林曉宇,王傳新,杜魯濤

(1.山東大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心,山東 濟(jì)南 250033;2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心,山東 濟(jì)南 250012)

結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)病率在惡性腫瘤中位居第三位,死亡率位居第二位[1]。預(yù)計(jì)到2030年,結(jié)直腸癌的全球負(fù)擔(dān)增加60%,將有約220萬例結(jié)直腸癌新發(fā)病例和110萬例結(jié)直腸癌死亡病例[2]。結(jié)直腸癌患者的生存率與其確診時(shí)分期密切相關(guān),I期結(jié)直腸癌患者的5年生存率約為91%,而IV期結(jié)直腸癌患者的5年生存率僅為14%左右[3, 4]。結(jié)直腸癌的早期篩查和診斷可以顯著降低其發(fā)病率和死亡率[5]。目前結(jié)腸鏡檢查是結(jié)直腸癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但由于操作具有侵襲性,檢查成本較高,且需要提前腸道準(zhǔn)備等,其用于結(jié)直腸癌早期篩查的人群依從率較低[6]。因此,迫切需要開發(fā)新的準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、簡便易行的結(jié)直腸癌早期篩查手段。表觀遺傳修飾在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[7]。DNA甲基化是目前研究最多,也是基因組最豐富和最廣泛的一種表觀遺傳修飾,其主要發(fā)生在惡性腫瘤的早期階段,這種遺傳修飾改變可以作為腫瘤的早期分子事件提示腫瘤的發(fā)生。結(jié)直腸癌細(xì)胞主要表現(xiàn)出兩種不同的DNA甲基化模式的改變,一種是全基因組的低甲基化,另一種是特定基因啟動(dòng)子的高甲基化[8, 9]。近年來,隨著對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展階段中DNA甲基化模式等表觀遺傳修飾的深入了解以及新型分子診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步,血液、糞便、尿液和腸道灌洗液等人體生物樣本中的DNA甲基化等作為結(jié)直腸癌早期篩查和診斷的生物標(biāo)志物的潛能逐漸受到臨床關(guān)注。這種新型表觀遺傳修飾標(biāo)志物具有樣本采集簡便、無創(chuàng)和風(fēng)險(xiǎn)較小等諸多優(yōu)點(diǎn),有望成為下一代結(jié)直腸癌早期篩查和診斷的新型檢測靶點(diǎn)。本文將系統(tǒng)總結(jié)不同來源樣本中DNA甲基化生物標(biāo)志物在結(jié)直腸癌應(yīng)用中的最新進(jìn)展,為后續(xù)結(jié)直腸癌早期篩查和診斷新技術(shù)的研發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考。

1 血液樣本DNA甲基化在結(jié)直腸癌早期診斷中的作用

研究表明,血液中異常的DNA甲基化可能是結(jié)直腸癌早期篩查和診斷的潛在生物標(biāo)志物(表1)。SEPT9是研究最廣泛的結(jié)直腸癌單一甲基化標(biāo)志物,Epi proColon是目前唯一獲得FDA批準(zhǔn)用于結(jié)直腸癌篩查的血液檢測,已在臨床上使用近10年[10]。有結(jié)果顯示,與健康對照者相比,結(jié)直腸癌患者組織和血液樣本中SEPT9甲基化水平顯著升高。Wu等研究顯示,血漿樣本中SEPT9甲基化檢測對結(jié)直腸癌診斷的敏感性為76.6%,特異性為95.9%[11],然而SEPT9甲基化對早期結(jié)直腸癌和晚期腺瘤檢測的敏感性相對較低[12]。Fu等研究表明,結(jié)直腸癌患者血漿SEPT9甲基化的陽性率與腫瘤大小、組織學(xué)分級和一般組織學(xué)類型相關(guān)(P<0.05)。術(shù)前和術(shù)后血漿SEPT9甲基化狀態(tài)的改變反映了手術(shù)對結(jié)直腸癌患者的治療效果,提示SEPT9甲基化在評價(jià)結(jié)直腸癌治療效果和監(jiān)測復(fù)發(fā)方面具有重要的應(yīng)用潛力[13]。Takane等研究發(fā)現(xiàn),在血漿樣本中,81%的結(jié)直腸癌患者PPP1R3C被甲基化,只有19%的非癌癥患者PPP1R3C被甲基化,PPP1R3C和EFHD1聯(lián)合檢測可以提高對結(jié)直腸癌診斷的敏感性和特異性[14]。KCNJ12和ZNF132是兩種新型的用于結(jié)直腸癌診斷的甲基化標(biāo)志物,檢測結(jié)直腸癌的敏感性分別為62.4%和56.3%,特異性為88.7%和97.2%,與其他標(biāo)志物聯(lián)合檢測可以進(jìn)一步提高診斷的敏感性和特異性[10]。Luo等研究發(fā)現(xiàn),在高危人群中,血漿樣本中cg10673833甲基化檢測對結(jié)直腸癌診斷的敏感性為89.7%,特異性為86.8%,進(jìn)一步結(jié)果顯示,其對晚期癌前病變的敏感性為33.3%,略高于SEPT9在檢測癌前病變方面的敏感性[15]。

