李祥雨，熊雅婷，滕建文，韋保耀，黃 麗，夏 寧

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004）

咸蛋是以鮮鴨蛋、雞蛋等禽蛋為原料，經(jīng)鹽水或含鹽的黃泥、紅泥、草木灰等腌制而成，是一種傳統(tǒng)加工食品。近年來，其蛋黃因獨(dú)特的風(fēng)味受到廣大消費(fèi)者的喜愛，并作為原料應(yīng)用到月餅等烘焙領(lǐng)域。未經(jīng)加工的咸蛋黃含有程度各異的蛋腥味，經(jīng)過熱加工后的咸蛋黃產(chǎn)生多種揮發(fā)性成分例如醛類、酮類、醇類、吡嗪以及呋喃等[1]，共同組成咸蛋黃的特殊風(fēng)味。

咸蛋黃風(fēng)味的形成主要包括腌制和熟制2 個(gè)階段，蛋黃經(jīng)腌制后揮發(fā)性化合物種類和相對(duì)含量均發(fā)生變化，酯類、嘧啶、噻唑含量增加[2]，2,2-二氯丙烷、3-丁烯-2-酮、丙酸甲酯、四氫呋喃會(huì)在腌制后的蛋黃中檢出[3]。加熱熟化促使蛋黃的揮發(fā)性物質(zhì)增加，其中醛類的種類和含量最多，而呋喃類和硫化物是熟蛋黃特有的風(fēng)味物質(zhì)[4]。余平蓮[1]通過對(duì)生鮮蛋黃、生腌蛋黃和熟咸蛋黃的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)只有煮熟的咸蛋黃才具有乙醇、2-甲基丁醛、2-戊醛、吡嗪等風(fēng)味物質(zhì)。這主要是由于蛋黃在熱處理過程中，卵黃球顆粒的破裂、脂質(zhì)遷移和脂肪氧化生成了醛、酮、酸等風(fēng)味物質(zhì)[5]。由于脂質(zhì)氧化的最終產(chǎn)物（醛、醇、酮等）具有較高的揮發(fā)性和較低的閾值，對(duì)食品特征風(fēng)味的形成起關(guān)鍵作用，其種類和數(shù)量決定了產(chǎn)品風(fēng)味的好壞，直接影響著消費(fèi)者對(duì)相關(guān)產(chǎn)品的接受程度[3]。Goldberg等[6]報(bào)道脂質(zhì)氧化會(huì)導(dǎo)致雞蛋產(chǎn)生不良風(fēng)味，Matumoto-Pintro等[7]研究發(fā)現(xiàn)雞蛋的異味主要是多不飽和脂肪酸氧化酸敗導(dǎo)致，并發(fā)現(xiàn)煮熟雞蛋樣品在腐爛階段的主要風(fēng)味化合物為甲硫醇、硫化氫和異戊醛。任柳陽[8]通過感官評(píng)價(jià)和氣相色譜-質(zhì)譜-嗅聞相結(jié)合的方式對(duì)加熱后的蛋黃凝膠揮發(fā)性成分研究發(fā)現(xiàn)游離脂質(zhì)氧化產(chǎn)物己醛、反-2-辛烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇和 2-戊基呋喃為蛋黃腥味的關(guān)鍵風(fēng)味成分。總之，咸蛋黃風(fēng)味的變化很大程度上與脂質(zhì)氧化有關(guān)，并受熱加工方式的影響。由于咸蛋黃在食品領(lǐng)域應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，目前咸蛋黃的利用更傾向于采用高溫?zé)崽幚砗笞鳛轱L(fēng)味基料或直接賦予產(chǎn)品特征風(fēng)味，這與傳統(tǒng)蒸煮的熱加工方式有較大不同，也可能是導(dǎo)致部分咸蛋黃存在異味的原因之一。烘烤過程中脂肪受高溫的直接影響不斷氧化水解，氧化程度逐漸加深，對(duì)豐富咸蛋黃香氣有重要意義，但過度的脂質(zhì)氧化使1-辛烯-3-醇等揮發(fā)性化合物濃度過高等，給咸蛋黃帶來酸敗味等不良風(fēng)味[9-10]。然而，目前國內(nèi)外對(duì)烘烤后咸蛋黃揮發(fā)性風(fēng)味成分分析及呈現(xiàn)異味揮發(fā)性成分的研究卻鮮有報(bào)道。

