陳臘梅，唐善虎，李思寧，李錦錦，趙佳瑩，李巧艷

（西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

肉色是消費(fèi)者判斷肉品新鮮程度的直觀指標(biāo)，直接影響了消費(fèi)者的購買愿望[1]。宰后肌肉的肉色主要取決于肉肌漿中血紅素蛋白質(zhì)——肌紅蛋白（myoglobin，Mb）的狀態(tài)，在加工貯藏過程中，肉及肉制品發(fā)生氧化，高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MMb）逐漸累積，肉色劣變?yōu)榱钊穗y以接受的灰褐色[2-3]。肉及肉制品的氧化可被視為級聯(lián)反應(yīng)，即脂質(zhì)氧化、蛋白質(zhì)氧化、肌紅蛋白氧化之間相互促進(jìn)、相互作用[4]。普遍認(rèn)為，脂質(zhì)氧化是影響肉色穩(wěn)定性的重要因素，脂質(zhì)氧化程度越高，肉色穩(wěn)定性越低[1,5]。王兆明等[6]研究脂質(zhì)過氧自由基誘導(dǎo)兔肉肌漿蛋白（sarcoplasmic proteins，SP）聚集機(jī)制發(fā)現(xiàn)，過氧自由基不僅可以直接引發(fā)SP聚集，還可以通過介導(dǎo)Mb自氧化促進(jìn)SP交聯(lián)聚集，對肉的保水性和色澤具有重要影響。

據(jù)報(bào)道，脂質(zhì)氧化的次級產(chǎn)物比初級產(chǎn)物更容易與蛋白質(zhì)發(fā)生作用[7]。如α,β-不飽和醛具有高反應(yīng)性和穩(wěn)定性，很容易在肌漿中擴(kuò)散，通過共價(jià)加成與Mb反應(yīng)，改變蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)并使其易于進(jìn)一步氧化[4,8]。丙二醛（malondialdehyde，MDA）是肉類貯藏過程中脂質(zhì)氧化次級產(chǎn)物中最豐富且具代表性的活性醛類之一，來源于多種不飽和脂肪酸，具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)蛋白氧化變性能力，是脂質(zhì)氧化應(yīng)激的標(biāo)志物[9]。Wang Zhaoming等[10]觀察到MDA氧化不僅促進(jìn)了兔肉源Mb的自氧化，還導(dǎo)致了超鐵肌紅蛋白（ferrylmyoglobin，Mb（IV）＝O）及其他活性物質(zhì)的生成，從而影響兔肉品質(zhì)。Bonny[11]研究表明MDA可能通過牛肉源氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，OMb）氧化為MMb而調(diào)控肉色。

也有研究表明，脂質(zhì)氧化引起的肉色變化具有物種特異性，具有高含量組氨酸殘基的氧合肌紅蛋白的肉類更易受到脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的親核攻擊[12]。牦牛生長在高寒低氧地區(qū)，其Mb含量高，內(nèi)源性抗氧化能力強(qiáng)[13]。SP占骨骼肌總蛋白的30%，是Mb的主要存在場所；同時(shí)，SP中還含包含了多種可溶性酶類、抗氧化蛋白和物質(zhì)，調(diào)控影響肉色穩(wěn)定性的生化過程[14-15]。因此，SP一直是肉色領(lǐng)域的重點(diǎn)研究對象。然而，目前鮮見MDA氧化對牦牛肉肉色穩(wěn)定性影響的報(bào)道，同時(shí)，有關(guān)肉色穩(wěn)定性的研究聚焦于Mb，肉色與SP理化性質(zhì)關(guān)系尚不清楚。因此，本研究構(gòu)建MDA氧化體系，探討不同脂質(zhì)氧化程度下牦牛肉SP理化性質(zhì)變化與色澤穩(wěn)定性的關(guān)系，旨在為牦牛肉的加工與貯藏提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛肉購于四川成都雙流區(qū)白家明宣鮮牛肉門市部。選取自然放牧狀態(tài)下3～4 歲雄性健康麥洼牦牛（平均質(zhì)量230 kg），經(jīng)屠宰后室溫下排酸6 h，隨機(jī)選取2 條背長肌，用保溫箱（內(nèi)含冰袋，0～4 ℃）運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室（1 h），于-20 ℃冰箱內(nèi)貯藏待用。

