賀紫微,王迪,楊賢慶*,陳勝軍,趙永強(qiáng),戚勃,相歡

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306)2(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州,510300)3(大連工業(yè)大學(xué),海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,遼寧 大連,116034)

龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis),又名海發(fā)菜、線菜、屬于紅藻門(Rhodophyta)江蘺科 (Gracilariaceae),是一種重要的產(chǎn)瓊膠類海藻,也是中國(guó)繼海帶、裙帶菜、紫菜之后的第四大栽培海藻[1],其原產(chǎn)地為山東,隨后在廣東、福建、海南等沿海省份養(yǎng)殖成功并大量栽培。2021年廣東省江籬產(chǎn)量高達(dá)45 138 t,占全國(guó)總量的12.23%,以龍須菜為代表的江蘺栽培已成為中國(guó)海藻栽培產(chǎn)業(yè)的重要支柱[2-3]。龍須菜在食品行業(yè)中的一個(gè)重要用途是提取瓊膠,瓊膠是由1,4-3,6內(nèi)醚-α-L-半乳糖和1,3-β-D-半乳糖交替連接而成的多糖鏈,同時(shí)含有少量的硫酸基團(tuán)[4],是目前世界上用途最廣泛的海藻膠(瓊膠、卡拉膠和海藻酸鈉)之一,由于其良好的凝膠特性,被廣泛用于食品、藥品和生化等領(lǐng)域[5-7]。

廣東沿海地區(qū)是我國(guó)龍須菜主要產(chǎn)地,由于收獲期炎熱多雨,農(nóng)戶倉儲(chǔ)設(shè)備簡(jiǎn)陋,遇高溫天氣時(shí)收獲堆積的龍須菜中心溫度可達(dá)50 ℃,且藻類作物在貯藏期間易受霉變,蟲蛀或其他污染物的干擾,極易發(fā)生品質(zhì)劣變,進(jìn)而影響其后續(xù)加工利用的經(jīng)濟(jì)效益,造成不可避免的經(jīng)濟(jì)損失[8]。因此,龍須菜在貯藏過程中的品質(zhì)保證至關(guān)重要。貯藏時(shí)間是影響海藻瓊膠品質(zhì)的重要因素,長(zhǎng)時(shí)間貯藏會(huì)促進(jìn)海藻多糖分子降解。FREILE-PELEGRN[9]曾報(bào)道過墨西哥尤卡坦州龍須菜瓊膠品質(zhì)會(huì)受到貯藏時(shí)間的負(fù)面影響。ROMERO等[10]對(duì)龍須菜采后貯藏31個(gè)月胞壁多糖的狀況進(jìn)行了研究,其結(jié)果也表明瓊膠的物理和結(jié)構(gòu)參數(shù)一般都隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。不僅如此,藻體水分含量、貯藏溫度增加也可能會(huì)加速瓊膠的降解過程[11]。張曦文等[12]探究了江籬在貯藏過程的瓊膠酶活性變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn)江籬采收及干燥后的水分含量是影響瓊膠提取得率和凝膠強(qiáng)度的關(guān)鍵因素。ARMISEN[13]研究發(fā)現(xiàn),水分含量低于20%且貯藏條件干燥良好下的石花菜貯藏期限可達(dá)10年,其瓊膠的產(chǎn)量和質(zhì)量與新鮮石花菜無異。海藻中的瓊膠降解程度會(huì)隨微生物的生長(zhǎng)繁殖或瓊膠降解酶活性的升高而加劇。近年來,朱思穎等[14]發(fā)現(xiàn)了腐敗龍須菜中存在瓊膠酶會(huì)使其自身發(fā)生水解,探究表明江籬瓊膠的水解與微生物作用密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)瓊膠類海藻中34%的菌株對(duì)瓊膠具有降解性,在微生物分泌的瓊膠酶降解作用下,瓊膠黏度顯著下降,凝固性降低,瓊膠的凝膠性質(zhì)改變[15-17]。