感官風(fēng)味是評(píng)價(jià)食品品質(zhì)的重要指標(biāo)，同時(shí)結(jié)合儀器分析是對(duì)食品風(fēng)味物質(zhì)研究的重要途徑。定量描述分析（quantitative descriptive analysis，QDA）是一種具有剖析和描述功能的綜合性感官分析方法，在剖析食品的感官品質(zhì)、判斷缺陷等方面具有定量效果[11]。而儀器分析方面，近年來主要采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，該方法能較真實(shí)地反映食品中揮發(fā)性物質(zhì)的基本組成[12]。目前，感官評(píng)價(jià)結(jié)合HS-SPME-GC-MS已在雞精[13]、清香型白酒[14]、臘肉[15]等食品的風(fēng)味分析方面進(jìn)行應(yīng)用。因此，本研究通過感官評(píng)價(jià)確定咸蛋黃存在異味屬性，借助儀器分析和化學(xué)計(jì)量學(xué)工具，全面解析異味咸蛋黃中的特征風(fēng)味化合物，以無異味的咸蛋黃為對(duì)照，對(duì)異味咸蛋黃特征風(fēng)味化合物進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析如聚類分析、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）及主成分分析（principal component analysis，PCA）并結(jié)合香氣活度值（odour activity value，OAV），以期找出目標(biāo)差異化合物，為咸蛋黃風(fēng)味評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

咸鴨蛋購于廣西北海市蘇氏蛋品廠。

正構(gòu)烷烴（C7～C40）（均為色譜級(jí)）美國Sigma公司；環(huán)己酮（色譜級(jí)）上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司；HHS-2恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；7890B-5977A型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 咸蛋黃樣品制備

將腌制成熟的咸蛋黃樣品置于旋轉(zhuǎn)烤爐中，320 ℃烘烤18 min后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.2 QDA

感官評(píng)價(jià)小組成員由經(jīng)過專業(yè)感官培訓(xùn)的15 名學(xué)生組成（男性5 人，女性10 人，年齡20～25歲），評(píng)估符合ISO標(biāo)準(zhǔn)。首先，感官評(píng)價(jià)員通過嗅聞將咸蛋黃分為無異味咸蛋黃（記為F）和異味咸蛋黃（記為OF），并通過會(huì)議討論確定咸蛋黃樣品的8 個(gè)風(fēng)味描述詞、定義和參比樣（表1）。其次，根據(jù)表1對(duì)感官評(píng)價(jià)員進(jìn)行感官培訓(xùn)，直到所有成員都能正確識(shí)別參比樣的風(fēng)味屬性和風(fēng)味強(qiáng)度。最后，將5 g樣品放入30 mL棕色細(xì)口瓶中隨機(jī)編碼，分別提供給小組成員，并通過嗅聞量化屬性。為了確保揮發(fā)性物質(zhì)在頂空中積累，容器在60 ℃的水浴中保存30 min。感官評(píng)價(jià)在（25±2）℃的感官評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，風(fēng)味的強(qiáng)度范圍為0～5 級(jí)（0表示無，5表示非常強(qiáng)烈）。

表1 咸蛋黃感官描述詞及其定義Table 1 Sensory descriptors and their definitions for salted egg yolk

1.3.3 揮發(fā)性化合物檢測

1.3.3.1 HS-SPME條件

準(zhǔn)確稱取經(jīng)感官評(píng)價(jià)確定后的F和OF樣品各2.00 g置于20 mL頂空瓶中，并加入1 μL質(zhì)量濃度為0.4739 μg/mL的環(huán)己酮，用帶有聚四氯乙烯隔墊的蓋子密封，置于60 ℃水浴中平衡10 min待用。將30/50 μm DVB/CAR/PDMS白色萃取頭在GC進(jìn)樣口老化（老化溫度250 ℃，時(shí)間20 min），將老化好的SPME針插入頂空瓶靜態(tài)吸附40 min后進(jìn)行GC-MS分析，其中進(jìn)樣口溫度250 ℃，解吸時(shí)間5 min。