2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、溴酚藍(lán)、三氯乙酸、乙酸乙酯、冰醋酸 成都科隆化學(xué)品有限公司；鹽酸胍、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、尿素、三羥甲基氨基甲烷（tris-(hydroxymethyl)-aminomethane，Tris）德國BioFroxx公司；考馬斯R-250、考馬斯-G250 上海源葉生物有限公司；5,5’-二硫基-2,2-二硝基苯甲酸（5,5’-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、1,1,3,3-四甲氧基丙烷（1,1,3,3-tetramethoxy-propan，TMP）上海麥克林生化科技有限公司；5×蛋白上樣緩沖液（含二硫蘇糖醇）北京索萊寶科技有限公司；寬范圍彩色預(yù)染蛋白質(zhì)Marker MP206 天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PL303分析天平 梅特勒-托利多國際股份有限公司；全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；ALPHALSC冷凍干燥機(jī) 德國Martin Christ公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；UV1810S紫外分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；F-4700型熒光分光光度計(jì) 日本那珂事務(wù)所；CR-700d/600d色差儀 日本Konica Minolta公司；傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）儀 美國PeakinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 SP的提取

參考Xue Chaoyi等[16]的方法并略作修改。取冷藏解凍后的牦牛肉背最長肌，剔除筋膜、脂肪后，將牦牛肉切成均勻的小塊，放入絞肉機(jī)中絞碎制成直徑5 mm的肉糜。取200 g牦牛肉糜按料液比1∶4（g/mL）加入40 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），10000×g勻漿1 min，浸提30 min后離心（4 ℃、4500×g、15 min），濾紙過濾，所得濾液即為SP溶液。采用雙縮脲法進(jìn)行測定蛋白質(zhì)量濃度，并調(diào)整質(zhì)量濃度為10 mg/mL。

1.3.2 MDA氧化體系構(gòu)建

參考Wang Zhaoming等[10]的方法并略作修改。取4.2 mL TMP溶于5 mL 5 mol/L HCl溶液，純水定容至25 mL中，40 ℃避光水浴加熱30 min，直至溶液顏色變?yōu)樯铧S色，冷卻至室溫后用6 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，4 ℃避光貯藏備用。將MDA稀釋104倍，在267 nm波長處測定濃度，摩爾吸光系數(shù)為31500 L/（mol·cm）。

往SP溶液中加入不同體積的MDA，再加入0.02%的疊氮化鈉，防止微生物生長，使MDA最終濃度分別為0、0.1、1、2、5、10 mmol/L。在4 ℃避光振蕩反應(yīng)12 h，隨后置于4 ℃去離子水中透析48 h。透析袋截留分子質(zhì)量7 kDa，每2 h換1 次去離子水（1.0 L/次）。最后冷凍干燥得到不同氧化程度的SP。

1.3.3 SP色澤的測定

色差儀采用D65光源，8 mm孔徑，近似角度10°，經(jīng)零校正、白板校正后使用。用40 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）將SP溶解，質(zhì)量濃度調(diào)至10.0 mg/mL。取適量SP溶液于直徑5 cm的透明小杯中，置于白色載物板上，以載物板和透明小杯為標(biāo)準(zhǔn)去除背景影響，每個(gè)樣品平行測定6 次，記錄樣品的亮度值（L*值）、紅度值（a*值）、黃度值（b*值），并計(jì)算色飽和度（C*值）和色調(diào)角（H*值）[17]。