瓊膠的品質(zhì)可以通過其物理特性(如凝膠強(qiáng)度、凝膠脫水、黏度、凝膠和熔融溫度)和化學(xué)特性(如硫酸鹽和3, 6-內(nèi)醚半乳糖含量)反映。目前,關(guān)于海藻瓊膠的研究主要集中在海藻瓊膠的提取條件[18]、海藻種類[19]、海藻收獲季節(jié)[20]及環(huán)境參數(shù)[21]等因素對(duì)瓊膠的凝膠強(qiáng)度、凝膠脫水等品質(zhì)影響的方面,但海藻收獲后的貯藏條件對(duì)其瓊膠品質(zhì)的影響卻鮮有人探究。因此,本實(shí)驗(yàn)通過模擬龍須菜采收及晾干后的自然貯藏條件,探究在貯藏過程中的龍須菜瓊膠提取得率、凝膠強(qiáng)度、瓊膠酶活性、還原糖含量、菌落總數(shù)和各項(xiàng)理化性質(zhì)變化規(guī)律,明確瓊膠品質(zhì)變化與貯藏條件之間的內(nèi)在聯(lián)系,為合理貯藏龍須菜提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍須菜采于廣東汕頭,2021年9月收獲,經(jīng)過初步的除雜、晾干等處理,水分含量控制在12%～55%;實(shí)驗(yàn)用水為超純水;HCl、三氯乙酸、BaCl2、間苯二酚、乙縮醛、NaOH等,廣州化學(xué)試劑廠;以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4快速恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋,常州澳華儀器有限公司;CT-3質(zhì)構(gòu)儀,美國(guó)Brookfield公司;BS224S分析天平,美國(guó)Sartorius公司;AS20500/BDT超聲清洗機(jī),天津奧特賽恩斯儀器有限公司;Synergy全功能酶標(biāo)儀,美國(guó)BioTek公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 瓊膠的提取

預(yù)處理→堿處理→水洗Ⅰ→酸處理→水洗Ⅱ→過濾提膠→冷凍脫水→干燥

工藝流程參照文獻(xiàn)[22-23]的方法,要點(diǎn)如下。

堿處理:將干重10.0 g龍須菜投入裝有400 mL體積分?jǐn)?shù)25%的NaOH溶液的燒杯中,40 ℃水浴4 h。藻體質(zhì)量與堿用量比為1∶40 (g∶mL),用蒸餾水將藻體水洗3～4次至近中性。

酸處理:將水洗后的龍須菜投入裝有400 mL的HCl溶液(pH 1.5)中浸泡10 min,排去酸液,用蒸餾水將藻體水洗3～4次至近中性。

提膠:加200 mL蒸餾水于洗至中性的龍須菜中,煮制30 min,趁熱過200目紗布過濾。

冷凍脫水:將凝膠放置-20 ℃冰箱中冷凍,24 h后取出解凍脫水。

烘干和粉碎:分別將脫水后的瓊膠,置于50 ℃烘箱中烘干,粉碎。

1.3.2 瓊膠得率和凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

將水分含量為12%、25%、35%、45%和55%的龍須菜分別密封于保鮮袋中,再分別放置于10、20、30、40、50 ℃恒溫恒濕箱中模擬貯藏7 d,每組設(shè)置3個(gè)平行,測(cè)定經(jīng)處理后不同貯藏時(shí)期各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.2.1 得率測(cè)定

瓊膠得率按公式(1)計(jì)算:

(1)

1.3.2.2 凝膠強(qiáng)度測(cè)定

參照GB 1886.239—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 瓊脂》中規(guī)定的方法制備瓊膠凝膠,將瓊膠液體倒入直徑50 mm的玻璃培養(yǎng)皿中,冷凝后采用CT3質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定其凝膠強(qiáng)度(g/cm2)。測(cè)定方法和參數(shù):采用TA19圓柱探頭,測(cè)試類型破裂模式,測(cè)試速度0.5 mm/s,觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載5 g,測(cè)定5～7次取平均值。

1.3.3 瓊膠硫酸基含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取瓊膠樣品35.0 mg于50 mL容量瓶中,加10 mL 1 moL/L HCl溶液,100 ℃水浴3 h,冷卻后補(bǔ)齊至25 mL,并用濾紙過濾。按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法測(cè)吸收值(A1-A2),由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中硫酸基含量。