1.3.3.2 GC-MS條件

GC條件：VF-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持10 min，以2 ℃/min升至60 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升至120 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min；載氣（He）流速1.0 mL/min，壓力2.4 kPa，進(jìn)樣量0.5 μL；不分流。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；母離子m/z285；四極桿溫度150 ℃；激活電壓1.5 V；質(zhì)量掃描范圍m/z35～500。

1.3.4 揮發(fā)性化合物分析

定性分析：未知分子在一定的電子能量下，其離子碎片是固定的。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過GC-MSD化學(xué)工作站處理，利用NIST14譜庫進(jìn)行未知物與已知物的比對(duì)，當(dāng)正反匹配度大于80時(shí)，可基本判斷該未知化合物。化合物在一定環(huán)境下，如載氣速度、色譜柱長度和溫度一定時(shí)，其保留時(shí)間是一定的。但保留指數(shù)（retention indices，RI）是一個(gè)相對(duì)常數(shù)，其不會(huì)隨儀器條件的改變而改變，根據(jù)未知物的RI與標(biāo)準(zhǔn)RI對(duì)比，相差位于±50內(nèi)即可。其中待測組分出峰時(shí)間和線性RI的換算公式（1）如下：

式中：ta為組分a的保留時(shí)間/min；tn為飽和系列烷烴Cn的保留時(shí)間/min；tn+1為Cn+1的保留時(shí)間/min；組分a的保留時(shí)間必須在Cn和Cn+1之間。

定量分析：采取內(nèi)標(biāo)半定量的方法，針對(duì)無異味咸蛋黃和異味咸蛋黃風(fēng)味組分的出峰面積按式（2）計(jì)算相對(duì)含量：

式中：AX為待測組分的峰面積；Ai為內(nèi)標(biāo)峰面積；CX為待測組分含量/（μg/kg）；Ci為內(nèi)標(biāo)含量/（μg/kg）。

1.3.5 OAV計(jì)算

按式（3）計(jì)算OAV：

式中：Ci為化合物含量/（μg/kg）；OTi為通過文獻(xiàn)查得化合物閾值/（μg/kg）。

OAV＞1，表明該物質(zhì)對(duì)總體香氣有直接貢獻(xiàn)，OAV＜1，表明該物質(zhì)對(duì)總體香氣無實(shí)質(zhì)性貢獻(xiàn)，OAV越大則說明該物質(zhì)對(duì)總體香氣的貢獻(xiàn)越大。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2016對(duì)感官數(shù)據(jù)開展感官風(fēng)味輪廓差異圖分析并利用SPSS 22.0軟件對(duì)感官數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析；通過Origin 2022b對(duì)咸蛋黃樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量進(jìn)行聚類熱圖分析以及對(duì)感官屬性和揮發(fā)性化合物進(jìn)行PCA；采用SIMAC 14.1軟件對(duì)樣品進(jìn)行OPLS-DA，篩選潛在差異化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 無異味和異味咸蛋黃樣品風(fēng)味輪廓比較

采用感官評(píng)價(jià)的方法，確定烘烤后咸蛋黃的8 個(gè)風(fēng)味描述詞，分別為黃油味、烤雞肉味、肉松味、烤面包味、烤扁桃仁味、熱牛奶味、蛋腥味和酸臭味。經(jīng)過一段時(shí)間的風(fēng)味強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)訓(xùn)練，培訓(xùn)感官小組成員參比樣區(qū)分能力、重復(fù)性及一致性均較好。然后感官評(píng)價(jià)員對(duì)咸蛋黃的8 個(gè)風(fēng)味屬性進(jìn)行風(fēng)味強(qiáng)度打分，根據(jù)打分結(jié)果得到風(fēng)味輪廓圖。如圖1所示，兩類咸蛋黃樣品風(fēng)味輪廓相似，其中黃油味和烤雞肉味感官評(píng)分在1.5～2.2之間，相對(duì)較高，為烘烤后咸蛋黃的主要風(fēng)味屬性。F樣品中咸蛋黃風(fēng)味輪廓豐富且較為濃郁，無不良?xì)馕?，而OF樣品中除正常香氣屬性外，還存在明顯酸臭味，且兩個(gè)樣品中烤扁桃仁味與酸臭味存在顯著差異。

