑按照5∶1的比例進行混勻,置于冰上孵育30 min,10000 g離心10 min即可獲得外泌體沉淀,接著用純凈的PBS溶液重懸外泌體。

1.3.2外泌體表征及RNA提取 使用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察外泌體形態(tài),使用粒徑分析儀(Zetaview)分析外泌體粒徑分布,最后通過蛋白印跡(western blot,WB)鑒定外泌體膜特異性蛋白。使用Trizol裂解法提取外泌體總RNA,具體步驟如下:向外泌體中加入1 ml Trizol(Invitrogen),充分混勻,靜置5 min;加入200 μl氯仿,充分混勻,于4 ℃靜置7 min;16000 g離心20 min,取上清,加入等體積異丙醇,-20 ℃沉淀過夜;4 ℃ 16000 g離心20 min,棄上清;加入1 ml 75%乙醇,4 ℃ 16000 g離心20 min,棄上清,倒置晾干,使用ddH2O重懸,即可得外泌體總RNA。

1.3.3miRNA高通量測序及篩選 使用Qubit熒光計和瓊脂糖電泳檢測RNA樣本的濃度和純度,將外泌體RNA送至華大基因公司進行測序。測序包括RNA樣本添加3’和5’端接頭、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴增、選擇合適大小文庫、文庫定量和上機測序,所用的測序儀器為Illumina二代測序系統(tǒng)。接著過濾測序數(shù)據(jù),刪除重復和缺失,與數(shù)據(jù)庫進行比對,使用R語言等生物信息學工具進行分析和注釋,選取差異表達的miRNA進行后續(xù)的臨床樣本驗證。

1.4 RT-PCR分析miRNA的檢測主要包括逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR兩個步驟,選用的是在miRNA研究領(lǐng)域較成熟的莖環(huán)引物進行試驗。首先使用miRNA design軟件設(shè)計miRNA逆轉(zhuǎn)和定量引物,使用miRNA 1stcDNA Synthesis Kit(南京諾唯贊生物)試劑盒合成cDNA,再用miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物)試劑盒進行定量PCR。以上所有樣本的定量檢測均在BIO-RAD CFX96 PCR儀(美國伯樂公司)上完成。

1.5 統(tǒng)計學方法采用GraphPad Prism8.0及SPSS 24.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示,組間比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法;非正態(tài)分布的計量資料用M(P25,P75)表示,組間比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗;使用Pearson相關(guān)分析相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異表達的外泌體miRNA并進行小樣本初篩根據(jù)∣log2 FC∣>2,P<0.05的標準對測序原始數(shù)據(jù)進行分析,篩選出8個在RA組低表達的miRNA,在24對RA患者和健康患者中進行初步驗證,發(fā)現(xiàn)miR-11400在RA組中顯著低表達(P<0.05)。見表2。

表2 RA組低表達外泌體miRNA標志物的篩選

2.2 對外泌體miR-11400進行大樣本驗證和診斷效能評估對鑒定出的關(guān)鍵miR-11400在大樣本隊列(103例HC健康志愿者,108例RA患者)中進行驗證,ROC曲線下面積為0.7546(圖1a)。將miR-11400進一步在ACPA陰性RA患者中進行驗證,發(fā)現(xiàn)仍然保持極佳的診斷效能,ROC曲線下面積為0.9778(圖1b)。

圖1 外泌體miR-11400的大樣本驗證和診斷效能分析 a:大樣本隊列;b:ACPA陰性RA患者

2.3 外泌體miR-11400與RA臨床指標的相關(guān)性分析RA組血清外泌體miR-11400水平與CCP、CRP、MCV和RF均呈負相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 外泌體miR-11400與臨床指標的相關(guān)性分析

2.4 外泌體miR-11400在其他自身免疫性疾病中的特異性分析與HC組比較,外泌體miR-11400只在RA組特異性低表達(P<0.01),而在AS組、SLE組及PsA組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 外泌體miR-11400在其他自身免疫性疾病中的特異性分析

2.5 外泌體miR-11400在RA患者療效觀察中的價值入組9例連續(xù)口服(MTX)穩(wěn)定劑量(每周劑量7.5～25 mg)治療的活動性RA患者,觀察其治療前基線水平以及第29天(Day 29)的血清外泌體miRNA表達量的變化。結(jié)果表明,經(jīng)MTX治療后第29天外泌體miR-11400表達量呈上升趨勢,同時TJC28、SJC28和DAS28-CRP評分均顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 活動性RA患者MTX治療前后臨床指標比較 (n=9)

2.6 miR-11400可能的機制和信號通路分析采用KEGG分析發(fā)現(xiàn)miR-11400主要富集在促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路,而MAPK信號通路與RA的發(fā)病機制密切相關(guān)。見圖3。