1.3.4 Mb氧化狀態(tài)的測定

參考Krzywicki[18]的方法并略作修改。將SP溶液稀釋至5.0 mg/mL，離心（4 ℃、2500 ×g、20 min），過濾上清液，取濾液分別在525、545、565、572 nm波長處測定吸光度。根據(jù)式（3）～（5）計(jì)算脫氧肌紅蛋白（deoxymyoglobin，DMb）、OMb、MMb的相對含量。

式中：R1＝A572/A525，R2＝A565/A525，R3＝A545/A525。

參考Wang Zhaoming等[10]的方法并略作修改。在410 nm波長處測定5.0 mg/mL SP溶液吸光度，根據(jù)式（6）計(jì)算Mb（IV）＝O濃度。

式中：ε1＝111 L/（mmol·cm）；b為比色皿光徑，1 cm。

1.3.5 SP羰基含量的測定

參考李思寧等[19]的方法并略作修改。取1 mL 5.0 mg/mL SP溶液加入1 mL含0.02 mol/L DNPH的2 mol/L HCl溶液，以2 mol/L HCl溶液為對照，室溫下避光反應(yīng)40 min，每隔15 min振蕩混勻1 次。加入預(yù)冷的1 mL 20%三氯乙酸溶液并離心（4 ℃、10000×g、5 min），除去上清液，加入1 mL 乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液，離心洗滌沉淀3次（4 ℃、10000×g、5 min）。加入3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液，37 ℃保溫15 min溶解沉淀，離心（4 ℃、10000 ×g、3 min）除去不溶物質(zhì)，在波長370 nm處測定吸光度。以每毫克蛋白含羰基量表示（nmol/mg）。羰基含量計(jì)算公式如下：

式中：A370nm為樣品吸光度；n為稀釋倍數(shù)（3）；ε2＝22000 L/（mol·cm）；c為SP質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.6 SP總巰基含量的測定

參考鄧小蓉等[20]的方法并略作修改。取1 mL 5 mg/mL SP溶液，分別加入8 mL Tris-甘氨酸（含10.4 g/L Tris，6.9 g/L甘氨酸，1.2 g/L EDTA-2Na，8 mol/L尿素，pH8.0），混合后離心（4 ℃、8000 r/min、15 min）去除不溶性蛋白，再向溶液中加入0.5 mL 10 mmol/L DTNB混合，室溫下反應(yīng)30 min，412 nm波長處測定吸光度?？値€基含量計(jì)算公式如下：

式 中：A412nm為樣品吸光度；n為10 ；ε3＝13600 L/（mol·cm）。

1.3.7 SP二聚酪氨酸含量的測定

參考Davies等[21]的方法。將SP溶液質(zhì)量濃度調(diào)至0.1 mg/mL，設(shè)定發(fā)射波長420 nm，激發(fā)波長325 nm，狹縫寬度均為10 nm，電壓400 V。掃描至少6 次并記錄，二聚酪氨酸含量以相對熒光強(qiáng)度表示。

1.3.8 SP-MDA加合物熒光強(qiáng)度的測定

參考Wang Zhaoming等[10]的方法。將SP溶液質(zhì)量濃度調(diào)至0.5 mg/mL，激發(fā)波長390 nm，狹縫寬度均為5 nm，掃描速率1200 nm/min，電壓400 V，記錄SP在400～500 nm波長處的熒光掃描光譜。

1.3.9 SP表面疏水性的測定

參考王兆明等[6]方法。取1.0 mL 5 mg/mL SP溶液加入200 μL 1.0 mg/mL溴酚藍(lán)溶液，25 ℃振蕩10 min，離心（4 ℃、6000 r/min，15 min），取上清液進(jìn)行10 倍稀釋，在595 nm波長處測定吸光度，以溴酚藍(lán)結(jié)合量表示SP表面疏水性。