圖1 無異味咸蛋黃和異味咸蛋黃風(fēng)味輪廓圖Fig.1 Flavor profiles of salted egg yolk without and with off-flavor

2.2 咸蛋黃揮發(fā)性物質(zhì)聚類熱圖分析

為明確無異味和異味咸蛋黃樣品間風(fēng)味物質(zhì)差異，采用無監(jiān)督聚類熱圖統(tǒng)計(jì)對(duì)咸蛋黃中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，將GC-MS檢測到的物質(zhì)使用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算相對(duì)含量后繪制熱圖，以觀察無異味和異味咸蛋黃的風(fēng)味物質(zhì)差異。為更直觀比較同一物質(zhì)在不同樣品間的差異情況，繪制熱圖過程利用熱圖軟件自帶功能對(duì)GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)換處理。熱圖中藍(lán)色和紅色代表物質(zhì)含量由高到低，藍(lán)色越深含量越低，紅色越深含量越高。從圖2可知，2 組樣品分別聚類，表明兩組咸蛋黃揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量間存在顯著差異，與感官評(píng)價(jià)結(jié)果一致；各樣品的3 個(gè)平行檢測均分別聚類，說明本研究的實(shí)驗(yàn)條件和方法具有較好的穩(wěn)定性。在2 組樣品中，正己醛、正壬醛、正辛醛、2-戊基呋喃、3-甲基丁醛、苯甲醛、苯乙醛和1-辛烯-3-醇的相對(duì)含量較高，結(jié)合醛類閾值可知醛類化合物為咸蛋黃的主要風(fēng)味物質(zhì)；2 組樣品中相對(duì)含量差異較大的風(fēng)味化合物有異戊醇、吲哚、反-2-壬烯醛、8-壬烯-2-酮、2-庚酮、異辛醇、1,3-二甲基苯和對(duì)二甲苯，其中異戊醇、吲哚、反-2-壬烯醛、8-壬烯-酮僅出現(xiàn)在OF樣品中，且分別具有化學(xué)試劑味、臭味、陳腐味、藍(lán)紋干酪的異味屬性，但對(duì)風(fēng)味的整體貢獻(xiàn)，仍需結(jié)合閾值分析。該結(jié)果說明咸蛋黃樣品中揮發(fā)性化合物種類和含量差異對(duì)于咸蛋黃風(fēng)味輪廓和品質(zhì)具有重要的影響，也為后續(xù)的風(fēng)味組學(xué)分析提供了前提。

圖2 異味和無異味咸蛋黃風(fēng)味組分差異成分熱圖Fig.2 Heatmap of differential flavor components between salted egg yolk with and without off-flavor

2.3 F和OF揮發(fā)性成分比較分析

GC-MS檢測圖譜經(jīng)提取和匹配后，通過NIST數(shù)據(jù)庫比對(duì)和RI值鑒定，最后在2 種咸蛋黃樣品中共鑒定出62 種風(fēng)味化合物，其中包括醛類18 種、酮類9 種、醇類9 種、烷烴類7 種、烯烴類5 種、雜環(huán)化合物5 種、芳香化合物6 種以及其他類化合物3 種，并對(duì)不同種類化合物的數(shù)量和相對(duì)含量進(jìn)行比較統(tǒng)計(jì)分析，如表2、圖3所示。

圖3 無異味咸蛋黃和異味咸蛋黃化合物數(shù)量（A）和相對(duì)含量（B）對(duì)比Fig.3 Comparison of the number (A) and relative contents (B) of volatile compounds in salted egg yolk without and with off-flavor