圖3 miR-11400的生物信息學分析

3 討論

RA疾病異質(zhì)性強,發(fā)病機制尚不明確,目前認為其發(fā)病可能與家族遺傳、自身免疫、腸道菌群、表觀遺傳等有關(guān)[12～14]。北京協(xié)和醫(yī)院張烜教授在國際上首次報道其團隊通過蛋白芯片技術(shù)在累計長達8年收集的上千例標本中篩選出抗PTX3和抗DUSP11兩種新型自身抗體可作為ACPA陰性類風濕關(guān)節(jié)炎的診斷標志物,同時還闡述了抗PTX3和抗DUSP11自身抗體在細胞焦亡和炎性因子風暴中的致病機制[15,16]。北京大學人民醫(yī)院栗占國教授團隊通過一項涉及3262名參與者的訓練和驗證隊列的大規(guī)模的多中心研究發(fā)現(xiàn),RA患者的血清可溶性清道夫受體A(soluble scavenger receptor,sSR-A)水平顯著升高,并且與該疾病的臨床和免疫學特征呈正相關(guān)。sSR-A被證實可以用于RA的診斷,尤其是對早期和血清陰性RA的診斷,同時還揭示了靶向sSR-A可能是一種新的RA治療策略[17]。然而,這些指標均僅限于科研層面,目前RA的血清診斷主要依據(jù)RF和CCP,臨床上仍有部分患者在發(fā)病初期甚至患病多年仍缺乏有效生物標志物進行檢測,給臨床診斷和治療帶來困難。因此,尋找新型的標志物用于RA的診斷和預后具有十分重要的臨床意義。

近年來,循環(huán)miRNA標志物與類風濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)系得到廣泛關(guān)注,其動態(tài)變化與RA的發(fā)病易感性、發(fā)病機制、診斷、治療干預及預后密切相關(guān)[11,18]。外泌體不僅可以保護循環(huán)miRNA免受降解,同時可以通過運輸各種蛋白質(zhì)和非編碼RNA,在細胞間通信中發(fā)揮重要作用[19～21]。本研究首次發(fā)現(xiàn)了一種在RA患者血清低表達的外泌體miR-11400標志物,在鑒別RA組和HC組的ROC曲線下面積為0.7546(95%CI為0.6874～0.8217),并且在ACPA陰性的RA中也具備極佳的診斷效能(AUC為0.9978,95%CI為0.9468～1.000)。然后,通過spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)外泌體miR-11400與RA患者的臨床指標CCP、RF、CRP和MCV均呈負相關(guān),其中與MCV相關(guān)性最好,CCP次之,最后是RF和CRP。進一步特異性分析表明,外泌體miR-11400只在RA組特異性低表達,而在AS組、SLE組以及PsA組與HC組比較差異無統(tǒng)計學意義。以上數(shù)據(jù)表明,外泌體miR-11400可能與RA的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),具有很好的臨床價值。

MTX是目前治療類風濕關(guān)節(jié)炎最為經(jīng)典的一線藥物,各國指南中均推薦首選單用MTX作為治療藥物[22]。本研究對9例經(jīng)MTX穩(wěn)定劑量治療的成年活動性RA患者進行用藥前基線水平以及用藥后第29天血清外泌體miR-11400表達量進行分析,發(fā)現(xiàn)其在治療后第29天表達量逐漸增高,同時TJC28、SJC28和DAS28-CRP評分均顯著降低,癥狀趨于好轉(zhuǎn),這也表明外泌體miR-11400在一定程度上可以用于輔助風濕科醫(yī)師評估RA的治療效果。更為重要是,通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)miR-11400主要可能靶向MAPK信號通路,而MAPK信號通路是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一,是正常條件和病理條件下應(yīng)激反應(yīng)以及細胞增殖、分化、細胞凋亡的關(guān)鍵信號通路,并且被大量文獻報道可能參與RA的發(fā)病機制[23～25]。因此,提示miR-11400有可能通過調(diào)控MAPK信號通路參與RA的發(fā)病,并有可能成為RA治療中的新的靶點。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)了miR-11400是一種低表達于RA患者的血清外泌體miRNA,其不僅可以用于RA的診斷,同時可以用于RA治療過程中的動態(tài)監(jiān)測,具有很好的潛在臨床應(yīng)用價值。同時,通過生物信息學分析揭示了外泌體miR-11400可能通過靶向MAPK信號通路參與RA的發(fā)病進程,有望成為RA治療的新的靶點。然而,本次研究未能夠?qū)θ縍A患者進行DAS-28評分以及相關(guān)影像學的跟蹤,因此在后續(xù)的研究中將詳細完善評分和關(guān)節(jié)超聲、影像學檢查用于更精準地評估患者的活動性。本研究的局限性還在于雖然樣本量較大,但仍屬于單中心、單藥物臨床數(shù)據(jù)研究,可能存在選擇性、地域性偏倚。因此,在后續(xù)的研究中仍需進行跨區(qū)域、多中心合作,同時在不同RA治療方案中的場景下去建立療效評估模型,以期能夠?qū)⑼饷隗wmiR-11400應(yīng)用于RA患者的臨床診斷和預后評估中去,更好發(fā)揮其潛在的臨床應(yīng)用價值。最后,國內(nèi)外當前有關(guān)外泌體檢測標準化工作尚處于實驗室研究階段,其分離富集方法、技術(shù)操作規(guī)范、質(zhì)量控制以及檢測結(jié)果的一致性和準確性尚待解決[26,27]。外泌體檢測真正進入臨床應(yīng)用,仍需提高檢測技術(shù)的靈敏度和特異性;實現(xiàn)樣本采集系統(tǒng)和分析步驟等的標準化;通過多中心臨床試驗來綜合評價檢測的臨床效果。相信隨著新興技術(shù)的不斷涌現(xiàn)和發(fā)展,以及廣大檢驗同仁和科研工作者的不懈努力,外泌體相關(guān)標志物研究必將在檢驗領(lǐng)域發(fā)揮一定的臨床應(yīng)用價值。