1.3.10 SP內(nèi)源熒光強(qiáng)度的測定

參考王兆明等[6]的方法。將SP溶液質(zhì)量濃度調(diào)至0.1 mg/mL，設(shè)定激發(fā)波長為295 nm，狹縫寬度均為10.0 nm，掃描速率為1200 nm/min，電壓400 V，記錄SP在310～400 nm波長處的熒光掃描光譜。

1.3.11 SP的FTIR掃描

參考Yang Nan等[22]的方法。將SP粉末放置于ATR附件上掃描，采集范圍4000～650 cm-1，掃描次數(shù)4 次，分辨率為4 cm-1，每個(gè)樣品重復(fù)掃描3 次，用Peakfit4.12軟件進(jìn)行分析。

1.3.12 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）

參考李思寧等[19]方法。將SP質(zhì)量濃度調(diào)至1.0 mg/mL，待測樣品和5×上樣緩沖液以體積比4∶1混合，沸水浴5 min，冷卻后離心（4 ℃、10000×g，5 min）。使用Bio-Rad電泳儀進(jìn)行電泳，樣品上樣體積為10 μL，采用12%分離膠、4%濃縮膠分離樣品。電泳時(shí)，80 V電壓運(yùn)行0.5 h，待指示帶到達(dá)分離膠上沿處將電壓調(diào)至120 V，運(yùn)行約1.5 h指示帶到達(dá)分離膠底部，結(jié)束電泳。用0.2%的考馬斯亮藍(lán)R-250溶液染色2 h，用脫色液（含7.5%乙醇和7.5%醋酸）脫色至背景清晰。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 MDA氧化對牦牛肉色澤穩(wěn)定性的影響

2.1.1 MDA氧化對牦牛肉SP色澤的影響

色差是新鮮肉顏色變化的特征參數(shù)[23]。由表1可知，MDA氧化后SP的a*值、b*值、C*值顯著降低，L*值、H*值顯著升高（P＜0.05）。在低濃度MDA氧化下，L*值比較穩(wěn)定[24]；當(dāng)MDA濃度高于5 mmol/L時(shí)，由于蛋白質(zhì)聚集體的大量形成引起反射率改變，導(dǎo)致L*值顯著升高（P＜0.05）[25-26]。a*值的降低被廣泛認(rèn)為是Mb自氧化導(dǎo)致MMb累積的結(jié)果，而脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的MDA可以與Mb加成，促進(jìn)肌紅蛋白氧化，導(dǎo)致MMb累積[5,10,23]。經(jīng)MDA氧化后SP的b*值下降，劉文軒等[17]表示可能是MMb的累積導(dǎo)致。C*值和H*值是反映肉色穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，C*值越大、H*值越小，肉色越鮮紅[17,27]。隨著MDA濃度的增加，C*值逐漸減小、H*逐漸增大（P＜0.05），說明MDA氧化使SP發(fā)生褐變，與圖1中SP的色澤變化吻合。研究表明，脂質(zhì)氧化主要通過介導(dǎo)Mb氧化對色澤產(chǎn)生影響[8]。MDA作為脂質(zhì)氧化的代表性活性醛，其濃度越大，脂質(zhì)氧化程度越深，色澤穩(wěn)定性越低。

圖1 MDA氧化對牦牛肉SP色澤的影響Fig. 1 Effect of MDA oxidation on the color of yak meat SP

表1 MDA氧化對牦牛肉SP的L*、a*、b*、C*、H*值的影響Table 1 Effect of MDA oxidation on the L*,a*,b*,C* and H* values of yak meat SP