表1 血液樣本DNA甲基化對CRC的早期診斷

然而,單一甲基化位點(diǎn)的診斷能力比較有限,研究人員嘗試建立基于多個(gè)不同甲基化位點(diǎn)的診斷模型,用于結(jié)直腸癌的早期檢測。有研究選擇了三個(gè)特異性DNA甲基化標(biāo)記物——C9orf50、KCNQ5和CLIP4作為新的診斷模型,以上標(biāo)志物都可以獨(dú)立區(qū)分結(jié)直腸癌患者和健康個(gè)體的血漿,當(dāng)三者聯(lián)合檢測時(shí)能夠達(dá)到85%的敏感性和99%的特異性[16]。Bartak等利用SFRP1、SFRP2、SDC2和PRIMA1構(gòu)建聯(lián)合診斷模型,結(jié)果顯示該模型診斷結(jié)直腸癌的敏感性為91.5%,特異性為97.3%,診斷腺瘤的敏感性為89.2%,特異性為86.5%[17]。以上研究表明,DNA甲基化模式的改變在結(jié)直腸腺瘤階段就可以觀察到,且具有比較高的敏感性和特異性,提示DNA甲基化可用于癌前病變的早期診斷。

2 糞便樣本DNA甲基化在結(jié)直腸癌早期診斷中的作用

在結(jié)直腸癌發(fā)生過程中,結(jié)腸或直腸腔內(nèi)出現(xiàn)脫落腫瘤細(xì)胞的時(shí)間要早于腫瘤細(xì)胞開始侵犯血管,因此在結(jié)直腸癌早期篩查中糞便樣本比血液樣本更有優(yōu)勢[18]。隨糞便排出的腫瘤細(xì)胞中含有的異常DNA遺傳學(xué)改變可以作為結(jié)直腸癌早期診斷的潛在生物標(biāo)志物(表2)。Han等為了評價(jià)糞便樣本中SDC2甲基化檢測對結(jié)直腸癌診斷的性能,招募了634名受試者,結(jié)果顯示SDC2甲基化檢測結(jié)直腸癌,與腫瘤分期、位置、性別、年齡等無關(guān)的總體敏感性為90.2%,特異性為90.2%,檢測早期階段(0～Ⅱ期)結(jié)直腸癌的敏感性為89.1%[19]。另一項(xiàng)研究結(jié)果顯示,SDC2甲基化是目前發(fā)現(xiàn)的較好的單一基因甲基化標(biāo)志物,其糞便甲基化檢測的敏感性為83.1%,特異性為91.2%[20]。TFPI2甲基化是人類結(jié)直腸癌中的常見事件,Zhang等研究發(fā)現(xiàn)糞便樣本中TFPI2甲基化對于結(jié)直腸癌檢測的敏感性為68.3%,特異性為100%[21, 22],聯(lián)合SDC2甲基化檢測能夠提高對結(jié)直腸癌和腺瘤診斷的敏感性[23]。Liu等研究發(fā)現(xiàn)了糞便樣本中4個(gè)最佳標(biāo)志物——COL4A1、COL4A2、TLX2和ITGA4,以上標(biāo)志物檢測結(jié)直腸癌的敏感性為82.5%～92.5%,檢測腺瘤(≥1cm)的敏感性為41.6%～58.4%,特異性為88.0%～96.4%,是結(jié)直腸癌早期診斷中潛在價(jià)值較高的標(biāo)志物[24]。

表2 糞便樣本DNA甲基化對CRC的早期診斷

與糞便樣本中單基因甲基化標(biāo)志物相比,多基因聯(lián)合檢測具有更大的優(yōu)勢。Cologuard作為FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)用于多種生物標(biāo)志物檢測的方法,包括對KRAS突變、異常NDRG4和BMP3甲基化、β-actin定量分子分析以及血紅蛋白免疫分析的檢測,具有較高的敏感性和特異性,它檢測結(jié)直腸癌和晚期癌前病變的敏感性分別為92.3%和42.4%,特異性為89.8%[25]。2018年,Cologuard被納入ACS更新的結(jié)直腸癌篩查指南[26]。Zhao等研究發(fā)現(xiàn),相比于單獨(dú)檢測SEPT9或SDC2甲基化,糞便ColoDefense檢測對診斷結(jié)直腸癌顯示出更高的敏感性和特異性,分別為90.4%和91.9%,未來有可能成為一種低成本、方便、高效的結(jié)直腸癌早期檢測工具[27]。有研究顯示,在糞便樣本中使用COL4A2和TLX2甲基化組合能夠檢測到91.3%的結(jié)直腸癌和51.9%的晚期腺瘤,特異性為97.6%,這為糞便DNA檢測提供了更準(zhǔn)確的甲基化標(biāo)志物[24]。

