朱亞軍，葉 韜，魯玉鳳，夏立志，劉松昆，盧曜昆，姜紹通，林 琳，陸劍鋒

（合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點實驗室，農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009）

魚糜是通過去頭、去內(nèi)臟、切片、去骨、洗滌、脫水、精濾、冷凍保護劑混合后進行冷凍等各種分步工藝生產(chǎn)的精制魚肌原纖維蛋白，是一種可以直接用于食品加工的中間產(chǎn)品[1]。當加工魚糜制品時，在碎魚肉中加入2%～3%的食鹽，經(jīng)絞碎、擂潰或斬拌，能夠形成非常黏稠且具可塑性的溶膠狀肉糊，即魚糜。這是因為在食鹽和擂潰的機械破壞作用下，促進了肌原纖維的粗絲和細絲的溶解，在溶解過程中其主要成分肌球蛋白和肌動蛋白吸收大量的水分并聚合形成肌動球蛋白的溶膠[2]。除了增強魚糜產(chǎn)品的風味，在魚糜加工過程中，鹽主要用來提取肌原纖維蛋白，以獲得所需的質(zhì)地和味道。但目前大量科學研究表明，過量食用鹽會導致許多健康風險，如高血壓、心臟病和其他心血管疾病[3]。如果不添加鹽，肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）就不可能聚集，因為缺乏肌球蛋白溶解和展開[4]。此外，鹽濃度的降低對魚糜蛋白質(zhì)的可提取性和溶解性產(chǎn)生不利影響，導致凝膠結(jié)構(gòu)和機械性能較差[5]。

對于低鹽魚糜凝膠產(chǎn)品主要有兩種研究思路，一種是挖掘外源添加劑或鈉鹽替代品，另一種是開發(fā)新的加工技術(shù)，以彌補低鹽對凝膠性能的不良影響。如Tuankriangkrai等[6]報道了改性木薯淀粉（羥丙基磷酸二淀粉）對經(jīng)過不同凍融循環(huán)的大眼鯛（Priacanthus tayenus）魚肉凝膠的質(zhì)地和感官特性的改善作用。還有一些研究發(fā)現(xiàn)，在適當?shù)募庸l件下，添加氨基酸[7]、多糖[8]、油[9]和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶[10]可以顯著改善低鹽魚糜的凝膠特性和質(zhì)地。另外據(jù)報道，高靜水壓[11]、微波[12]、超聲波[13]、微波與蒸汽結(jié)合[14]等技術(shù)，以部分取代傳統(tǒng)的水浴加熱均對魚糜凝膠的性質(zhì)有所改善。

蛋白質(zhì)由氨基酸組成，通過生化或物理方法使氨基酸殘基和多肽鏈發(fā)生變化，可以對蛋白質(zhì)進行改性，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性能[15]。磷酸化可以改變膳食蛋白質(zhì)的功能特性，如溶解性、熱穩(wěn)定性、乳化特性、起泡特性和凝膠特性[16]。某些肌原纖維蛋白和肌球蛋白特定絲氨酸殘基處的磷酸化可能對肌動蛋白解離至關重要，這可能有助于改善肉制品的保水能力、質(zhì)地和嫩度[17]。分離蛋白的磷酸化可能是一種修飾過程，可以產(chǎn)生帶有負電荷側(cè)鏈的蛋白質(zhì)。肌原纖維蛋白的磷酸化可以調(diào)節(jié)肌肉收縮，從而影響肌動球蛋白的解離。Chen Lijuan等[18]發(fā)現(xiàn)，肌原纖維蛋白磷酸化可能通過收縮機制和糖酵解影響肉類僵硬度，最終影響肉類產(chǎn)品的嫩度。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化蛋白分離物可以通過Zn2+更好地交聯(lián)，從而產(chǎn)生更大的凝膠破斷力和破斷距離[19]?；瘜W磷酸化是指用磷酸鹽化合物對食品蛋白質(zhì)進行化學修飾，以獲得磷酸化蛋白質(zhì)。三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，STP）有較多的負電荷，可提高海鮮、肉類和家禽的持水能力，已被批準作為食品添加劑。研究表明，STP在被用于單角革鲀（Aluterus monoceros）皮膚中明膠的磷酸化中，可以改善明膠的性質(zhì)[20]。

