孫 強(qiáng)，王瑞丹，黃紀(jì)念,2,*，蘆 鑫，宋國(guó)輝，游 靜

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002；2.河南省特色油料作物基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002）

芝麻，又稱胡麻、脂麻，是中國(guó)主要的油料作物之一。目前，芝麻主要用于制油，由于國(guó)內(nèi)對(duì)芝麻香油的喜愛，芝麻榨油工藝中有高溫烘烤生香工藝。經(jīng)過(guò)高溫處理后，芝麻餅粕中芝麻蛋白發(fā)生嚴(yán)重變性，限制后續(xù)加工利用[1-2]。為了充分利用資源，擴(kuò)大芝麻蛋白的應(yīng)用范圍，對(duì)高溫芝麻餅粕進(jìn)行一定處理進(jìn)而制備功能肽具有重要意義。

大量研究證實(shí)，通過(guò)體內(nèi)消化釋放或體外制備的不同生物活性肽具有抗疲勞、降血壓、提高免疫力、降血脂、抗菌等多種生理功能，且易被人體消化吸收，食用安全性高[3]。食源性功能肽的制備大多是利用酶法水解[4-5]，但該方法存在轉(zhuǎn)化率低、水解速率低、蛋白酶價(jià)格昂貴等局限性，長(zhǎng)時(shí)間酶解還會(huì)導(dǎo)致微生物污染[6]。亞臨界水是指溫度在沸點(diǎn)（100 ℃）以上，臨界溫度（374 ℃）以下仍保持為液體狀態(tài)的水，又稱為高溫水、高溫液態(tài)水、超加熱水等。在亞臨界水狀態(tài)下，酸/堿能夠催化反應(yīng)較快進(jìn)行，且與常溫狀態(tài)相比，僅需要很少的酸/堿催化劑即可。可見，亞臨界水技術(shù)是一種綠色環(huán)保、前景廣闊的萃取技術(shù)，具有設(shè)備操作簡(jiǎn)單、成本低、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，又具有良好的滲透與溶解能力，在副產(chǎn)物深加工方面得到了廣泛關(guān)注[7-8]。目前已有開展亞臨界水制備寡肽與氨基酸等相關(guān)研究，并表明該技術(shù)利用高溫芝麻粕資源可行[9]，但尚未明確利用亞臨界水技術(shù)制備功能肽的序列與構(gòu)效關(guān)系。此外，如何克服亞臨界水水解蛋白質(zhì)斷裂位點(diǎn)無(wú)專一性、獲得的肽段重現(xiàn)性不好等缺點(diǎn)，控制反應(yīng)產(chǎn)生所需要的寡肽仍需繼續(xù)深入研究。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotension converting enzyme，ACE）對(duì)血壓起重要的調(diào)節(jié)作用。ACE能催化血管緊張素I過(guò)多地轉(zhuǎn)化為血管緊張素II，使心肌收縮加強(qiáng)，致使血壓升高。同時(shí)使具有血管舒張作用的舒緩激肽失活，引發(fā)血壓升高。臨床上高血壓患者大多數(shù)使用合成ACE抑制劑（如賴諾普利）控制血壓的升高，這類藥物會(huì)產(chǎn)生味覺功能紊亂、皮疹、血壓過(guò)度偏低等副作用[10-11]，因此食源性ACE抑制肽是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。本研究在亞臨界水狀態(tài)下，利用酸催化水解芝麻蛋白制備ACE抑制肽，并對(duì)其進(jìn)行分離純化，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，篩選典型芝麻ACE抑制肽，同時(shí)以比較分子場(chǎng)分析（comparative molecular force field analysis，CoMFA）方法建立寡肽的三維定量構(gòu)效關(guān)系（three dimensional quantitative structure-activity relationship，3D-QSAR）模型，以揭示寡肽分子周圍立體場(chǎng)和靜電場(chǎng)分布對(duì)ACE抑制活性的影響，利用AdmetSAR對(duì)其吸收、代謝、毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并利用分子對(duì)接分析其與ACE分子的結(jié)合方式，探討其抑制作用的分子機(jī)理，進(jìn)而為芝麻蛋白的資源化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂高溫芝麻粕（蛋白（45.00±0.74）%、粗脂肪（2.54±0.03）%、水分（6.98±0.17）%、灰分（10.45±0.14）%、總糖（35.03±1.10）%）由本實(shí)驗(yàn)室自制；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）Genview科技有限公司；ACE、馬尿酰組氨酰亮氨酸（N-hippuryl-His-Leu，HHL）、鄰苯二甲醛（1,2-phthalic dicarboxaldehyde，OPA）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；超濾膜UE010（截留分子質(zhì)量10 kDa）、UE005（截留分子質(zhì)量5 kDa）、UE003（截留分子質(zhì)量3 kDa）、納濾膜（截留分子質(zhì)量150 Da）中科瑞陽(yáng)膜技術(shù)有限公司；乙腈、三氟乙酸為色譜級(jí)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；寡肽LFRAR、LFRAV、LFRYF、LFRNF、LFREF、AFRAF、MFRAF、VFRAF、NVFRGF、DVFRGF、LFRAFD、EVFRGF由無(wú)錫亞肽生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

