張申奧，陳飛龍，陳 博，蘇亦鳴，陳紹興

（安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

嗜鹽微生物生活于高鹽環(huán)境中，如鹽湖、鹽礦、海洋曬鹽地、 鹽堿土壤以及海產(chǎn)品和一些鹽漬食品，屬于極端環(huán)境微生物的一種[1]。 它們中有些類群能合成生物可降解塑料，在生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境治理等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景[2-5]。 鹽漬食品是由新鮮蔬菜、瓜果、肉制品等經(jīng)腌制、發(fā)酵制成的風(fēng)味食品。嗜鹽菌在發(fā)酵過程中起到促進(jìn)作用。 目前，已在多種腌制、鹽漬食品或海產(chǎn)品等高鹽食品中分離鑒定出嗜鹽菌。 2010 年，陳學(xué)云等在鹽干帶魚中鑒定了多種耐鹽的葡萄球菌（Staphylococcus）[6]；同年，王宇等在腌制咸魚中分離到了一株中度嗜鹽菌，鑒定結(jié)果表明該菌隸屬于Halobacillus 屬[7]；2011 年，孫業(yè)盈等在蜢子蝦醬中分離純化鑒定了一株中度嗜鹽菌，定為鹽脫氮枝芽孢桿菌（Virgibacillus halodenitrificans）[8]；2012 年，呂彥等從蟹醬中分離出了一株中度嗜鹽菌，系統(tǒng)發(fā)育分析將3 株嗜鹽菌鑒定為葡萄球菌屬（Staphylococcus）中的3 個(gè)不同的種，分別為琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinus）、科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）和馬胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum）[9]。

高鹽食品中存在著大量的嗜鹽菌，嗜鹽菌的大量繁殖，可能會(huì)引發(fā)食品安全問題。 20 世紀(jì)90 年代，曾發(fā)生過嗜鹽菌污染食物導(dǎo)致中毒的事件。 因此對鹽漬食品中的嗜鹽菌的分離鑒定研究，是評價(jià)食品的安全性和防止嗜鹽菌污染食品的前期基礎(chǔ)[10]。另外，嗜鹽古菌是一類生活于極端高鹽環(huán)境的化能異養(yǎng)型原核微生物，其所分泌的胞外酶（外泌酶）具有在高鹽條件下仍能保持活性的特點(diǎn)，在制革工業(yè)、高鹽有機(jī)廢水處理和泡菜加工等腌制食品方面有重要用途[11]。 嗜鹽微生物分泌的蛋白酶、肽酶、堿性磷酸酶等不僅能夠促進(jìn)原料底物進(jìn)行分解及生物轉(zhuǎn)化，顯著縮短發(fā)酵周期，還能將肽和寡肽轉(zhuǎn)化為前體氨基酸從而形成海鮮調(diào)味品特有的風(fēng)味物質(zhì)，有利于海鮮調(diào)味品鮮美醇香氣味的形成[12]。例如，目前高鹽腌制食品生產(chǎn)的一個(gè)主要問題是發(fā)酵時(shí)間長。 有研究發(fā)現(xiàn)Halobacterium sp. SP1 的添加能加速魚露的發(fā)酵過程[13]，研究表明其分泌的胞外蛋白酶發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，經(jīng)蛋白酶作用產(chǎn)生的多肽和氨基酸不僅賦予了魚露豐富的營養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)對魚露的風(fēng)味和香氣也有著重要的提升[13]。另外，嗜鹽古菌胞外蛋白酶、 淀粉酶和酯酶分別在肽合成、調(diào)味劑和食品腌制、多不飽和脂肪酸生產(chǎn)等方面具有較廣泛的應(yīng)用價(jià)值[14]。

作者從市場中常見的高鹽食品中分離鑒定嗜鹽菌，并對其多樣性及相關(guān)胞外酶活性進(jìn)行研究，以期為高鹽食品中嗜鹽菌的群落結(jié)構(gòu)以及高鹽食品安全評價(jià)提供幫助。 挖掘高鹽食品中的嗜鹽微生物資源，以期找到高產(chǎn)胞外酶的嗜鹽菌株，為極端環(huán)境微生物資源的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