表2 異味和無異味咸蛋黃揮發(fā)性成分GC-MS鑒定結(jié)果Table 2 Results of GC-MS identification of volatile components in salted egg yolk without and with off-flavor

醛類化合物由于其氣味閾值低和分子質(zhì)量低，且在咸蛋黃樣品中的種類和含量最多，被認(rèn)為是咸蛋黃風(fēng)味的重要貢獻(xiàn)者。在無異味咸蛋黃和異味咸蛋黃樣品中醛類分別占比57.10%和45.55%，化合物種類分別為15 種和17 種，正癸醛僅出現(xiàn)在F樣品中，而反-2-壬烯醛、反,反-2,4-壬二烯醛與反,反-2,4-癸二烯醛僅出現(xiàn)在OF樣品中，且反-2-壬烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛分別存在陳腐味和魚腥味等異味屬性。在F樣品和OF樣品中正己醛含量分別為102.56 μg/kg與168.73 μg/kg，由于正己醛的含量較低時(shí)呈現(xiàn)出令人愉悅的青草香，在較高含量時(shí)則會(huì)出現(xiàn)油脂味，因此，蛋黃中該物質(zhì)含量增高可能是導(dǎo)致咸蛋黃出現(xiàn)不愉快風(fēng)味的原因之一[23]，這與Pastorelli等[24]對(duì)堅(jiān)果中正己醛濃度的升高與異味有密切相關(guān)的研究結(jié)論一致。

酮類物質(zhì)是脂質(zhì)氧化以及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的又一類代表物質(zhì)，如2-丁酮、2-辛酮、2-壬酮等物質(zhì)被認(rèn)為是美拉德反應(yīng)尤其是Amadori重排過程中產(chǎn)生的重要產(chǎn)物[25]。與無異味咸蛋黃相比，酮類物質(zhì)在異味咸蛋黃樣品中的種類和含量均有增加。其中2-庚酮和2-壬酮在F樣品中含量分別為5.80 μg/kg與10.76 μg/kg，而在OF樣品中增加到34.95 μg/kg與67.86 μg/kg，含量差異較大，且2-壬酮與酒糟發(fā)酵后的酸糟味相關(guān)性較大[26]，這也可能和咸蛋黃中的酸臭味密切相關(guān)。由于甲基酮類化合物是飽和脂肪酸氧化的產(chǎn)物[27]，在一些食品中是食物酸敗味道的來源。而甲基壬基甲酮（牛油味）與8-壬烯-2-酮（藍(lán)紋干酪味）僅出現(xiàn)在OF樣品中，也可能為異味化合物。

醇類物質(zhì)的產(chǎn)生也與脂質(zhì)氧化密切相關(guān)，低分子質(zhì)量飽和及不飽和鏈狀醇的揮發(fā)性強(qiáng)，特有的官能團(tuán)羥基的氣味比較強(qiáng)烈，并隨著碳鏈的增長其氣味也由果實(shí)香型向清香型，最后向脂肪臭型方向轉(zhuǎn)變[2]。醇類化合物在2 種樣品中含量占比分別為12.35%與14.43%，化合物數(shù)量分別為7 種與9 種，其中2-苯乙醇和異戊醇僅出現(xiàn)在OF樣品中，含量差異較大的化合物有異辛醇、1-辛烯-3-醇和異戊醇。其中異辛醇在草莓汁中呈現(xiàn)特殊刺激性異味物質(zhì)[28]，1-辛烯-3-醇被認(rèn)為是由酶促或非酶降解亞油酸的產(chǎn)物，呈現(xiàn)出典型的蘑菇味，為蛋黃加熱的異味物質(zhì)之一[29]。