WHF-0.5型反應(yīng)釜 威海自控反應(yīng)釜有限公司；TGL20M-II高速冷凍離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；XS205電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Infinite200 Pro酶標(biāo)儀 奧地利Tecan公司；NGC QuestTM10 Plus色譜系統(tǒng) 美國(guó)伯樂(lè)公司；Cary eclipse熒光光譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；Testcell C-70平膜裝置 日本東電公司；Ultimate 3000毛細(xì)管高效液相色譜儀、Q ExactiveTMHybridQuadrupole-Orbitrap?電噴霧-組合型離子阱Orbitrap質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher科技公司。

1.3 方法

1.3.1 低溫亞臨界水處理芝麻蛋白

采用堿溶酸沉的方法從脫脂高溫芝麻粕中提取芝麻蛋白，以1∶50（g/mL）的比例向芝麻蛋白中加入蒸餾水，攪拌混勻后采用5 mol/L HCl溶液和5 mol/L NaOH溶液將混合液的pH值調(diào)節(jié)至1.5后，轉(zhuǎn)移入反應(yīng)釜中以125 ℃加熱60 min。反應(yīng)后的水解液以5000 r/min離心20 min，收集上清液并調(diào)至pH 7.0，5000 r/min再次離心20 min，取上清液于4 ℃保存。

1.3.2 超濾分離水解液

將水解液裝入平膜裝置，采用納濾膜（截留分子質(zhì)量150 Da）進(jìn)行脫鹽，操作壓力3 MPa，轉(zhuǎn)速400 r/min，透過(guò)液達(dá)到初始溶液體積的80%時(shí)，終止納濾，重復(fù)3 次，截留液備用。將截留液依次通過(guò)UE010、UE005和UE003進(jìn)行超濾，得到4 個(gè)組分，分別為＞10、5～10、3～5、＜3 kDa，采用BCA法[12]測(cè)定各組分寡肽濃度，并測(cè)定各組分ACE抑制活性的IC50值。

1.3.3 NGC QuestTM10 Plus色譜分析條件

將超濾獲得的活性最強(qiáng)的組分采用0.22 μm的濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣到NGC QuestTM10 Plus色譜系統(tǒng)。色譜柱：Shim-pack GIS C18制備柱（20 cm×250 mm，10 μm）；流動(dòng)相A為含有0.1%三氟乙酸的乙腈，流動(dòng)相B為含有0.1%三氟乙酸的超純水；流速7.5 mL/min；進(jìn)樣體積1 mL；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；梯度洗脫條件為：0～50 min，45%～50% A、55%～50% B。使用收集器以0.5 min/管收集流動(dòng)相，將各色譜峰對(duì)應(yīng)試管混合，測(cè)定ACE抑制活性并計(jì)算IC50值，確定活性最強(qiáng)的峰組分進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.3.4 質(zhì)譜分析條件

將活性最強(qiáng)的峰組分進(jìn)行前處理后采用Ultimate 3000毛細(xì)管高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，上樣量5 μL，分析柱采用Acclaim PepMap RPLC C18（150 μm×150 mm，1.9 μm），洗脫條件為：流動(dòng)相A為0.1%甲酸-2%乙腈溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-80%乙腈溶液，流速600 nL/min，0～5 min，94%～91% A、6%～9% B；5～20 min，81%～86% A、9%～14% B；20～50 min，86%～70% A、14%～30% B；50～58 m i n，70%～60% A、30%～40% B；58～60 min，60%～5% A、40%～95% B。采用電噴霧-組合型離子阱Orbitrap質(zhì)譜儀，毛細(xì)管溫度270 ℃，電壓2.2 kV，一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：分辨率70000，電荷掃描范圍m/z100.0～1500.0。二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：分辨率17500，以碰撞誘導(dǎo)裂解方式激活產(chǎn)生碎片離子，激活Q為0.250 s-1，激活時(shí)間30.000 ms，最小信號(hào)要求1500.0，以m/z100開始掃描。質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)采用從頭測(cè)序的方法進(jìn)行寡肽序列解析。