7 種高鹽食品：海蜒、蝦皮、海帶、什錦菜、醬油蜜瓜、寶塔菜和辣醬（圖1），均購于安徽省蕪湖市大潤發(fā)超市。 其中海蜒產(chǎn)自浙江寧波，蝦皮產(chǎn)自江蘇揚(yáng)州，海帶產(chǎn)自山東威海，什錦菜產(chǎn)自江蘇南京，醬油蜜瓜產(chǎn)自江蘇南京，寶塔菜產(chǎn)自江蘇南京，辣醬產(chǎn)自安徽蕪湖。

圖1 不同高鹽食品和嗜鹽微生物的分離Fig. 1 Salted-foods and culture-dependent isolation

1.2 嗜鹽微生物的分離與純化

1.2.1 培養(yǎng)基制備 分離高鹽食品中嗜鹽微生物的培養(yǎng)基為AS-168 培養(yǎng)基和NOM 培養(yǎng)基。 AS-168 培養(yǎng)基（組分g/L）：酸水解酪蛋白氨基酸5.0，酵母粉5.0，谷氨酸單鈉1.8，檸檬酸鈉3.0，MgSO4·7H2O 20.0，KCl 2.0，NaCl 200.0，F(xiàn)eCl2·4H2O 0.036，MnCl2·4H2O 0.0036；NOM 培養(yǎng)基（組分g/L）：酵母粉0.05，魚蛋白胨0.25，丙酮酸鈉1.0，KCl 5.4，CaCl20.29，NH4Cl 0.27，MgSO4·7H2O 26.8，MgCl2·6H2O 23，NaCl 184。 pH 調(diào)至7.5，1×105Pa 滅菌20 min。 配制固體培養(yǎng)基時(shí)，在滅菌前每升加入瓊脂粉15.0 g。

1.2.2 菌株的分離與純化 于超凈臺(tái)中收集海帶表面白色鹽霜于無菌試管中，加入5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% 的NaCl 溶液懸浮，在漩渦振蕩儀中混合5 min。吸取1 mL 混合液于1.5 mL EP 管中，并以此為原液，按照10-1、10-2和10-3進(jìn)行多梯度稀釋。 分別吸取200 μL 液體涂布于NOM（或者AS-168）培養(yǎng)基，隨后放入培養(yǎng)箱，37 ℃倒置培養(yǎng)。對于海蜒和蝦皮，超凈臺(tái)中取1 g 樣品于無菌研缽中碾成粉末，加入5 mL 滅過菌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% NaCl 溶液懸浮。后續(xù)操作同海帶。 對于辣醬、寶塔菜、什錦菜、醬油蜜瓜，直接吸取其鹽腌水（辣醬為油液）作為原液，其余操作同海帶。 培養(yǎng)10 d 后，挑取每個(gè)培養(yǎng)基上長出的不同類型的單菌落至新的固體培養(yǎng)基上劃線，繼續(xù)培養(yǎng)。 7 d 后，再次進(jìn)行平板劃線分離進(jìn)行菌株的進(jìn)一步純化。

1.3 基于16S rRNA 基因的初步分子鑒定

1.3.1 菌株P(guān)CR 擴(kuò)增模板DNA 的提取 水裂解法（適用于純水裂解型嗜鹽古菌）：挑取適量的菌體，懸入含有50 μL 滅菌的蒸餾水的離心管中。 使用漩渦振蕩儀充分振蕩混勻，12 000 r/min 離心3 min。收集上清液作為嗜鹽古菌PCR 擴(kuò)增所需的模板DNA。