圓苞車前子殼是一種富含可溶性和不溶性膳食纖維黏性多糖，具有降低膽固醇、通便和提高胰島素敏感性等功能，目前主要用于藥物和藥理補充劑中[21]。結(jié)冷膠（gellan gum，GG）是一種陰離子微生物多糖，其凝膠形成能力強、組織相容性和復配性較好[22]。魔芋膠（konjac glucomannan，KGM）是一種非離子型高分子雜多糖，具有良好的凝膠性和保水性，由于其在降血糖、降血脂和抗癌等方面的作用而在食品及醫(yī)藥領域應用廣泛[23-24]。這3 種多糖親水膠都被證明對改善魚糜凝膠特性具有一定積極作用。Singh等[25]研究了圓苞車前子殼粉（psyllium husk powder，PHP）對金線魚糜凝膠流變學和結(jié)構(gòu)特性的影響，結(jié)果表明適當?shù)腜HP增加了凝膠的破斷力和持水性，誘導形成更緊密的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)以改善凝膠性能。Wang Xuejiao等[26]報道了4 種多糖（卡拉膠、高酰基結(jié)冷膠、黃原膠、刺槐豆膠）對乳化魚腸中鹽釋放和咸度的影響，發(fā)現(xiàn)卡拉膠提高了香腸的咸味感知，能夠調(diào)節(jié)質(zhì)地屬性和微觀結(jié)構(gòu)促進鹽釋放，以減少香腸中的鹽添加。近年來，盡管已有廣泛研究通過添加親水膠體對魚糜凝膠的性質(zhì)進行改善，但鮮有其對于磷酸化魚糜制品性質(zhì)的影響分析。根據(jù)研究，離子不斷包圍溶液中的蛋白質(zhì)和多糖分子，通過靜電相互作用或水合效應影響蛋白質(zhì)和多糖的溶解度、流變學和膠凝特性，而多價離子可同時與多種氧結(jié)合，并作為多糖和蛋白質(zhì)的交聯(lián)劑[27]。而磷酸化使得魚糜蛋白質(zhì)體系的負電荷增加，其是否對蛋白質(zhì)和多糖親水膠的相互作用有影響，并且是如何影響的，值得關注，這可為低鹽魚糜制品的開發(fā)提供新的思路和解決方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AAA級冷凍鰱魚魚糜，含6%蔗糖，20 kg/塊，購自井力水產(chǎn)食品有限公司，貯存在-20 ℃條件下不超過2 個月；中華絨螯蟹蟹肉購自于福恩食品科技有限公司。

磷酸化試劑（STP、PHP、GG和KGM）浙江一諾生物科技有限公司；食品級腸衣 大潤發(fā)超市；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、羅丹明（Rhodamine）B熒光染色液 索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

S2-5斬拌機 廣州旭眾食品機械有限公司；SU-50型卡扣機 浙江瑞安特豐機械廠；HZ-2兩孔數(shù)顯水浴鍋江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠；TA-XT物性分析儀 英國Stable Micro System公司；CT15RT高速冷凍離心機 上海天美生化儀器與設備工程有限公司；FA1104N電子分析天平 海民橋精密科學儀器有限公司；Q200差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 美國TA公司；Anton Paar MCR旋轉(zhuǎn)流變儀 奧地利安東帕有限公司；A1激光共聚焦顯微鏡 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 混合凝膠的制備

取適量冷凍魚糜解凍（4 ℃、12 h）→斬拌（添加1.8%食鹽和0.3% STP）至肉糊狀→（手動）灌腸→兩端卡扣密封→二段水浴加熱→冰水冷卻→放置過夜（4 ℃）→測定凝膠特性。

對照組的親水膠添加量為0%，PHP、GG和KGM添加量為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。