2.1.2 MDA氧化對牦牛肉Mb氧化狀態(tài)的影響

肉色的呈現(xiàn)主要取決于Mb氧化還原狀態(tài)[26]。如圖2所示，隨著MDA濃度增大，SP中DMb、OMb含量逐漸減少，MMb含量、Mb（IV）＝O濃度逐漸增多（P＜0.05），肉色逐漸劣變。大量研究證實(shí)了脂質(zhì)氧化與Mb的氧化存在緊密關(guān)聯(lián)[4,10,12,23,28]。脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的活性醛MDA，容易擴(kuò)散至SP中，與Mb發(fā)生共價(jià)加成，從而加速M(fèi)b的氧化[2,8]。DMb與OMb經(jīng)MDA氧化后形成MMb，當(dāng)MDA濃度為2 mmol/L時(shí)，MMb含量達(dá)59.295%。一般認(rèn)為，MMb的生成使肉類褪色，當(dāng)MMb含量達(dá)50%時(shí)，肉呈現(xiàn)黃褐色，失去銷售價(jià)值[13]。此外，在DMb和OMb氧化過程中會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2-·）、中性超氧自由基（O2-），相互反應(yīng)形成H2O2等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)與MMb反應(yīng)進(jìn)一步生成高價(jià)肌紅蛋白，如四價(jià)鐵的超鐵肌紅蛋白自由基、Mb（IV）＝O等[3,6,10]。高價(jià)肌紅蛋白被認(rèn)為是肉中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化的強(qiáng)促氧化劑[10]。Wang Zhaoming等[10]研究結(jié)果亦表明MDA不僅促進(jìn)了兔肉中Mb自氧化，還能誘導(dǎo)高價(jià)的Mb（IV）＝O的形成，從而促進(jìn)形成氧化環(huán)境，轉(zhuǎn)而再加重Mb的氧化應(yīng)激。說明MDA氧化不僅促進(jìn)了Mb自氧化，還可能通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致Mb（IV）＝O形成，不僅導(dǎo)致了色澤穩(wěn)定性的降低，還促進(jìn)了肉中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化。

圖2 MDA氧化對牦牛肉SP中Mb氧化狀態(tài)的影響Fig.2 Effect of MDA oxidation on the oxidation state of Mb in yak meat SP

2.2 MDA對牦牛肉SP理化特性的影響

2.2.1 MDA氧化對牦牛肉SP羰基含量的影響

在劇烈的MDA氧化介導(dǎo)下，DNPH法測定的羰基含量反映了脂質(zhì)氧化產(chǎn)物對蛋白質(zhì)造成的氧化損傷程度[29]。如圖3所示，當(dāng)MDA濃度高于0.1 mmol/L，隨著M D A 濃度增加，S P 羰基含量隨之顯著增加（P＜0.05）。蛋白質(zhì)羰基化主要有4 種途徑，其中脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的MDA可以通過Michael加成將羰基引入蛋白質(zhì)，引起羰基含量的增加[30]。Estévez等[29]研究結(jié)果也表明，MDA與蛋白質(zhì)可以發(fā)生親核反應(yīng)生成Schiff堿，促進(jìn)蛋白質(zhì)羰基化。說明脂質(zhì)氧化促使了SP的氧化損傷。

圖3 MDA氧化對牦牛肉SP羰基含量和總巰基含量的影響Fig.3 Effect of MDA oxidation on the carbonyl and total sulfhydryl contents of yak meat SP

2.2.2 MDA氧化對牦牛肉SP總巰基含量的影響

SP中的多種酶類物質(zhì)大多具有半胱氨酸殘基，是巰基的主要來源[6]。如圖3所示，MDA濃度超過0.1 mmol/L后，S P 總巰基含量隨著M D A 濃度增大而逐漸減少（P＜0.05），說明SP的氧化程度隨脂質(zhì)氧化程度增加而加劇。研究表明，MDA可以與半胱氨酸等氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)，導(dǎo)致巰基含量下降[31]。經(jīng)MDA氧化后蛋白質(zhì)巰基遭受不可逆損傷可能形成二硫鍵，使SP巰基損失，并促進(jìn)蛋白質(zhì)聚合[32]。