1.3.4 瓊膠3,6-內(nèi)醚半乳糖含量的測(cè)定

參考李龍等[25]的方法優(yōu)化后使用。準(zhǔn)確吸取果糖稀釋溶液(25 μg/mL) 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL的具塞試管中,用去離子水補(bǔ)至1.0 mL后蓋塞冰水浴5 min,分別加入5 mL間苯二酚溶液,置80 ℃恒溫水浴15 min后冰水浴冷卻,于554 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸收值。其中每點(diǎn)做3個(gè)平行樣品,取平均值。結(jié)果表明,果糖質(zhì)量濃度在0～25 mg/mL線性關(guān)系良好,所得回歸方程為:Y=0.024 4X+0.088 9(R2=0.996 4)。

準(zhǔn)確稱取瓊膠樣品25.0 mg于50 mL離心管中,加20 mL蒸餾水加熱溶解,冷卻后補(bǔ)齊至50 mL,按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法測(cè)吸收值,由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中3, 6-內(nèi)醚半乳糖含量。

1.3.5 瓊膠相對(duì)黏度的測(cè)定

參考問莉莉[26]的方法并稍作優(yōu)化。于30 ℃恒溫條件下,記1 mg/mL的糖液流經(jīng)烏氏黏度計(jì)的時(shí)間為t0。保持多糖濃度一致,記錄不同樣品糖液流經(jīng)烏氏黏度計(jì)的時(shí)間為t,糖液和溶劑水流經(jīng)時(shí)間的比值即為相對(duì)黏度ηr,如公式(2)所示:

(2)

1.3.6 龍須菜中菌落總數(shù)的測(cè)定

采用平板計(jì)數(shù)法,稱取25.0 g龍須菜樣品,放入225 mL無菌生理鹽水袋,均質(zhì)。參考GB 4789.2—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》中的方法檢測(cè)。

1.3.7 龍須菜中還原糖含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14,27]的方法優(yōu)化后使用。取樣品5.0 g于燒杯中,加入50 mL蒸餾水,置100 ℃水浴30 min,攪拌,真空抽濾,保存濾液。分別取濾液1.0 mL至3支10 mL離心管中,加入1.5 mL DNS溶液,沸水浴5 min,終止反應(yīng)后用蒸餾水定容至25 mL,于520 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸收值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖含量。

1.3.8 龍須菜中瓊膠酶活性的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14, 27]的方法,優(yōu)化后使用。取龍須菜樣品5.0 g于50 mL離心管中,加入磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4) 50 mL渦旋振蕩15 min,4 ℃下4 000 r/min離心20 min,取1.0 mL上清液與含2 g/L瓊膠的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)1.5 mL于新的離心管中,混勻后40 ℃反應(yīng)30 min后,加入1.5 mL DNS溶液,沸水浴5 min,終止反應(yīng)后用蒸餾水定容至25 mL,于520 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸收值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算瓊膠酶活性。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 21.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,每組實(shí)驗(yàn)做3次平行,結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,用Origin 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏條件對(duì)龍須菜瓊膠提取得率的影響

由圖1可知,相同貯藏時(shí)間和貯藏溫度下,龍須菜瓊膠提取得率隨著水分含量的增加而顯著減小(P<0.05),相同貯藏時(shí)間和水分含量下,龍須菜瓊膠提取得率隨著貯藏溫度的升高而顯著減小(P<0.05)。相對(duì)于貯藏溫度10 ℃,貯藏溫度50 ℃時(shí)水分含量對(duì)龍須菜瓊膠的提取得率的影響更顯著,相對(duì)于水分含量55%,水分含量12%時(shí)龍須菜瓊膠提取得率更高。這與張曦文等[12]對(duì)江籬瓊膠提取得率的研究結(jié)果具有相似性。在貯藏過程中,較高的水分含量和貯藏溫度會(huì)導(dǎo)致龍須菜提取的瓊膠得率明顯下降,結(jié)合不同貯藏條件下龍須菜中瓊膠酶活性的變化和還原糖含量變化,推測(cè)在適宜微生物生長(zhǎng)的貯藏條件下,微生物大量繁殖,分泌瓊膠酶、纖維素酶及其他酶致使藻體軟化,在提取過程中瓊膠更易溶于堿液,導(dǎo)致水洗時(shí)膠質(zhì)不同程度的流失,得率下降。