對STP誘導蛋白質(zhì)化學磷酸化實驗條件的具體研究內(nèi)容已做單因素試驗，魚糜與蟹肉混合比例的確定根據(jù)梁峰等[28]結(jié)果確定。

1.3.2 凝膠強度測定

使用TA-XT物性分析儀測定SG和MG樣品的破斷力（g）和破斷距離（cm）。樣品切割成直徑約為30 mm、高度約為25 mm的圓柱體。測試具體設置和參數(shù)如下：魚糜穿刺模式，P/5S球形探頭（直徑5 mm），預壓縮速率1.0 mm/s，下壓縮速率1.5 mm/s，測試速率1.0 mm/s，恢復速率10.0 mm/s，按壓距離15 mm，觸發(fā)類型：自動（g），傳感力5.0 g。對每個樣品進行6 份測量，刪除最大值和最小值后計算平均值。凝膠強度計算如式（1）所示：

凝膠強度=破斷力×破斷距離（1）

1.3.3 持水性測定

持水性的分析采用離心法進行，該方法基于Liang Feng等[13]的方法，并稍作修改。準確稱量約2 mm厚的凝膠樣品（1～2 g）（W1），并將其切成兩等份，用兩層濾紙包裹并轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中。每個樣品在室溫（約24～26 ℃）以8000 r/min離心10 min。離心后，再次稱量樣品（W2）。每個實驗進行3 次平行。根據(jù)式（2）計算每個樣品的持水性：

1.3.4 動態(tài)流變

使用直徑25 mm平行板，載物臺與平板間的距離為0.1 mm，升溫速率2 ℃/min，溫度范圍10～90 ℃，振蕩頻率0.1 Hz，應變2%，溫度、儲能模量（G’）和損耗模量（G”）的數(shù)據(jù)每30 s記錄一次。根據(jù)式（3）計算損耗因子（tanδ）：

1.3.5 DSC

準確稱取約15 mg的混合凝膠放入液體鋁坩堝中并密封，保護氣味氮氣，流速為50 mL/min左右，溫度范圍為20～90 ℃，升溫速率為5 ℃/min，保溫5 min。記錄熱流隨溫度變化的數(shù)據(jù)，隨后使用TA analysis軟件進行分析，得到各個特征峰的變化溫度和熱焓。

1.3.6 激光共聚焦顯微鏡

用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配制含有2 種熒光染料的染色液FITC 0.25 g/L，Rhodamine B 0.025 g/L。每個樣品稱取0.25 g，裝入1.5 mL離心管。每管加入1 mL熒光染料，重懸樣品。室溫染色10 min，3000 r/min離心5 min，去除上清多余的染色液。加入1 mL PBS重懸，靜置10 min，3000 r/min離心5 min，去除上清多余的染色液。如此再重復一次。用Nikon A1激光共聚焦儀器拍照，使用40 倍物鏡進行，F(xiàn)ITC使用488 nm激發(fā)光，Rhodamine B使用561 nm激發(fā)光。

1.4 統(tǒng)計分析

使用SPSS 25.0中Duncan模型進行單因素方差分析，用于確定從樣本中獲得實驗數(shù)據(jù)之間的差異顯著性（95%置信范圍）。實驗數(shù)據(jù)以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種親水膠對磷酸化低鹽MG凝膠強度的影響