酚-氯仿抽提法[15]（適用于嗜鹽細(xì)菌和純水不裂解型嗜鹽古菌）：采用相同的方法制備菌懸液，再用酚氯仿溶液（苯酚∶氯仿體積比1∶1，）抽提，12 000 r/min離心3 min；收集上清液，再用等體積的氯仿抽提，12 000 r/min 離心3 min；收集上清液作為嗜鹽細(xì)菌及純水不裂解型嗜鹽古菌PCR 擴(kuò)增所需的模板DNA。

1.3.2 PCR 擴(kuò)增16S rRNA 基因 分別利用嗜鹽古菌和嗜鹽細(xì)菌的16S rRNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 分別以F8/R1462 和27F/1492R 為嗜鹽古菌和細(xì)菌的16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增的引物[15]。 將電泳檢測成功的PCR 產(chǎn)物送生物公司測序。

1.3.3 測序結(jié)果分析 獲得各菌株16S rRNA 基因的測序峰圖，利用BioEdit 軟件[14]檢查測序峰圖的質(zhì)量，去除兩側(cè)峰型較差的序列，選取中間可信度高的序列進(jìn)行后續(xù)分析。 將已選中的序列利用工具EZbioCloud（https：//www.ezbiocloud.net/）進(jìn)行同源性搜索，得到與菌株親緣關(guān)系最近的物種信息及其相似度，確定各個(gè)菌株的分類地位。 將本研究所分離到的43 株嗜鹽菌的16S rRNA 基因序列提交GenBank，獲得序列登錄號：MZ768566-MZ768608。

1.4 胞外酶活鑒定

根據(jù)文獻(xiàn)對嗜鹽菌的胞外淀粉酶、酯酶、明膠酶、觸酶、蛋白酶、氧化酶進(jìn)行酶活鑒定[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 7 種高鹽食品中可培養(yǎng)嗜鹽微生物的分布情況統(tǒng)計(jì)

2.1.1 7 種高鹽食品中可培養(yǎng)嗜鹽微生物物種分布情況 對經(jīng)過純培養(yǎng)分離并根據(jù)菌落的形態(tài)和顏色挑取43 株進(jìn)行16S rRNA 基因測序和序列相似性分析。 結(jié)果顯示，從市售常見高鹽食品中共分離出21 種嗜鹽微生物，分屬13 個(gè)屬。 如表1 所示，其中嗜鹽古菌分別來自Halorubrum、Haloarcula、Halobacterium、Halarchaeum 這4 個(gè)屬的7 個(gè)種；嗜鹽 細(xì) 菌 分 別 來 自 Halobacillus、Staphylococcus、Chromohalobacter、Gracilibacillus、Lentibacillus、Salinicoccus、Salimicrobium、Nesterenkonia、Alkalibacillus這9 個(gè)屬的14 個(gè)種。

表1 21 種代表嗜鹽微生物分類地位Table 1 Taxonomic status of 21 representatives of halophilic microorganisms

嗜鹽古菌4 個(gè)屬分別隸屬于Halobacteria 綱，Haloferacales 和Halobacteriales 目，Halorubraceae、Haloarculaceae 和Halobacteriaceae 科。 嗜鹽細(xì)菌9個(gè) 屬 分 別 隸 屬 于 Bacillales、Oceanospirillale 和Micrococcales 目 ；Bacillaceae、Staphylococcaceae、Halomonadaceae 和Micrococcaceae 科。

2.1.2 7 種高鹽食品中可培養(yǎng)嗜鹽微生物優(yōu)勢物種分析 在AS-168 培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，海蜒樣品中的優(yōu)勢物種為Nesterenkonia 屬物種，占比87.5%；蝦皮樣品中的優(yōu)勢物種為Salinicoccus 屬物種，占比83.3%； 海帶樣品中的優(yōu)勢物種為Haloarcula 屬物種，占比88.2%； 什錦菜樣品中的優(yōu)勢物種為Lentibacillus 屬物種，占比74.4%；辣醬樣品中的優(yōu)勢物種為Staphylococcus 屬物種，占比100.0%；寶塔菜樣品中的優(yōu)勢物種為Gracilibacillus 屬物種，占比40.0%，見圖2。