2.2.3 MDA氧化對牦牛肉SP二聚酪氨酸含量的影響

酪氨酸受到自由基、H2O2等活性物質(zhì)攻擊形成二聚酪氨酸，導(dǎo)致廣泛的蛋白質(zhì)間和蛋白質(zhì)內(nèi)交聯(lián)，在一定程度上反映了蛋白質(zhì)的氧化程度[7]。如圖4所示，經(jīng)MDA氧化后，SP的二聚酪氨酸含量顯著增加（P＜0.05）。袁海娜等[33]研究MDA氧化乳清蛋白時(shí)觀察到二聚酪氨酸含量的降低，并認(rèn)為MDA的直接引入未產(chǎn)生自由基，酪氨酸單體之間無法交聯(lián)形成二聚酪氨酸。而牦牛肉中肌紅蛋白含量較高，同時(shí)MDA促進(jìn)了SP中Mb自氧化，生成H2O2等活性物質(zhì)，從而促進(jìn)了二聚酪氨酸的生成，使SP氧化程度加重[3,8,10]。

圖4 MDA氧化對牦牛肉SP二聚酪氨酸含量的影響Fig.4 Effect of MDA oxidation on the dimeric tyrosine content of yak meat SP

2.2.4 MDA氧化對牦牛肉SP-MDA加合物熒光強(qiáng)度的影響

蛋白質(zhì)與MDA的相互作用會(huì)產(chǎn)生潛在的各種有毒加合物并導(dǎo)致蛋白質(zhì)的交聯(lián)[31]。如圖5所示，MDA為0 mmol/L時(shí)，400～500 nm處沒有吸收峰出現(xiàn)；隨MDA濃度增加，在463 nm左右出現(xiàn)吸收峰，且熒光強(qiáng)度隨之增強(qiáng)，說明SP-MDA加合物的形成和累積。MDA可以與蛋白質(zhì)和氨基酸殘基之間形成Schiff堿或Micheal加合物，其中Nε-(2-丙烯醛)賴氨酸是MDA與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的主要形式[2,10]。Estévez等[29-30]也表示MDA及其降解產(chǎn)物與賴氨酸等堿性氨基酸之間可反應(yīng)形成穩(wěn)定的加合物，如1-氨基-3-亞氨基丙烯型丙二醛-賴氨酸加合物、1,4-二氫吡啶-3,5-二甲醛、3,5-二甲酰基-1,4-二氫吡啶-4-基吡啶等。此外，SP-MDA加合物的出現(xiàn)也證實(shí)了SP羰基化的形成[10]。

圖5 MDA氧化對牦牛肉SP-MDA加合物含量的影響Fig. 5 Effect of MDA oxidation on the content of yak meat SP-MDA adducts

2.2.5 MDA氧化對牦牛肉SP表面疏水性的影響

表面疏水性可以反映蛋白質(zhì)分子表面的疏水性氨基酸殘基的分布情況，與蛋白質(zhì)分子之間的疏水相互作用密切相關(guān)[6]。如圖6所示，隨MDA濃度增加，SP表面疏水性顯著下降（P＜0.05）。據(jù)報(bào)道[34]，MDA可以氧化大豆蛋白表面的氨基酸殘基，使一些氨基酸殘基的疏水側(cè)鏈轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水基團(tuán)，形成可溶性聚集物，然后MDA與蛋白質(zhì)內(nèi)部氨基酸殘基反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)部分解折疊和疏水性基團(tuán)的暴露，最后蛋白質(zhì)交聯(lián)導(dǎo)致可溶性聚集體進(jìn)一步聚集，最終形成不溶性聚集體，使表面疏水性降低。此外，劇烈的蛋白質(zhì)羰基化和疏水基團(tuán)之間共價(jià)交聯(lián)等也會(huì)引起蛋白質(zhì)的聚集[7,35]。因此，可能是MDA氧化導(dǎo)致了SP聚集，引起表面疏水性的降低。

圖6 MDA氧化對牦牛肉SP表面疏水性的影響Fig.6 Effect of MDA oxidation on surface hydrophobicity of yak meat SP