不添加STP的磷酸化低鹽MG凝膠強度見圖1a～c。由圖1d可知，隨著添加量的增加，PHP處理組凝膠的破斷力先增加后下降（P＜0.05），添加量為0.1%時，破斷力最大。GG處理組凝膠的破斷力變化趨勢與PHP處理組變化趨勢一致，不同的是，在添加0.1%的GG后，混合凝膠破斷力的變化值較大。KGM的添加對凝膠破斷力的改善效果不明顯（P＞0.05），在添加量≥0.3%時，凝膠破斷力呈下降趨勢。由圖1e可知，PHP添加量對凝膠的破斷距離沒有顯著影響（P＞0.05），GG和KGM處理組的凝膠破斷距離均隨著添加量的增加而呈下降的趨勢，不同的是，GG組凝膠的破斷距離在添加量≥0.2%時開始顯著降低（P＜0.05），而KGM處理組破斷距離降低出現(xiàn)在添加量≥0.3%時。由圖1f可知，3 種親水膠均在添加量為0.1%時，磷酸化MG的凝膠強度最佳。在添加量0.1%～0.2%之間，隨PHP和GG添加量的增加，凝膠強度顯著下降（P＜0.05），之后隨著添加量的增加，凝膠強度逐漸下降，但下降程度不顯著（P＞0.05）。不同類型的蛋白質(zhì)或不同類型的多糖的存在都會影響凝膠網(wǎng)絡的性質(zhì)，其中多糖被認為影響在加熱過程中膨脹的蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)和多糖之間、各種蛋白質(zhì)之間以及蛋白質(zhì)和水之間的相互作用決定了生物聚合物的溶解度、它們形成黏彈性凝膠的能力以及它們在界面上的行為[29]。因此在磷酸化MG中添加適量的多糖可以增強凝膠網(wǎng)絡的形成，而在添加量較大時，多糖鏈的長度超過一定限度后所產(chǎn)生的空間位阻效應不利于蛋白質(zhì)的聚集[27]。當添加量為0.1%時，PHP、GG、KGM均不同程度地提高了磷酸化MG凝膠強度，GG和KGM增強效果更加顯著，這可能是較低添加量的GG和KGM通過氫鍵與肌原纖維網(wǎng)絡發(fā)生相互作用，從而加強凝膠基質(zhì)的膠凝性質(zhì)。隨著添加量的增加，這3 種親水膠都造成混合凝膠強度下降，其中較高含量的PHP對凝膠強度的不利影響比同含量的GG和KGM小。這可能是3 種親水膠阻礙磷酸化MG蛋白質(zhì)鏈之間的相互作用程度不同，從而造成凝膠性能的差異。另外據(jù)Gao Zhiming等[27]報道，不同電荷的離子可以引起多糖構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，而這種構(gòu)象的轉(zhuǎn)變似乎影響蛋白質(zhì)/多糖靜電絡合程度。因此推測蛋白質(zhì)/多糖靜電絡合可通過控制多糖的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，從而控制食品的膠凝性質(zhì)和黏彈性。

圖1 3 種親水膠添加量對磷酸化低鹽魚糜/蟹肉混合凝膠強度的影響Fig.1 Effect of addition of three hydrophilic colloids on breaking force,deformation and gel strength of phosphorylated low-salt surimicrab meat mixed gels

2.2 3 種親水膠對磷酸化低鹽MG持水性的影響

持水性代表了蛋白質(zhì)在三維凝膠網(wǎng)絡中保持水的能力，并經(jīng)常用于衡量魚糜凝膠的品質(zhì)。如圖2所示，在未磷酸化的低鹽MG中，PHP、GG和KGM 3 種親水膠對混合凝膠的持水性無顯著影響，但經(jīng)過磷酸化處理后，同一添加量的PHP、GG和KGM對凝膠持水性逐漸產(chǎn)生顯著影響，且親水膠添加量增加時，這種影響更為明顯，推測不同親水膠添加量可能會造成不同程度的磷酸化水平。GG的添加明顯改善了凝膠持水性，雖然隨著GG添加量的繼續(xù)增加，持水性有輕微下降，但相比未添加GG的MG，持水性總體呈增加趨勢。這可能是由于GG中含有豐富的親水性基團，可以在凝膠基質(zhì)中形成更小的水通道，導致水分子被封鎖在蛋白質(zhì)基質(zhì)中，從而增強了凝膠的持水性[30]。隨著PHP添加量的增加，PHP處理組的持水性不斷增加，當添加量達到0.4%時，PHP組的持水性降低，表明PHP在適當水平上決定了凝膠網(wǎng)絡的持水能力。隨著KGM添加量增加，KGM對混合凝膠持水性有不利影響。持水性的降低可能是因為熱誘導凝膠形成后肌原纖維蛋白-多糖系統(tǒng)分離，減弱了肌原纖維蛋白的聚集程度，從而導致持水性的降低[31]。