烷烴類化合物和烯烴類化合物閾值較高，對(duì)咸蛋黃風(fēng)味貢獻(xiàn)均不大。烷烴類化合物的相對(duì)含量和數(shù)量在2 種樣品中無顯著差異，烯烴類化合物在無異味和異味咸蛋黃樣品中相對(duì)含量分別為4.77%和9.24%。OF樣品中烯烴類化合物含量較高主要由苯乙烯導(dǎo)致，在F和OF樣品中苯乙烯相對(duì)含量分別為1.79%與8.09%，且苯乙烯曾在炒蛋中被發(fā)現(xiàn)呈刺激氣味[30]，可能為咸蛋黃加熱后產(chǎn)生異味的化合物之一。

雜環(huán)類化合物是咸蛋黃中的一類重要香氣物質(zhì)，主要包括吡嗪和呋喃，在無異味咸蛋黃和異味咸蛋黃中該類化合物相對(duì)含量分別為8.54%與4.62%。化合物種類差異不大，含量的差異可能是由于在異味咸蛋黃樣品中異味化合物的增多，使該類化合物占比相對(duì)減少。其中，吡嗪是美拉德反應(yīng)過程中產(chǎn)生的主要揮發(fā)性風(fēng)味化合物，大多呈現(xiàn)出烤香、堅(jiān)果香、爆米花香等香氣特征并能夠在嗅聞口聞到香氣，它們的存在豐富了咸蛋黃的香氣輪廓，這些物質(zhì)在一些其他烘烤制品以及花生、堅(jiān)果中也被檢測到[31]。

芳香類化合物包括對(duì)二甲苯、1,3-二甲基苯、萘、吲哚、草蒿腦和茴香腦，該類化合物在兩組樣品中相對(duì)含量和種類差異較小。對(duì)二甲苯和1,3-二甲基苯具有油脂味，但閾值較高對(duì)咸蛋黃風(fēng)味貢獻(xiàn)不大。草蒿腦和茴香腦呈現(xiàn)茴香味，是八角茴香的特征風(fēng)味成分[32]。萘本身呈現(xiàn)焦油味，吲哚在臭豆腐和羊膻味食品等中均被檢出[33-34]，呈現(xiàn)發(fā)霉味、臭味，且僅在異味咸蛋黃中出現(xiàn)，這2 種化合物可能是異味咸蛋黃中的異味化合物。

其他類化合物包括酸類、酚類、醚類，其中冰乙酸和2,6-二叔丁基對(duì)甲酚在兩組樣品中都存在，冰乙酸閾值較高，對(duì)咸蛋黃風(fēng)味貢獻(xiàn)不大，2,6-二叔丁基對(duì)甲酚呈芳香味，對(duì)咸蛋黃香氣有一定貢獻(xiàn)。二甲基二硫醚僅在異味咸蛋黃中出現(xiàn)，呈現(xiàn)硫味、酸味、腐臭味等不良?xì)馕?。馬永昆[35]在加熱后的“金皇后”瓜汁中發(fā)現(xiàn)新生成的二甲基二硫醚是導(dǎo)致“煮熟味”的異味化合物之一，故二甲基二硫醚可能為引起咸蛋黃異味的化合物之一。

對(duì)無異味和異味咸蛋黃揮發(fā)性化合物種類和相對(duì)含量分析可知，相比無異味咸蛋黃樣品，異味咸蛋黃樣品中醛類化合物的相對(duì)含量明顯降低，但有新增醛類化合物，酮類和醇類化合物的種類和相對(duì)含量均有所增加，烷烴類化合物種類和相對(duì)含量基本不變，且該類化合物閾值較高，對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)不大，烯烴類化合物個(gè)數(shù)相對(duì)較少，但在OF樣品的相對(duì)含量明顯高于F樣品，此差異主要是由于苯乙烯導(dǎo)致，雜環(huán)類和芳香類化合物主要對(duì)豐富咸蛋黃風(fēng)味輪廓有重要貢獻(xiàn)，其中吲哚自身具有一定臭味，但具體貢獻(xiàn)需結(jié)合其閾值分析。其他類化合物占比較少，其中二甲基二硫醚自身具有硫味、酸味、臭味等不良?xì)馕丁?jù)此可初步推斷，咸蛋黃熱加工中的異味主要來自于醛類、酮類和醇類，此外還可能包括吲哚、二甲基二硫醚等自身具有令人不愉快氣味的化合物。