1.3.5 ACE抑制肽生理活性與安全性預(yù)測(cè)

對(duì)鑒定到9 個(gè)芝麻ACE抑制肽的生理活性采用Admet SAR2.0（http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar2/）進(jìn)行預(yù)測(cè)，其中以人體腸道吸收、經(jīng)口生物利用度表征吸收特性，血腦屏障表征分布特性，以細(xì)胞色素P450底物與抑制活性表征代謝特性，以致癌性、埃姆斯誘變、鉀離子通道的α亞基編碼基因抑制活性、蜂毒性、生物降解表征毒性特性[13]。

1.3.6 3D-QSAR構(gòu)效模型的建立

3D-QSAR是利用數(shù)學(xué)建模的方式描述一類具有相似特征結(jié)構(gòu)與其生物活性之間定量關(guān)系的方法，其中最為廣泛使用的是CoMFA法，CoMFA模型的三維等勢(shì)圖可以形象直觀地顯示分子結(jié)構(gòu)區(qū)域與生物活性之間的關(guān)系[14]。將13 個(gè)寡肽序列在SYBYL-X 2.1.1軟件中protein building模塊錄入，寡肽的電荷模式采用MMFF94模擬，能量?jī)?yōu)化采用MMFF94力場(chǎng)的Powell共軛梯度算法（最大運(yùn)算次數(shù)10000，能量?jī)?yōu)化終止標(biāo)準(zhǔn)0.0005 kcal/（mol·?））。采用ACE抑制活性最高的寡肽LFRAF為模板，其中以FR作為骨架構(gòu)建CoMFA模型，分子疊加圖見圖1。采用偏最小二乘法和逐一剔除法對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，在交叉驗(yàn)證系數(shù)（Q2）＞0.5、誤差預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)差（R2）＞0.6條件下證明模型建立成功，具有良好的預(yù)測(cè)能力[15-16]。

圖1 LFRAF及其衍生肽的分子疊加圖Fig.1 Structural alignment of LFRAF and its derived peptides

1.3.7 分子對(duì)接分析

采用分子對(duì)接軟件Molecular Operating Environment（MOE）探究寡肽與人體ACE分子的結(jié)合方式。從PDB網(wǎng)站（https://www.rcsb.org/structure/1086）下載含有賴諾普利的人體ACE分子的PDB文件導(dǎo)入MOE軟件，質(zhì)子化后，除去水分子，作為模板[17]。所選肽段作為配體，能量最小化后載入MOE中Dock模塊，拼接方法為Proxy Triangle，優(yōu)化設(shè)置為Rigid Receptor，得分選用London d G和GBV/WSA d G方式，從30 個(gè)構(gòu)型中選取最佳構(gòu)型與ACE分子進(jìn)行拼接。

1.3.8 ACE抑制活性的測(cè)定

參考Wang Ruidan等[18]的方法，將15 μL樣液（無(wú)抑制的反應(yīng)液中以蒸餾水代替）與30 μL底物溶液（5 mmol/L HHL的氯化鈉磷酸緩沖液）混合，然后加入30 μL 12.5 mU/mL的ACE酶液，于37 ℃水浴反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后加入125 μL 1.2 mol/L NaOH溶液終止酶反應(yīng)，接著加入30 μL含2% OPA的甲醇溶液，混合均勻后靜置20 min，隨后加入40 μL 6 mol/L HCl溶液終止衍生反應(yīng)。對(duì)照液中以蒸餾水代替。將反應(yīng)溶液稀釋10 倍后使用熒光光譜儀測(cè)定熒光吸收強(qiáng)度，測(cè)定條件為：激發(fā)波長(zhǎng)340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)455 nm，狹縫寬度5 nm。樣液的ACE抑制率計(jì)算公式如下：

式中：a為抑制劑與ACE都存在時(shí)的熒光吸收強(qiáng)度；b為抑制劑不存在而ACE存在時(shí)的熒光吸收強(qiáng)度；c為抑制劑存在而ACE不存在時(shí)的熒光吸收強(qiáng)度；d為抑制劑與ACE都不存在時(shí)的熒光吸收強(qiáng)度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3 次，采用SPSS 13.0進(jìn)行方差分析，其中P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 芝麻水解液的超濾分離