圖2 3 種親水膠添加量對磷酸化低鹽魚糜/蟹肉混合凝膠持水性的影響Fig.2 Effect of addition of three hydrophilic colloids on water-holding capacity of phosphorylated low-salt surimi-crab meat mixed gels

2.3 3 種親水膠對磷酸化低鹽MG黏彈性的影響

動態(tài)流變常用于研究魚糜的熱聚集，流變學涉及物質(zhì)的流動和變形，特別是它們在固體和流體之間的瞬態(tài)區(qū)域中的行為，G’描述了膠凝體系的彈性特性并代表了凝膠基質(zhì)的強度，能夠反映凝膠的彈性及轉(zhuǎn)變溫度[32]。圖3表示混合凝膠的動態(tài)黏彈性行為變化，溫度較低時，PHP、GG和KGM處理組的混合凝膠G’略微下降，接著隨溫度升高G’持續(xù)增加，這表明凝膠基質(zhì)在更高的非共價作用（例如二硫鍵和疏水相互作用）下建立了強凝膠網(wǎng)絡。Luo Huabin等[33]發(fā)現(xiàn)，魚糜淀粉體系中G’在低溫階段出現(xiàn)增加，此結(jié)果與本實驗不一致，這可能是磷酸化MG的電負性增加，破壞了蛋白質(zhì)的靜電相互作用，對低溫階段的蛋白質(zhì)分子聚集有一定的延緩作用[34]。加熱過程中G’的增加被認為是肌球蛋白重鏈和肌動蛋白的變性，表明形成致密且高彈性的蛋白質(zhì)凝膠，而部分凝膠樣品的G’在加熱后期出現(xiàn)下降，這可能是氫鍵形成的初始結(jié)構(gòu)在加熱過程中部分破裂或蛋白質(zhì)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)遭到破壞[35]。在本研究中，PHP和GG的添加提高了G’開始降低的溫度，這有利于凝膠性質(zhì)的改善，而當其添加量過多時，多糖自身的凝膠特性或許對混合凝膠蛋白質(zhì)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)有不利作用。因此在流變測定結(jié)果的高溫階段，有幾組凝膠的G’沒有明顯降低，但其凝膠特性并沒有得到改善。從G”觀察各組凝膠所形成網(wǎng)絡的黏度特性，G”表現(xiàn)出與G’相似的變化模式，G”始終小于G’，表明在MG體系中，是彈性為主體的凝膠體。

圖3 3 種親水膠添加量對磷酸化低鹽魚糜/蟹肉混合凝膠黏彈性的影響Fig.3 Effects of addition levels of three hydrophilic colloids on viscoelasticity of phosphorylated low-salt surimi-crabmeat mixed gels

為進一步得到不同添加量的3 種親水膠與磷酸化混合凝膠性質(zhì)與流變學變化的聯(lián)系，進行tanδ的計算，反映凝膠的相對黏彈性，純固體的δ為0°，純液體為δ為90°[36]。如圖3所示，所有處理組的tanδ＜1.0且具有相似的變化軌跡，表現(xiàn)為略微降低—增加—降低，表明所有魚糜在熱凝膠化后將經(jīng)歷相同程度的溶膠—凝膠轉(zhuǎn)變。tanδ曲線在30～40 ℃之間有峰，是蛋白質(zhì)加熱后肌球蛋白結(jié)構(gòu)展開增加了溶膠的黏度，當溫度約為42 ℃（凝膠凝固階段）時，由于蛋白質(zhì)網(wǎng)絡形成，分子之間的二硫鍵和疏水相互作用得到加強，導致剛性和強度增加，流動性減弱，因此tanδ下降。tanδ的變化差異可能是肌原纖維蛋白或干擾膠凝組分濃度和功能的差異，以及與蛋白質(zhì)將水截留到凝膠網(wǎng)絡中的能力有關[37]。PHP添加量為0.1%時，凝膠的tanδ最小，其凝膠彈性最佳，這與前面的凝膠性質(zhì)測定結(jié)果一致。在溫度低于42 ℃，GG添加量0.5%的凝膠tanδ最小，在溫度高于42 ℃后，添加量0.4%凝膠tanδ最小。從圖3可以看出，0.4%和0.5%組的峰較平，而0.1%的峰范圍更大，與凝膠性質(zhì)的結(jié)果結(jié)合分析，可以推測，0.1% GG和MG溶膠凝膠化階段充分變性，少量的GG分子熱運動因升溫加劇，大分子纏結(jié)減弱，氫鍵的斷裂充分，從而在后續(xù)魚糕化過程中與魚糜/蟹肉之間的熱聚集效果更好。KGM在加熱開始時，對照組的tanδ最小，而在魚糕化過程中，隨著溫度升高變化不明顯，90 ℃時可以看到對照組和0.1%組的tanδ相差不大且在所有添加量組中最小，這和兩者凝膠破斷力和破斷距離無明顯差異的結(jié)果一致。