圖2 7 種高鹽食品在AS-168 和NOM 培養(yǎng)基中可培養(yǎng)嗜鹽微生物物種組成（屬級水平）Fig. 2 Species composition of halophilic microorganisms in AS-168 and NOM mediumsin in 7 different salted-foods（genus level）

在NOM 培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，海蜒樣品中的優(yōu)勢物種為Halobacillus 屬和Halobacterium 屬物種，占比均為36.0%； 蝦皮樣品中的優(yōu)勢物種為Salimicrobium 屬物種，占比31.2%；海帶樣品中的優(yōu)勢物種為Haloarcula 屬物種，占比78.4%；辣醬樣品中優(yōu)勢物種為Nesterenkonia 屬物種，占比52.2%；寶塔菜樣品中的優(yōu)勢物種為Gracilibacillus 屬物種，占比100.0%； 醬油蜜瓜樣品中的優(yōu)勢物種為Lentibacillus 屬物種，占比100.0%。

2.2 7 種高鹽食品中可培養(yǎng)嗜鹽微生物比較

2.2.1 不同樣品中可培養(yǎng)嗜鹽微生物物種組成比較 在AS-168 培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，從海蜒樣品中共分離出2 個(gè)屬的2 種嗜鹽微生物，均為嗜鹽細(xì)菌；從蝦皮樣品中共分離出1 個(gè)屬的2 種嗜鹽微生物，均為嗜鹽細(xì)菌；從海帶樣品中共分離出2 個(gè)屬的2 種嗜鹽微生物，其中嗜鹽古菌1 個(gè)屬的1 種，嗜鹽細(xì)菌1 個(gè)屬的1 種；從什錦菜樣品中共分離出2 個(gè)屬的2 種嗜鹽微生物，均為嗜鹽細(xì)菌；從辣醬樣品中共分離出1 個(gè)屬的1 種嗜鹽微生物，均為嗜鹽細(xì)菌；從寶塔菜樣品中共分離出4 個(gè)屬的5 種嗜鹽微生物，其中嗜鹽古菌3 個(gè)屬的3 種，嗜鹽細(xì)菌1個(gè)屬的2 種；從醬油蜜瓜樣品中未分離出任何嗜鹽微生物。

在NOM 培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，從海蜒樣品中共分離出6 個(gè)屬的6 種嗜鹽微生物，其中嗜鹽古菌4個(gè)屬的4 種，嗜鹽細(xì)菌2 個(gè)屬的2 種；從蝦皮樣品中共分離出嗜鹽微生物5 個(gè)屬的5 種，其中嗜鹽古菌2 個(gè)屬的2 種，嗜鹽細(xì)菌2 個(gè)屬的2 種；從海帶樣品中共分離出2 個(gè)屬的2 種嗜鹽微生物，均為嗜鹽古菌； 從什錦菜樣品中未分離出任何嗜鹽微生物；從辣醬樣品中共分離出6 個(gè)屬的8 種嗜鹽微生物，其中嗜鹽古菌4 個(gè)屬的6 種，嗜鹽細(xì)菌2 個(gè)屬的2 種；從寶塔菜樣品中共分離出1 個(gè)屬的1 種嗜鹽微生物，均為嗜鹽細(xì)菌；從醬油蜜瓜樣品中共分離出1 個(gè)屬的1 種嗜鹽微生物，均為嗜鹽細(xì)菌，見表2。 可見在AS-168 培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，易分離出嗜鹽細(xì)菌；在NOM 培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，易分離出嗜鹽古菌。

表2 21 個(gè)嗜鹽微生物物種在7 種高鹽食品中的分布Table 2 Distribution of 21species of halophilic microorganisms in 7 different salted-foods