2.2 貯藏條件對(duì)龍須菜瓊膠凝膠強(qiáng)度的影響

由圖2可知,相同貯藏時(shí)間和貯藏溫度下,龍須菜瓊膠凝膠強(qiáng)度隨著水分含量的增加而減小,相同貯藏時(shí)間和水分含量下,龍須菜瓊膠凝膠強(qiáng)度隨著貯藏溫度的升高而減小。相對(duì)于貯藏溫度10 ℃,貯藏溫度50 ℃時(shí)水分含量對(duì)龍須菜瓊膠凝膠強(qiáng)度的影響更顯著,相對(duì)于水分含量55%,水分含量12%時(shí)龍須菜瓊膠凝膠強(qiáng)度更高。ROMERO等[10]和FREILE-PELEGRN等[11]曾報(bào)道,貯藏過程中,貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)和水分含量的增加對(duì)藻類瓊膠凝膠強(qiáng)度有消極影響。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),還原糖含量與瓊膠酶活性高的龍須菜樣品,所提取的瓊膠凝膠強(qiáng)度普遍較低,對(duì)凝膠強(qiáng)度有顯著性差異的瓊膠樣品進(jìn)行黏度檢測(cè),通過相對(duì)黏度反映分子質(zhì)量大小,其結(jié)果表明凝膠強(qiáng)度與黏度之間呈極顯著正相關(guān),多糖分子質(zhì)量的差異可能是導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度變化的主要原因?？梢酝茰y(cè)在貯藏過程中海藻瓊膠發(fā)生了降解,瓊膠分子鏈斷裂,分解為沒有凝固性能的小分子,還原糖含量增加,3, 6-內(nèi)醚半乳糖含量減少,瓊膠凝膠強(qiáng)度降低。

a-1 d;b-3 d;c-5 d;d-7 d圖2 不同水分含量及不同貯藏時(shí)間下貯藏溫度對(duì)凝膠強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of storage temperature on gel strength under different moisture content and storage time

2.3 貯藏條件對(duì)瓊膠理化性質(zhì)的影響

硫酸基含量、3, 6-內(nèi)醚半乳糖含量和相對(duì)黏度是瓊膠品質(zhì)的重要判斷指標(biāo)[28]。瓊膠的硫酸化程度與凝膠特性(凝膠強(qiáng)度、凝膠和熔融溫度)呈負(fù)相關(guān)性[29];3, 6-內(nèi)醚半乳糖含量越高,瓊膠凝膠能力越強(qiáng);相對(duì)黏度越大,瓊膠凝膠性能越好[30-31]。由表1～表3可知,貯藏溫度保持恒定,在相同水分含量下,龍須菜瓊膠的硫酸基含量隨著貯藏時(shí)間的增加呈現(xiàn)增加趨勢(shì),3, 6-內(nèi)醚半乳糖含量隨著貯藏時(shí)間的增加呈現(xiàn)減小趨勢(shì)。相同貯藏時(shí)間下,龍須菜瓊膠的硫酸基含量隨著水分含量的增加呈現(xiàn)增加趨勢(shì),3, 6-內(nèi)醚半乳糖含量隨著水分含量的增加呈現(xiàn)減小趨勢(shì)。ROMERO等[10]和FREILE-PELEGRN等[11]的報(bào)道中,多糖分子質(zhì)量的減少被認(rèn)為是貯藏6個(gè)月后海藻瓊膠凝膠品質(zhì)下降的主要原因,在本試驗(yàn)中,瓊膠的相對(duì)黏度隨著貯藏時(shí)間和水分含量的增大呈現(xiàn)減小趨勢(shì),可以推測(cè)出,高水分含量加速了龍須菜瓊膠的降解。

表1 10 ℃貯藏下不同水分含量龍須菜的理化性質(zhì) Table 1 Physical and chemical properties of G.lemaneiformis with different moisture content at stored 10 ℃

表2 30 ℃貯藏下不同水分含量龍須菜的理化性質(zhì)Table 2 Physical and chemical properties of G.lemaneiformis stored at 30 ℃

2.4 貯藏條件對(duì)菌落總數(shù)的影響

由圖3可知,龍須菜在不同水分含量和貯藏溫度貯藏過程中菌落總數(shù)的變化。由圖3-a可知,水分含量12%時(shí),貯藏溫度和貯藏時(shí)間對(duì)龍須菜菌落總數(shù)影響不明顯;由圖3-b和圖3-c可知,水分含量35%和55%條件下,菌落總數(shù)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而上升,且不同貯藏溫度下,菌落總數(shù)從高到低順序?yàn)?0 ℃>50 ℃>10 ℃。龍須菜附生菌在適宜的生長(zhǎng)條件下大量繁殖,分泌瓊膠酶,導(dǎo)致瓊膠降解[32-34]。