采用超濾的方法分別獲得分子質(zhì)量＞10、5～10、3～5 kDa和＜3 kDa四個(gè)組分的寡肽溶液，其ACE抑制活性見表1。不同分子質(zhì)量的ACE抑制活性存在顯著差異。低分子質(zhì)量組分的ACE抑制活性強(qiáng)，尤其＜3 kDa的組分最強(qiáng)，而高分子質(zhì)量組分的ACE抑制活性弱。此結(jié)果與Lin Kai[19]、Fu Weiqing[20]等的研究結(jié)果一致。低分子質(zhì)量組分肽鏈短，空間位阻小，更易進(jìn)入ACE活性口袋，從而改變ACE的催化活性。因此通過(guò)低分子質(zhì)量超濾膜的寡肽溶液能夠提高肽段的ACE活性。

表1 超濾分離芝麻蛋白水解液所得組分及ACE抑制活性Table 1 Ultrafiltration fractions from sesame protein hydrolysate and their ACE inhibitory activity

2.2 NGC QuestTM10 Plus色譜系統(tǒng)分離水解液

對(duì)＜3 kDa組分進(jìn)行NGC色譜系統(tǒng)分離，所得圖譜見圖2，共分離得到5 個(gè)色譜峰（P1～P5），該5 個(gè)峰組分的保留時(shí)間及ACE抑制活性測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可知，峰1的IC50值最低，表明其ACE抑制活性最強(qiáng)。因此選擇峰1組分進(jìn)行后續(xù)質(zhì)譜鑒定。

表2 NGC色譜系統(tǒng)分離芝麻蛋白水解液所得峰組分及ACE抑制活性Table 2 ACE inhibitory activity of peaks separated in NGC chromatography system

圖2 NGC QuestTM10 Plus系統(tǒng)分離色譜圖Fig.2 Chromatogram of the fraction less than 3 kD in NGC QuestTM 10 Plus system

2.3 芝麻ACE抑制肽的序列鑒定

通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析峰1組分，其總離子流圖見圖3。共鑒定得到9 個(gè)寡肽，理論分子質(zhì)量范圍在639.4319～933.4821 Da，其ACE抑制活性的IC50值見表3。其中KPLLK、LFRAFD的ACE抑制活性相對(duì)較弱，LFRAF的相對(duì)含量最高，且具有強(qiáng)ACE抑制活性，其二級(jí)質(zhì)譜圖如圖4所示。

圖3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定峰1組分的總離子流圖Fig.3 Total ion current chromatogram of peak 1 identified by liquid chromatography-mass spectrometry

2.4 ACE抑制肽生理活性與安全性預(yù)測(cè)

吸收、分布、代謝和排泄特性是鑒定寡肽生物活性的關(guān)鍵因素[21]。功能肽在體內(nèi)發(fā)揮作用必須能被人體吸收、代謝，且毒副作用小。因此有必要對(duì)寡肽的生理活性與安全性進(jìn)行預(yù)測(cè)。由圖5可知，除PELLRKL、PNPRSFF、LPLLK，其他寡肽能通過(guò)小腸吸收。除LPLLK的所有寡肽具有高血腦屏障，表明不會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成影響。此外，寡肽不屬于細(xì)胞色素P450的底物，也沒有其抑制活性，表明不會(huì)干擾細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)。由毒性特性結(jié)果可知，盡管DVFRGF、TFHNLFR、LFRAFD預(yù)測(cè)具有鉀離子通道的α亞基編碼基因抑制活性，但所有寡肽不會(huì)致癌，安全性高。上述結(jié)果表明，所得芝麻ACE抑制肽不會(huì)干涉人體正常的生理活動(dòng)。

圖5 ACE抑制肽的吸收、分布、代謝和排泄預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of absorption,distribution,metabolism,and excretion of ACE inhibitory peptides