2.4 3 種親水膠對磷酸化低鹽MG蛋白變性的影響

由圖4可以看到，在45 ℃和68 ℃附近出現(xiàn)了吸熱峰，表明肌球蛋白的頭部和尾部以及肌動蛋白相繼發(fā)生了結(jié)構(gòu)融化或者解折疊的變性，在76 ℃左右出現(xiàn)放熱峰，表征了肌動蛋白在此溫度下發(fā)生了分子聚集行為[38]。

圖4 3 種親水膠添加量對磷酸化低鹽魚糜/蟹肉混合凝膠蛋白變性的影響Fig.4 Effects of addition levels of three hydrophilic colloids on protein denaturation in phosphorylated low-salt surimi-crab meat mixed gels

如表1、2所示，MG的Peak 1中，3 種親水膠處理組的起始溫度變化相似，均比對照組顯著增加；PHP處理組的峰值溫度隨著添加量增加而略增加，溫度區(qū)間較之對照組明顯縮短；添加GG和KGM處理組峰值溫度無變化，除了0.4% GG的凝膠，其他添加量組的溫度變化區(qū)間較之對照組縮短；除了添加0.5% KGM的凝膠，其他添加量組的溫度變化區(qū)間較之對照組縮短。PHP添加量較少（0.1%～0.2%）和較多（0.5%）時，Peak 1熱焓明顯減少，GG處理組Peak 1熱焓無變化，KGM處理組Peak 1熱焓較之對照組明顯減少。第1個峰對應于肌球蛋白的吸熱轉(zhuǎn)變，轉(zhuǎn)變溫度預計是其他作用力導致氫鍵和蛋白質(zhì)聚集破裂的跡象，這是打破氫鍵并逐漸將蛋白質(zhì)的穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)展開到其變性結(jié)構(gòu)中所必需的。Zhang Tao等[29]的研究發(fā)現(xiàn)脫乙?；哪в笃细事毒厶歉淖兞税⒗辜喻L魚糜的肌動蛋白的內(nèi)熱轉(zhuǎn)變，而對肌球蛋白的吸熱轉(zhuǎn)變無影響，這與本研究結(jié)果不一致，這可能是由于磷酸化的魚糜/蟹肉蛋白質(zhì)靜電作用增強，增加了肌球蛋白與親水膠之間的靜電絡合作用，增加了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，導致轉(zhuǎn)變溫度的升高。溫度區(qū)間的縮短表明，肌球蛋白的轉(zhuǎn)變可以在較短的時間內(nèi)完成，而焓值減少，表明在添加親水膠的磷酸化MG體系中，肌球蛋白的變性需要更高的溫度和更少的能量，在變性過程中溫度將成為主要因素。

表1 添加PHP、GG和KGM的混合凝膠DSC特征溫度Table 1 DSC characteristic temperatures of mixed gels with the addition of PHP,GG or KGM

表2 添加PHP、GG和KGM的混合凝膠DSC熱焓Table 2 DSC enthalpy of mixed gels with the addition of PHP,GG or KGM