3 尿液樣本DNA甲基化在結(jié)直腸癌早期診斷中的作用

循環(huán)腫瘤細(xì)胞DNA通過腎小球過濾經(jīng)尿液排出,使尿液分析成為一種真正無創(chuàng)的癌癥檢測方法。目前關(guān)于尿液樣本中DNA甲基化檢測用于結(jié)直腸癌早期診斷的研究相對較少,但尿液作為一種生物液體,有其獨(dú)特的優(yōu)勢。Xiao等在76例結(jié)直腸癌病例中開展研究,發(fā)現(xiàn)有55例尿液樣本NDRG4甲基化檢測為陽性,特異性為85%,提示NDRG4甲基化可以作為尿液樣本中用于結(jié)直腸癌診斷的候選生物標(biāo)志物[28]。2021年,Bach等通過分析尿液中腫瘤來源的DNA甲基化片段來評估其檢測結(jié)直腸癌的可行性,對92例結(jié)直腸癌患者和63例健康對照者的尿液樣本進(jìn)行DNA甲基化分析,結(jié)果顯示SEPT9作為結(jié)直腸癌檢測的潛在尿液生物標(biāo)志物顯示出較好的準(zhǔn)確性。與健康對照者相比,結(jié)直腸癌患者尿液上清液中SEPT9甲基化水平顯著升高(P<0.0001),SEPT9和SDC2組成的聯(lián)合診斷模型能夠檢測到尿液上清液中高達(dá)70%的結(jié)直腸癌病例,特異性為86%[29]。以上研究表明,尿液樣本DNA甲基化為結(jié)直腸癌無創(chuàng)篩查提供了一種具有應(yīng)用潛力的工具。

4 腸道灌洗液樣本DNA甲基化在結(jié)直腸癌早期診斷中的作用

結(jié)直腸癌患者的腸道灌洗液(BLF) 中含有許多脫落的腫瘤細(xì)胞,這為腸道灌洗液中DNA甲基化標(biāo)志物用于結(jié)直腸癌篩查和診斷提供了可行性[30,31]。2018年,Park等從結(jié)直腸腫瘤患者和健康個(gè)體中共收集了190例腸道灌洗液樣本,檢測其中SDC2甲基化的情況,結(jié)果顯示SDC2甲基化檢測結(jié)直腸癌和絨毛狀腺瘤的敏感性分別為80.0%和64.7%,特異性為88.9%[32]。上述研究表明,SDC2甲基化是癌前病變中常見的表觀遺傳修飾,并在腸道灌洗液樣本中顯示出具有診斷結(jié)直腸腫瘤的潛力。但是腸道灌洗液的效用依賴于成功的腸道準(zhǔn)備,殘余糞便等因素可能會(huì)對腫瘤來源的DNA甲基化檢測產(chǎn)生干擾。因此,與其他需要進(jìn)行腸道準(zhǔn)備的結(jié)直腸癌檢查方法進(jìn)行結(jié)合,可以提高腸道灌洗液樣本DNA甲基化檢測的應(yīng)用效果。

5 結(jié)語

綜上,目前DNA甲基化標(biāo)志物檢測作為結(jié)直腸癌一種非侵入性的檢測方法,在其早期篩查和診斷方面具有廣闊的前景和巨大的臨床應(yīng)用潛力。同時(shí),DNA甲基化標(biāo)志物檢測也面臨著諸多挑戰(zhàn),例如,不同樣本中的DNA甲基化標(biāo)志物的檢測結(jié)果有時(shí)與結(jié)直腸癌組織中甲基化模式表現(xiàn)不一致;高質(zhì)量的腸道灌洗液樣本依賴于良好的腸道準(zhǔn)備,殘余糞便可能會(huì)對檢測結(jié)果造成一定程度的影響;以及尿液樣本和腸道灌洗液樣本的DNA甲基化用于結(jié)直腸癌早期診斷的大規(guī)模隊(duì)列研究和應(yīng)用較少等。因此,新型DNA甲基化標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、DNA甲基化檢測新技術(shù)的研發(fā)及標(biāo)志物檢測的質(zhì)量控制等仍需進(jìn)一步的探索。