2.5 3D-QSAR構(gòu)效模型的建立

以LFRAF中FR為骨架，衍生其他寡肽，基于CoMFA方法建立LFRAF、LFRAR、LFRAV、LFRYF、LFRNF、LFREF、AFRAF、MFRAF、VFRAF、NVFRGF、DVFRGF、EVFRGF、LFRAFD的半數(shù)抑制濃度負(fù)對(duì)數(shù)值（pIC50）的3D-QSAR模型，以揭示寡肽周圍立體場(chǎng)和靜電場(chǎng)分布對(duì)ACE抑制活性的影響，探討寡肽ACE抑制活性的分子機(jī)理。寡肽IC50及轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的pIC50值如表4所示，其中pIC50用于CoMFA計(jì)算中的因變量，pIC50預(yù)測(cè)值與測(cè)量值之間的殘差值均小于0.7。以ACE抑制肽LFRAF及其衍生寡肽所構(gòu)建的CoMFA模型統(tǒng)計(jì)參數(shù)見表5。由表5可知，模型交叉驗(yàn)證系數(shù)（Q2）=0.514＞0.5，非交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)（R2）=0.997＞0.6，并且具有較低的預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)誤差0.032（＜0.05）和較高的F值，表明建立的模型具有良好的內(nèi)部穩(wěn)定性，且模型中立體場(chǎng)與靜電場(chǎng)對(duì)pIC50值的貢獻(xiàn)率分別為50.9%和49.1%，說(shuō)明CoMFA模型中立體場(chǎng)與靜電場(chǎng)對(duì)抑制肽分子與ACE之間的相互作用都有重要影響，且立體場(chǎng)的影響較靜電場(chǎng)大。上述結(jié)果證明所建立的CoMFA模型具有良好的預(yù)測(cè)能力和可靠性。

表4 LFRAF及衍生寡肽的ACE抑制活性Table 4 ACE inhibitory activity of LFRAF and its derived peptides

表5 LFRAF及衍生寡肽的CoMFA模型統(tǒng)計(jì)參數(shù)Table 5 Statistical parameters of LFRAF and its derived peptides in CoMFA model

圖6A為以pIC50最高的寡肽LFRYF為模板的CoMFA模型的三維立體作用分布圖，其中，綠色區(qū)域表示增大取代基體積有利于提高活性，黃色區(qū)域表示減小立體位阻有利于提高活性。由立體場(chǎng)的空間分布可知，在第1位氨基酸殘基（N端）處存在綠色區(qū)域，表明在此處引入大基團(tuán)有利于提高活性。例如寡肽MFRAF的ACE抑制活性強(qiáng)于LFRAF。Yan Wenli等[22]研究同樣報(bào)道了這一結(jié)論，即N端處有大基團(tuán)氨基酸的寡肽具有較強(qiáng)的ACE抑制活性。在末位氨基酸殘基（C端）的羰基處存在黃色區(qū)域，表明在此處引入小基團(tuán)有利于提高活性，其側(cè)鏈處存在綠色區(qū)域，表明在此處引入大基團(tuán)有利于提高活性。如寡肽LFRAF活性明顯強(qiáng)于LFRAV的結(jié)果很好驗(yàn)證了這一點(diǎn)?；钚员容^高的ACE抑制肽的C末端多為色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）等芳香族氨基酸以及脯氨酸（Pro）。齊春艷[23]采用分子對(duì)接和3D-QSAR相結(jié)合的方法對(duì)以Phe為C末端的ACE抑制二、三肽進(jìn)行研究，篩選出Gly-Glu-Phe（GEF）、Val-Glu-Phe（VEF）、Val-Arg-Phe（VRF）以及Val-Lys-Phe（VKF）4 種三肽。

圖6 CoMFA模型中立體場(chǎng)（A）和靜電場(chǎng)（B）對(duì)LFRYF活性的影響Fig.6 Effect of steric field (A) and electrostatic field (B) on activity of LFRYF in CoMFA model

圖6B為以pIC50最高的寡肽LFRYF為模板的CoMFA模型的分子周圍靜電場(chǎng)分布圖，藍(lán)色區(qū)域表示增大基團(tuán)正電荷有利于化合物活性的提高，紅色區(qū)域則表示在此處引入帶負(fù)電荷的基團(tuán)對(duì)活性有利。由靜電場(chǎng)的空間分布可知，N端處存在紅色區(qū)域，表明在N端處引入帶負(fù)電荷的基團(tuán)有利于寡肽活性的提高。C端羧基的羥基處存在紅色區(qū)域，表明在此處引入帶負(fù)電荷的基團(tuán)能夠提高ACE抑制活性。然而在氨基附近也存在藍(lán)色區(qū)域，意味著在該處引入帶正電荷的基團(tuán)有利于ACE抑制活性的提高。盡管靜電相互作用較為復(fù)雜，但C末端帶正電荷取代基的作用是ACE抑制活性的主要因素。該研究結(jié)果與Lu Xin等[24]研究結(jié)果一致。例如，寡肽LFRAR中C端為帶有正電荷的精氨酸（Arg）氨基酸殘基，其活性與寡肽LFRAF、LFRAV相比大大提高。這一結(jié)果證實(shí)了之前的報(bào)道，Sun Lixia[25]、Mirzaeia[26]等研究發(fā)現(xiàn)帶正電荷的氨基酸如賴氨酸和精氨酸的C端殘基有助于提高ACE抑制活性。寡肽在C末端區(qū)域含有Phe、Leu、Val、Ile、Pro、Arg和Lys等疏水性氨基酸或堿性氨基酸，這些氨基酸更傾向于與ACE催化活性位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，從而抑制ACE的催化活性[27]。