2.2.6 MDA氧化對牦牛肉SP內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響

在熒光激發(fā)波長為295 nm時(shí)，蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來自色氨酸，色氨酸殘基對微環(huán)境變化敏感，因此通過熒光強(qiáng)度的變化可以獲取蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能信息[36]。由圖7可知，當(dāng)MDA為0.1 mmol/L時(shí)SP內(nèi)源熒光光譜與0 mmol/L時(shí)重合，無明顯變化；當(dāng)MDA濃度逐漸增大，熒光強(qiáng)度逐漸下降，SP三級構(gòu)象發(fā)生變化[6]。Traverso等[9]指出MDA氧化誘導(dǎo)羊血清蛋白交聯(lián)聚集，導(dǎo)致色氨酸被包埋，熒光強(qiáng)度下降。孫領(lǐng)鴿等[37]亦在MDA氧化核桃分離蛋白中得出相似結(jié)論。因此，可能是MDA與SP反應(yīng)引起蛋白質(zhì)聚集，使SP內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低。

圖7 MDA氧化對牦牛肉SP內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響Fig.7 Effect of MDA oxidation on intrinsic fluorescence intensity of yak meat SP

2.2.7 MDA氧化對牦牛肉SP二級結(jié)構(gòu)的影響

FTIR是測定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的有效工具[38]。如圖8所示，SP在酰胺A帶、酰胺I帶、酰胺II帶以及酰胺III帶等附近出現(xiàn)明顯吸收峰。經(jīng)MDA氧化后SP圖譜出現(xiàn)紅移或藍(lán)移，其中酰胺II帶最大吸收峰藍(lán)移超過10 cm-1。據(jù)報(bào)道，酰胺II帶中包含無規(guī)卷曲和聚集的β-折疊等信息，反映了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)成分的差異[39]。因此，MDA可能引起了SP的結(jié)構(gòu)變化。

圖8 牦牛肉SP的FTIR圖譜Fig.8 FTIR profile of yak meat SP

通過進(jìn)一步分析對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化敏感的酰胺I帶和酰胺III帶，確認(rèn)MDA氧化后SP二級結(jié)構(gòu)的變化情況[38]。分別對SP譜圖中酰胺I帶（1700～1600 cm-1）、酰胺III帶（1330～1220 cm-1）進(jìn)行基線校正、去卷積、二階求導(dǎo)和Guass擬合，計(jì)算得α-螺旋（1660～1651、1330～1296 cm-1）、β-折疊（1640～1600、1250～1220 cm-1）、β-轉(zhuǎn)角（1700～1661、1295～1271 cm-1）和無規(guī)卷曲（1650～1641、1270～1251cm-1）的相對含量[40]。如圖9所示，經(jīng)一定程度的MDA氧化后，SP的α-螺旋、無規(guī)卷曲相對含量顯著減少，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角相對含量顯著增多（P＜0.05）。李睿[41]在MDA氧化豬肉源SP中得到相似結(jié)果。據(jù)報(bào)道，無序肽鏈可以重新排列形成大量分子內(nèi)或分子間β-折疊結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集[42-43]，從而引起無規(guī)卷曲的減少與β-折疊的增多。此外，在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)形成過程中，MDA可以與肽鍵形成氫鍵，或者與自由氨基反應(yīng)減少氫鍵的數(shù)量，破壞了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[34]。因此，MDA氧化可能促使蛋白質(zhì)α-螺旋向β-折疊、β-轉(zhuǎn)角無序轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致肽鏈重排，引起蛋白質(zhì)聚集，破壞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

圖9 MDA氧化牦牛肉SP二級結(jié)構(gòu)的影響Fig.9 Effect of MDA oxidation on the secondary structure of yak meat SP