2.2.2 不同培養(yǎng)基分離可培養(yǎng)嗜鹽微生物的比較用AS-168 培養(yǎng)基共分離出嗜鹽菌9 個(gè)屬的12 種，其中嗜鹽古菌3 個(gè)屬的3 種，分屬Halorubrum、Halobacterium 和Haloarcula 屬； 嗜鹽細(xì)菌6 個(gè)屬的9 種，分屬Chromohalobacter、Gracilibacillus、Lentibacillus、Nesterenkonia、Salinicoccus 和Staphylococcus屬。 而用NOM 培養(yǎng)基中共分離出嗜鹽菌11 個(gè)屬的15 種，其 中 嗜 鹽 古 菌4 個(gè) 屬 的7 種，分 屬Halorubrum、Halobacterium、Haloarcula 和Halarchaeum 屬，完全覆蓋了AS-168 培養(yǎng)基中分離出的嗜鹽古菌； 嗜鹽細(xì)菌7 個(gè)屬的8 種，分屬Alkalibacillus、Gracilibacillus、Halobacillus、Lentiba -cillus、Nesterenkonia、Salinicoccus 和 Salimicrobium屬（圖3）。 可見，NOM 培養(yǎng)基培養(yǎng)出的嗜鹽微生物豐富度明顯高于AS-168 培養(yǎng)基。

其中，Halarchaeum 屬嗜鹽古菌只在NOM 培養(yǎng)基中分離到；Chromohalobacter 和Staphylococcus 屬嗜鹽細(xì)菌只在AS -168 培養(yǎng)基中分離到；Alkalibacillus、Halobacillus 和Salimicrobium 屬 嗜 鹽細(xì)菌只在NOM 培養(yǎng)基分離到。 NOM 培養(yǎng)基相對于AS-168 培養(yǎng)基而言屬于寡營養(yǎng)型培養(yǎng)基，嗜鹽微生物可能更加適應(yīng)在寡營養(yǎng)條件生存。

2.3 21 種代表嗜鹽微生物胞外酶活測定

在所分離到的21 種嗜鹽菌中，胞外產(chǎn)淀粉酶的有3 株，占比14.3%；產(chǎn)酯酶7 株，占比33.3%；產(chǎn)明膠酶1 株，占比4.8%；產(chǎn)觸酶8 株，占比38.1%；未分離出產(chǎn)蛋白酶和氧化酶的嗜鹽菌，見表3。

嗜鹽古菌N-9 具有胞外明膠酶活性 （圖3（a））； 嗜鹽細(xì)菌168-11 菌株具有胞外淀粉酶、酯酶、觸酶活性；嗜鹽古菌N-11 菌株具有胞外淀粉酶（圖3（b））、酯酶活性；嗜鹽細(xì)菌N-18 菌株具有胞外淀粉酶（圖3（b））、觸酶活性；嗜鹽細(xì)菌N-34 菌株具有胞外酯酶、觸酶活性；嗜鹽細(xì)菌N-16 菌株具有胞外酯酶活性（圖3（c））。

由表3 得出，產(chǎn)胞外淀粉酶的168-11、N-11、N-18 菌株在各自生境中的占比分別為100%、2.2%、25.0%。 產(chǎn)胞外酯酶的168-9、168-11、N-11、N-34 菌株在各自生境中的占比分別為20.0%、100%、2.2%、4.0%，此外產(chǎn)胞外酯酶的N-14 菌株在辣醬、蝦皮、海蜒樣品中均分離得到，占比分別為8.7%、12.5%、8.0%； 產(chǎn)胞外酯酶的N-16 菌株在辣醬、蝦皮樣品中均被分離得到，占比分別為13.0%、83.3%；產(chǎn)胞外酯酶的N-29 菌株在蝦皮、海蜒樣品中均分離得到，占比分別為31.3%、12.0%。產(chǎn)胞外明膠酶的N-9 菌株在其生境中占比為2.2%。 可見，產(chǎn)胞外酶菌株相較于不產(chǎn)胞外酶菌株而言，前者在其生境中具有一定的優(yōu)勢度。 其中，168-11、N-16 菌株更是其生境中的優(yōu)勢物種。