由表4、5和圖6可知，ACE抑制肽的氨基酸序列對(duì)其ACE抑制能力十分重要。3D-QSAR模型是研究氨基酸序列對(duì)ACE抑制肽抑制能力影響的較為準(zhǔn)確的方法，目前利用該模型進(jìn)行分析多以二肽、三肽為主，對(duì)于ACE抑制肽的QSAR研究還處于起步階段，能夠準(zhǔn)確描述所有ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)與其抑制活性的模型鮮有報(bào)道，因此也存在著一定的局限性[28]。

2.6 分子對(duì)接分析

通過(guò)分子對(duì)接從分子層面探究寡肽分子與ACE的相互作用方式，揭示其抑制作用機(jī)理。據(jù)報(bào)道，ACE分子主要有S1、S2和S1’三個(gè)活性口袋。其中S1口袋包含Ala354，Glu384和Tyr523殘基，S2口袋包含Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520殘基，S1’口袋包含Glu162殘基。同時(shí)ACE在其活性位點(diǎn)有一個(gè)輔酶因子鋅離子（Zn2+），可以與His383，His387、Glu411形成離子鍵或配位鍵[29-30]。由圖7a可知，LFRAF與賴諾普利的位置基本一致，能夠整個(gè)嵌入ACE分子內(nèi)部，與ACE分子良好對(duì)接。圖7b顯示了ACE氨基酸殘基與LFRAF相互作用的結(jié)果。LFRAF通過(guò)氫鍵與ACE分子的Glu162、His353、Lys511結(jié)合，通過(guò)離子鍵與Asp377、His387及Zn701結(jié)合，通過(guò)疏水相互作用與Phe527、His353結(jié)合。因此，LFRAF能夠占據(jù)ACE分子的催化活性中心（S2和S1’），同時(shí)與非活性中心的氨基酸殘基緊密結(jié)合，從而有效抑制血管緊張素I進(jìn)入ACE催化活性位點(diǎn)，進(jìn)而抑制ACE的催化活性。同時(shí)，與Zn2+結(jié)合能夠?qū)е耑n2+與ACE分子間形成的四面體螯合結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲變形，使ACE催化活性下降[31]。該結(jié)果同時(shí)驗(yàn)證2.4節(jié)的研究結(jié)果，即C末端側(cè)鏈處大基團(tuán)尤其芳香族氨基酸的存在有助于提高ACE抑制活性。

圖7 LFRAF與ACE分子對(duì)接結(jié)果圖Fig.7 Molecular docking results of LFRAF with ACE

3 結(jié)論

芝麻蛋白水解液經(jīng)過(guò)超濾分離得到分子質(zhì)量＜3 kDa組分具有最強(qiáng)的ACE抑制作用。采用NGC QuestTM10 Plus色譜系統(tǒng)進(jìn)一步純化＜3 kDa組分，并通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀從峰1組分中鑒定到9 個(gè)ACE抑制肽，這些寡肽安全性高，不會(huì)干涉人體正常的生理活動(dòng)。基于CoMFA方法成功建立LFRAF的3D-QSAR模型，立體場(chǎng)與靜電場(chǎng)對(duì)ACE抑制活性影響相當(dāng)。ACE抑制肽的C端處帶正電荷氨基酸殘基與側(cè)鏈處引入大基團(tuán)能夠提高ACE抑制能力。LFRAF通過(guò)占據(jù)ACE的S2、S1’活性口袋，并與Zn2+結(jié)合從而抑制ACE活性。后續(xù)有必要開展寡肽的酶抑制類型研究及體內(nèi)評(píng)價(jià)，尋找并結(jié)合信息學(xué)手段快速篩選活性強(qiáng)的ACE肽段，為開發(fā)高效食源性ACE抑制肽提供理論指導(dǎo)。