第2個峰對應于肌動蛋白的內(nèi)熱轉(zhuǎn)變，在混合凝膠的Peak 2中，PHP和GG處理組沒有明顯變化；KGM處理組隨添加量增加，峰值溫度有所降低，并且溫度區(qū)間總體呈縮短趨勢，在添加量0.1%時顯著縮短。隨添加量增加，PHP組凝膠的Peak 2的熱焓值先增加后減小，GG處理組的Peak 2熱焓值較之對照組增加，KGM處理組Peak 2熱焓先增加后減小，在添加量0.3%達到最大值。肌動蛋白分子量較小，由之前的研究結(jié)果表明[39]，肌動蛋白磷酸化水平較高，但在凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)形成中參與度較小。因此可以推測，肌動蛋白在低溫階段的聚集程度低，KGM與其相互作用，導致氫鍵被破壞的轉(zhuǎn)變溫度降低和溫度區(qū)間的縮短。但從焓值來看，PHP和KGM的少量添加增強了MG的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，GG對熱穩(wěn)定性的改善作用似乎隨著添加量的增加而增加，這可能是由于其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的不同[40]。

第3個峰對應于肌動蛋白的分子聚集行為，在混合凝膠的Peak 3中，3 種親水膠處理組的起始溫度無明顯變化；PHP的峰值溫度在添加量0.1%時明顯降低，并且溫度區(qū)間無變化；GG組凝膠峰值溫度無明顯變化，溫度區(qū)間呈延長趨勢，添加量0.2%時最長；KGM的峰值溫度先增加后降低，并且在0.1%達到最大，其溫度區(qū)間無明顯變化。PHP處理組Peak 3的變化未發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律，對照組和添加量0.5%組中出現(xiàn)最大值；GG處理組Peak 3熱焓值呈降低趨勢；KGM處理組 Peak 3熱焓在添加量較少（0.1%）和較多（0.4%～0.5%）時達到最大值。PHP的強吸水性可能會破壞維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力，不利于肌動蛋白聚集形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，導致峰值溫度降低和焓值增加；同樣，KGM在添加量較少時，也對肌動蛋白聚集存在阻礙。

2.5 DSC特征溫度及熱焓與MG特性相關性分析

從圖5可以看出，每個峰的溫度區(qū)間和起始溫度均顯著負相關。Peak 1的熱焓和Peak 1和Peak 2溫度區(qū)間相關，Peak 2和Peak 3的熱焓和溫度顯著相關。Peak 1和Peak 2的熱焓顯著正相關（P＜0.05），Peak 2和Peak 3的熱焓顯著負相關（P＜0.05）。這表明，在3 種親水膠參與的磷酸化MG中，肌球蛋白和肌動蛋白之間會發(fā)生相互作用，并且這種作用有利于增強蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，肌動蛋白的穩(wěn)定性影響肌動蛋白分子的聚集，而肌球蛋白的穩(wěn)定性對肌動蛋白分子聚集行為無顯著影響。持水性與Peak 1的峰值溫度顯著正相關（P＜0.05）。一般而言，持水性應與凝膠強度有顯著相關性，本實驗所得結(jié)果與傳統(tǒng)魚糜凝膠出現(xiàn)了差異，這可能是親水膠的加入一方面增強了凝膠網(wǎng)絡的結(jié)構(gòu)，另一方面由于其良好的吸水性搶奪了凝膠網(wǎng)絡中的水分。破斷力、破斷距離和凝膠強度三者顯著正相關（P＜0.01）。凝膠破斷力與Peak 3峰值溫度顯著正相關（P＜0.01）；破斷距離和凝膠強度與Peak 2和Peak 3的峰值溫度顯著正相關，與Peak 2的熱焓顯著負相關，破斷距離和Peak 1的峰值溫度正相關，表明在更高溫度下進行肌球蛋白頭部轉(zhuǎn)變和肌動蛋白分子的聚集，將有利于增強凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，而肌動蛋白的穩(wěn)定可能不利于形成更好的凝膠。

圖5 DSC特征溫度及熱焓與混合凝膠特性相關性分析熱圖Fig.5 Correlation analysis of DSC characteristic temperatures and enthalpy with properties of mixed gels