2.4 討論

高鹽腌漬和發(fā)酵食品由于富含游離氨基酸、小分子糖、醇、酸類物質(zhì)、維生素等，對嗜鹽古菌有較好的篩選和富集作用，蘊(yùn)藏豐富的新種資源和產(chǎn)酶菌株資源[17]。 目前，對于鹽湖、鹽礦和曬鹽場等高鹽環(huán)境的嗜鹽微生物的物種多樣性組成方面的研究已經(jīng)有了較多積累。 雖然有關(guān)于高鹽食品中分離并鑒定出了嗜鹽古菌的新物種報(bào)道較多，而對于市售常見的高鹽產(chǎn)品中的嗜鹽古菌的多樣性研究較少。由于高鹽食品的制作原料、制作方法、添加劑的使用多種多樣，由此造成的高鹽食品中微生物生境的不同，形成了各自獨(dú)特的微生物組成結(jié)構(gòu)。作者對7種高鹽食品中的嗜鹽微生物進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，拓寬了對不同高鹽生境中嗜鹽菌的組成的認(rèn)識(shí)。

作者通過純培養(yǎng)技術(shù)，共從7 種高鹽食品生境中挑取了不同形態(tài)的菌株43 株測序，經(jīng)過基于16S rRNA 基因的序列相似性分析，初步確定了7 種高鹽食品生境中共有21 個(gè)種13 個(gè)屬的嗜鹽微生物。其 中 包 括 Halorubrum、Haloarcula、Halobacterium、Halarchaeum 4 個(gè)屬的嗜鹽古菌菌株，Halobacillus、Staphylococcus、Chromohalobacter、Gracilibacillus、Lentibacillus、Salinicoccus、Salimicrobium、Nesterenkonia、Alkalibacillus 9 個(gè)屬的嗜鹽細(xì)菌菌株。這些菌株之前也被一些學(xué)者從其相應(yīng)生境中分離得到，且與作者在本研究中得到的結(jié)果具有一定相似性。 如江蘇大學(xué)韓冬在分析4 種產(chǎn)地的鹽漬海帶中嗜鹽古菌多樣性中，其中山東榮成、福建霞浦2 種產(chǎn)地的鹽漬海帶的嗜鹽古菌優(yōu)勢物種來自Haloarcula屬[17]，與本研究得到結(jié)果一致。西華大學(xué)張琦在四川泡菜鹽鹵中分離出54 株嗜鹽細(xì)菌，分屬3 個(gè)屬，Staphylococcus 屬為其中之一[18]。 在本研究中作者也分離出Staphylococcus 屬菌株，且為辣醬樣品中的優(yōu)勢物種。 大連工業(yè)大學(xué)李可心在盤錦地區(qū)蜢蝦醬中分離出62 株嗜鹽菌，其中Salinicoccus 屬4 株，Lentibacillus 屬3 株，均為主要物種[19]。本研究中，蝦皮樣品中優(yōu)勢物種來自Salinicoccus 屬； 醬油蜜瓜樣品中唯一分離出菌株來自Lentibacillus 屬，什錦菜樣品中優(yōu)勢物種也來自Lentibacillus 屬。

3 結(jié) 語

以嗜鹽古菌作為產(chǎn)酶來源已經(jīng)成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)，主要應(yīng)用于化工、制藥、石油、水產(chǎn)、發(fā)酵等工業(yè)生產(chǎn)中[20]。作者從21 種嗜鹽菌株中篩選出了胞外產(chǎn)淀粉酶3 株，產(chǎn)酯酶7 株，產(chǎn)明膠酶1 株，產(chǎn)觸酶8 株。 初步判斷，產(chǎn)酶菌株在其生境中同時(shí)也具有一定的優(yōu)勢度，且有些菌株具有產(chǎn)多種胞外酶的特征。 高鹽生境具有一定的復(fù)雜性，某些嗜鹽菌為了適應(yīng)復(fù)雜的生存環(huán)境進(jìn)化出產(chǎn)多種胞外酶的特性。 因此相較于不產(chǎn)酶菌株，產(chǎn)酶菌株更具有生存優(yōu)勢。