2.4 OPLS-DA建模與模型評(píng)價(jià)異味咸蛋黃中的潛在差異標(biāo)志物

為了進(jìn)一步篩選出兩組樣品中的潛在差異化合物，采用OPLS-DA對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。由圖4A所示，模型中表明該模型能反映98%數(shù)據(jù)的變化，R2和Q2接近1.0表明該模型具有良好的可解釋度和擬合度。2 組咸蛋黃樣品在OPLSDA得分散點(diǎn)圖上聚類良好，組內(nèi)差異小，不同組間樣品實(shí)現(xiàn)完全分離，與聚類熱圖統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果一致。同時(shí)，采用SIMCA14.1中置換檢驗(yàn)功能驗(yàn)證模型的可靠性，經(jīng)200 次交叉驗(yàn)證后置換檢驗(yàn)結(jié)果如圖4B所示，所有R2和Q2均低于置換保留等于1.0的值時(shí)，且Q2點(diǎn)回歸線與橫坐標(biāo)交叉且小于0，截距為負(fù)值，統(tǒng)計(jì)模型有效，在擬合范圍內(nèi)有效[36]。

圖4 F和OF樣品揮發(fā)性風(fēng)味化合物的OPLS-DA得分圖（A）、置換檢驗(yàn)圖（B）和VIP值得分圖（C）Fig.4 OPLS-DA score plot (A),permutation test plot (B) and VIP score plot (C) of volatile flavor compounds in F and OF sample

變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）是OPLS-DA模型變量的權(quán)重值，可用于衡量各組分積累差異對(duì)各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，VIP值越大，貢獻(xiàn)率越大，通常VIP值大于1為常見的差異化合物篩選標(biāo)準(zhǔn)[37]。由圖4C可知，VIP值大于1的化合物有33 種，分別為正癸醛、2-乙基-5-甲基吡嗪、3-乙基-2-甲基-1,3-己二烯、甲基壬基甲酮、6-甲基-2-庚酮、二甲基二硫醚、反,反-2,4-壬二烯醛、2-壬酮、8-壬烯-2-酮、吲哚、苯乙烯、1,3-二甲基苯、2-苯乙醇、異辛醇、反,反-2,4-癸二烯醛、對(duì)二甲苯、異戊醇、反-2-壬烯醛、2-庚酮、草蒿腦、2-丁酮、正十三烷、冰乙酸、正壬烷、正十四烷、丙酮、正十二烷、正己醛、2,5-二甲基吡嗪、正戊醛、正十一烷、萘、反式-2-己烯醛。其中，反-2-壬烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、8-壬烯-2-酮、甲基壬基甲酮、異戊醇、2-苯乙醇、吲哚、二甲基二硫醚僅出現(xiàn)在OF樣品中，正己醛、2-庚酮、2-壬酮、異辛醇、苯乙烯、1,3-二甲基苯相對(duì)含量差異較大，且均在OF樣品中顯著增加。

2.5 異味咸蛋黃中的關(guān)鍵特征風(fēng)味

為進(jìn)一步確定與咸蛋黃異味屬性（酸臭味）相關(guān)的揮發(fā)性化合物，本實(shí)驗(yàn)采用PCA對(duì)兩組樣品揮發(fā)性成分和感官屬性之間進(jìn)行相關(guān)性分析。由于1-辛烯-3-醇VIP值為0.96且閾值低，在F和OF樣品中相對(duì)含量差異較大，可能為異味化合物之一。因此，以VIP值大于1的33 種揮發(fā)性化合物以及1-辛烯-3-醇為X變量，以感官屬性為Y變量，采用PCA得分圖反映兩者之間的關(guān)系。從圖5看出，PC1、PC2分別包含了原始信息量的79.6%和10.5%，從圖5B可知，與酸臭味正相關(guān)的揮發(fā)性化合物有1-辛烯-3-醇、反-2-己烯醛、正戊醛、正十一烷、正十二烷、正己醛、正十三烷、正十四烷、反-2-壬烯醛、對(duì)二甲苯、2-庚酮、苯乙烯、異戊醇、吲哚、1,3-二甲基苯、8-壬烯-2-酮、異辛醇、2-壬酮、冰乙酸、甲基壬基甲酮、反,反-2,4-癸二烯醛、丙酮、二甲基二硫醚、2-苯乙醇、反,反-2,4-壬二烯醛。