2.5 貯藏條件對(duì)龍須菜中還原糖含量的影響

由圖4可知,龍須菜中還原糖含量受水分含量和貯藏溫度的影響。由圖4-a可知,水分含量12%時(shí),貯藏溫度和貯藏時(shí)間對(duì)龍須菜還原糖含量影響不明顯,當(dāng)水分含量增加至35%和55%時(shí),由圖4-b和圖4-c可知,任意時(shí)刻下,30 ℃和50 ℃條件下龍須菜還原糖含量均比10 ℃條件下的龍須菜還原糖含量高,龍須菜中還原糖含量隨貯藏溫度和貯藏時(shí)間的增加而顯著升高(P<0.05)。這些發(fā)現(xiàn)與朱思穎等[14]利用腐爛龍須菜水解生產(chǎn)瓊膠寡糖的實(shí)驗(yàn)中還原糖變化趨勢(shì)一致。在貯藏過程中,內(nèi)源性或微生物來源的酶引起瓊膠水解、多糖鏈斷裂,導(dǎo)致還原糖含量顯著升高,且這與產(chǎn)瓊膠酶的微生物生長(zhǎng)繁殖以及酶活性發(fā)揮的最適溫度和水分含量有關(guān)。

a-12%;b-35%;c-55%圖4 不同水分含量下貯藏溫度對(duì)還原糖的影響Fig.4 Effect of storage temperature on reducing sugar under different moisture content

2.6 貯藏條件對(duì)龍須菜中瓊膠酶活性的影響

由圖5可知,龍須菜中瓊膠酶活性受水分含量和貯藏溫度的影響。由圖5-a可知,水分含量12%時(shí),貯藏溫度和貯藏時(shí)間對(duì)龍須菜瓊膠酶活力影響不明顯,可能的原因是,酶的表面需要一定量的水分子使酶催化底物的活性中心達(dá)到一定柔韌性的“開放”構(gòu)象[29],水分含量12%的藻體水分含量極低,活性中心均不易與底物分子結(jié)合,故無明顯變化。ARMISEN[13]的報(bào)告中,也曾說明干燥良好的江籬(含水量低于20%)可以儲(chǔ)存近10年,而不會(huì)損失產(chǎn)量或瓊膠品質(zhì)。由圖5-b可知,水分含量35%條件下,瓊膠酶活性隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)顯著上升(P<0.05),且貯藏溫度30和50 ℃條件下的瓊膠酶活性明顯高于10 ℃條件下的瓊膠酶活性;由圖5-c可知,水分含量55%條件下,貯藏溫度10和30 ℃條件下的瓊膠酶活性隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)顯著上升(P<0.05),貯藏溫度50 ℃條件下,隨著貯藏時(shí)間的增加,瓊膠酶活性呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì),酶活性在第5天達(dá)到最高。研究表明,貯藏過程中水分含量和貯藏溫度的變化對(duì)龍須菜瓊膠酶活性具有重要的影響。

a-12%;b-35%;c-55%圖5 不同水分含量下貯藏溫度對(duì)瓊膠酶活性的影響Fig.5 Effect of storage temperature on agarase activity under different water content

3 結(jié)論與討論

該研究以龍須菜為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,通過還原糖含量、瓊膠酶活性和菌落總數(shù)研究不同貯藏條件對(duì)龍須菜瓊膠得率、凝膠強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,貯藏過程中的貯藏溫度和水分含量對(duì)龍須菜瓊膠提取得率和瓊膠凝膠強(qiáng)度有顯著影響。藻體微生物大量繁殖,分泌瓊膠降解酶,導(dǎo)致瓊膠分子鏈斷裂,黏度下降,凝膠性能降低。結(jié)合現(xiàn)有研究現(xiàn)狀,綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出,龍須菜有效的前處理和貯藏技術(shù)能有效抑制微生物的活動(dòng),從而提高瓊膠得率和凝膠品質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)為龍須菜合理貯藏提供了科學(xué)依據(jù)。