2.6 激光共聚焦顯微鏡的微觀結(jié)構(gòu)觀察

為進一步獲得親水膠處理的磷酸化MG的形成及其分布行為的微觀結(jié)構(gòu)信息，進行激光共聚焦顯微鏡觀察，如圖6所示，綠色區(qū)域和紅色區(qū)域分別代表魚糜/蟹肉蛋白和親水膠。Weinbreck等[41]提出，凝聚是液體/液體膠體結(jié)合產(chǎn)生相分離，導致形成富含膠體的相，稱為凝聚物，以及膠體中較差的剩余相。蛋白質(zhì)和少量親水膠之間形成的凝聚物，其靜電鍵可以可逆的方式不斷斷裂和改變，凝聚物相隨著時間的推移而緩慢地重新排列擴散，發(fā)生凝聚相的重排以形成更均勻的結(jié)構(gòu)[42]。實驗觀察到，在少量添加PHP時，蛋白質(zhì)和多糖重疊部分顯黃綠色，隨著添加量的增加，逐漸出現(xiàn)紅色小顆粒；在GG添加量增多時，甚至出現(xiàn)了大片紅色連接區(qū)；而KGM的添加似乎沒有帶來聚集的紅色部分。紅色區(qū)域的單獨出現(xiàn)表明，在混合凝膠體系中，蛋白質(zhì)和多糖出現(xiàn)了相分離，當?shù)鞍踪|(zhì)和多糖這兩種親水膠體混合時，每種膠體的行為方式與沒有另一種親水膠體時一般不會完全相同。由于在親水膠體混合過程中的熵增益較低，因此比相容混合物更常觀察到相分離。熱力學相容的混合物僅在特定條件下存在，例如在非常低的濃度下，或者當兩種親水膠體在化學性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上確實非常相似時[43]。由此看來，PHP和GG在較低濃度下，多糖能和魚糜/蟹肉蛋白質(zhì)發(fā)生良好的作用，同時表現(xiàn)為機械性能的改善，而在多糖濃度增加后，相分離的發(fā)生導致凝膠性能無明顯變化，甚至開始下降。在KGM處理組中未觀察到蛋白質(zhì)和多糖的兩相分離，其觀察結(jié)果與凝膠強度測定結(jié)果不一致，據(jù)Xiong Zhiyu等[7]報道，在草魚（Ctenopharyngodon idella）魚糜中添加較高水平的魔芋葡甘聚糖可以顯著增加魚糜凝膠的斷裂力和破斷距離，改善其持水性能，其最佳添加是1%。KGM不帶電荷，屬非離子多糖，其受鹽的影響很小，和磷酸化魚糜/蟹肉可能未發(fā)生化學相互作用或者在兩體系間化學相互作用較弱，從2.1節(jié)結(jié)果看，低濃度KGM對磷酸化混合凝膠強度無改善作用，而高濃度時，則對凝膠有破壞作用。

圖6 激光共聚焦顯微鏡微觀結(jié)構(gòu)觀察Fig.6 Microstructure observation of mixed gels by LSCM

3 結(jié)論

PHP、GG和KGM在較低添加量（0.1%）下，多糖能和魚糜/蟹肉蛋白質(zhì)發(fā)生良好的作用，提高了混合凝膠的破斷力和凝膠強度。其中PHP和GG的添加提高了G’開始降低的溫度，G”表現(xiàn)出與G’相似的變化模式，表明在魚糜/蟹肉體系中是彈性為主體的凝膠體。添加親水膠的磷酸化魚糜/蟹肉體系中肌球蛋白的變性需要更溫度和更少能量，尤其是GG對熱穩(wěn)定性的改善效果更佳，導致肌球蛋白和肌動蛋白之間更容易發(fā)生相互作用，有利于增強蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。GG在適當添加量時持水性較高可能為這一結(jié)論提供了支持。KGM在激光共聚焦實驗中未觀察到相分離，推測KGM可能未與磷酸化混合蛋白質(zhì)發(fā)生化學性相互作用，但適量磷酸鹽的加入有利于凝膠性質(zhì)的改善。相比較PHP和KGM，適當添加量的GG可能更適合作為外源添加劑改善磷酸化低鹽魚糜/蟹肉凝膠的品質(zhì)。