2.2.8 MDA氧化對牦牛肉SP蛋白質(zhì)交聯(lián)的影響

SP主要包括一些代謝酶類、伴侶蛋白和肌紅蛋白等[14,19]。如圖10所示，隨著MDA濃度增加，小分子條帶逐漸模糊弱化直至消失，在頂部逐漸有新的高分子條帶產(chǎn)生。研究表明，當(dāng)?shù)鞍佐驶瘒?yán)重時(shí)小分子蛋白會(huì)逐漸形成大聚集體，從而引起高分子化合物的生成[35]。說明MDA氧化逐漸促進(jìn)了SP的氧化聚集[6]。MDA作為交聯(lián)劑，可以通過Michael加成反應(yīng)促進(jìn)蛋白質(zhì)交聯(lián)[10,29]。同時(shí)，巰基的損失、二聚酪氨酸的生成和加合物的形成均表現(xiàn)了MDA對SP交聯(lián)聚集的促進(jìn)作用。

圖10 MDA氧化牦牛肉SP的SDS-PAGE圖譜Fig.10 SDS-PAGE profile of MDA oxidation in yak meat SP

2.3 相關(guān)性分析

在加工與貯藏過程中，MDA與食品蛋白質(zhì)的相互作用引起蛋白質(zhì)褐變、蛋白質(zhì)變性、蛋白質(zhì)交聯(lián)聚集等，導(dǎo)致蛋白質(zhì)理化性質(zhì)變化和營養(yǎng)特性的下降[31]。如圖11所示，Pearson相關(guān)性結(jié)果表明MDA濃度與肉色穩(wěn)定性指標(biāo)、SP理化性質(zhì)指標(biāo)均呈現(xiàn)顯著相關(guān)性（P＜0.05）。MDA濃度與a*值、b*值、C*值、DMb含量和OMb含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與H*值、MMb含量和Mb（IV）＝O濃度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），說明MDA氧化降低了色澤穩(wěn)定性。MDA濃度與羰基、二聚酪氨酸、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量呈顯著正相關(guān)，與總巰基含量、表面疏水性、α-螺旋和無規(guī)卷曲含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），說明MDA促進(jìn)了SP氧化，改變了SP的構(gòu)象，破壞了SP結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。同時(shí)，a*值、C*值、DMb含量、OMb含量與羰基、二聚酪氨酸、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量負(fù)相關(guān)（P＜0.05），H*值、MMb含量、Mb（IV）＝O濃度與總巰基、表面疏水性、α-螺旋、無規(guī)卷曲負(fù)相關(guān)（P＜0.05），說明SP的氧化聚集與色澤穩(wěn)定性的降低強(qiáng)相關(guān)。因此，本研究認(rèn)為MDA氧化改變了SP理化性質(zhì)，從而降低了肉色穩(wěn)定性。

圖11 MDA氧化、牦牛肉SP理化性質(zhì)、色澤穩(wěn)定性相關(guān)性分析Fig.11 Correlation analysis between MDA oxidation and physicochemical properties and color stability of yak meat SP

3 結(jié)論

構(gòu)建MDA氧化體系，研究了脂質(zhì)氧化對牦牛肉SP結(jié)構(gòu)及色澤穩(wěn)定性的影響。作為脂質(zhì)氧化的代表性物質(zhì)，MDA可以通過直接與SP發(fā)生反應(yīng)和間接介導(dǎo)Mb氧化，導(dǎo)致SP羰基化、巰基損失、二聚酪氨酸生成和蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)破壞而重排聚集。同時(shí)，MDA的直接反應(yīng)和間接介導(dǎo)引起了牦牛肉色澤穩(wěn)定性的下降。Pearson相關(guān)性分析表示，MDA氧化程度、SP理化性質(zhì)、色澤穩(wěn)定性之間具有強(qiáng)相關(guān)性。該研究為剖析脂質(zhì)氧化與牦牛肉肉色穩(wěn)定性關(guān)系提供數(shù)據(jù)支持，為調(diào)控脂質(zhì)氧化保護(hù)肉色提供理論依據(jù)。