圖5 無異味咸蛋黃和異味咸蛋黃PCA圖Fig.5 PCA loading plot of salted egg yolk without and with off-flavor

OAV是指香氣化合物的質(zhì)量濃度和該化合物香氣閾值之比。理論上，只有質(zhì)量濃度超過閾值（OAV＞1.0）的化合物才有香氣貢獻(xiàn)，并且OAV大的化合物其香氣貢獻(xiàn)也大[38]。因此，異味咸蛋黃中的關(guān)鍵異味化合物主要有正己醛（脂肪味，OAV=33.75）、正戊醛（烤香味、堅(jiān)果味，OAV=1.29）、反,反-2,4-癸二烯醛（脂肪味、魚腥味，OAV=3.20）、1-辛烯-3-醇（蘑菇味，OAV=8.76）、苯乙烯（香脂味、汽油味，OAV=16.35）、二甲基二硫醚（硫味、蒜味、酸味、腐臭味，OAV=1.17），2-壬酮（熱牛奶味、酸臭味，OAV=1.36）。其中正己醛和反,反-2,4-癸二烯醛是ω-6脂肪酸氧化的主要標(biāo)志化合物[39]，1-辛烯-3-醇是亞油酸氧化過程二級(jí)氫過氧化物降解或者羰基化合物的還原產(chǎn)物[40]。所以，烘烤后咸蛋黃異味關(guān)鍵成分的產(chǎn)生可能與不飽和脂肪酸的氧化分解有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究以無異味咸蛋黃為參照，對(duì)咸蛋黃中的異味組分展開研究。通過QDA明確無異味咸蛋黃和異味咸蛋黃在酸臭味方面具有顯著性差異。通過HS-SPME結(jié)合GC-MS對(duì)兩組咸蛋黃揮發(fā)性成分鑒定得出分別有53 種和56 種揮發(fā)性化合物，以醛類、酮類和醇類為主。應(yīng)用聚類熱圖發(fā)現(xiàn)兩組咸蛋黃揮發(fā)性化合物含量存在顯著差異且分別聚類，并與感官評(píng)價(jià)結(jié)果一致。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開展組間揮發(fā)性化合物OPLS-DA，基于VIP值大于1，共得到正己醛、正癸醛、3-乙基-2-甲基-1,3-己二烯、6-甲基-2-庚酮、反,反-2,4-壬二烯醛、8-壬烯-2-酮、苯乙烯等33 個(gè)主要差異成分。結(jié)合文獻(xiàn)以及對(duì)兩組揮發(fā)性成分含量分析發(fā)現(xiàn)1-辛烯-3-醇在兩樣品中相對(duì)含量差異較大，且閾值低，故將1-辛烯-3-醇和VIP值大于1的33 種化合物同感官風(fēng)味屬性進(jìn)行PCA，得出1-辛烯-3-醇、反-2-己烯醛、正十一烷、正十二烷、戊醛、冰乙酸、正十三烷、正十四烷、反-2-壬烯醛等25 種化合物與酸臭味呈正相關(guān)。但在實(shí)際樣品中，只有含量高于樣品基質(zhì)下氣味閾值的風(fēng)味物質(zhì)才對(duì)整體香氣有貢獻(xiàn)。最后通過OAV大于1得出正己醛（脂肪味）、正戊醛（烤香味、堅(jiān)果味）、反,反-2,4-癸二烯醛（脂肪味、魚腥味）、1-辛烯-3-醇（蘑菇味）、苯乙烯（香脂味、汽油味）、二甲基二硫醚（硫味、蒜味、酸味、腐臭味）、2-壬酮（熱牛奶味、酸臭味）為異味咸蛋黃的關(guān)鍵異味化合物。