滕爽,鄢永紅,沈娟,孫延勤,沈習習,王瑋*

1(南京農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術(shù)學院,江蘇 南京,210095)2(國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心(南京農(nóng)業(yè)大學),江蘇 南京,210095)3(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉及肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(南京)(南京農(nóng)業(yè)大學),江蘇 南京,210095)

我國是食用植物油消費大國,山茶籽油作為我國特有的一種高端食用植物油,因其富含人體所需的多種功能性營養(yǎng)成分,可有效預防衰老、肥胖,增強免疫力和降血糖血脂等,深受消費者青睞。然而,隨著山茶籽油價格和消費量的日趨上升,其摻假問題也日益嚴重。據(jù)報道,山茶籽油中可能摻入的植物油包括大豆油、菜籽油、花生油和玉米油等,價格便宜、易獲得,且對山茶籽油的香味與口感影響不大[1]。因此,為了保障消費者的身體健康和油脂市場的良性發(fā)展,建立相關(guān)檢測技術(shù)對山茶籽油進行摻假鑒別就顯得尤為重要。

目前,山茶籽油的摻假鑒別方法主要有GC[2-4]、GC-MS[5-7]、液相色譜法(liquid chromatography,LC)[8-10]、近紅外光譜(infrared spectroscopy, IR)法[11-14]、理化分析法[15-16]、電子鼻(electronic nose, E-nose)技術(shù)[17-19]等。LC法可以檢測山茶籽油中的特征物質(zhì),該法需消耗大量化學試劑;IR法需通過化學計量學分析結(jié)果,數(shù)據(jù)處理較為繁瑣,檢測結(jié)果穩(wěn)定性受多方面因素影響;理化分析法適用于少量樣品的檢測,重復性較差;E-nose響應速度快,檢測成本低,但受限于儀器本身漂移問題,靈敏度不夠。而GC法因其簡便快捷、準確高效,得到廣泛應用,該方法主要測定山茶籽油的脂肪酸組成及含量,對其真實屬性進行評價。但有些植物油的脂肪酸組成極其相似,難以辨別。而對各類植物油中不同的特征物質(zhì)進行定量分析,可作為摻假鑒別的重要依據(jù)[20-22]。例如山茶籽油中含有較高含量的β-香樹脂醇,而該物質(zhì)在其他植物油中含量極低甚至不存在,則該特征物質(zhì)可作為鑒別山茶籽油摻假的關(guān)鍵指標[23-24]。GC-MS法選擇性好、靈敏度高,分析結(jié)果準確可靠。因此,本試驗基于GC-MS法測定山茶籽油特征物質(zhì)β-香樹脂醇進行樣品初篩,再結(jié)合GC法檢測脂肪酸含量進行確證,建立其摻假定性鑒別研究方法,旨在為創(chuàng)新食用植物油定性鑒別方法提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料收集于國內(nèi)各食用油企業(yè),經(jīng)相關(guān)機構(gòu)認定及試驗驗證其真實屬性,包括6種山茶籽油、6種花生油、5種玉米油、5種菜籽油及3種大豆油。

標準品:β-香樹脂醇,上海源葉化學試劑有限公司;37種脂肪酸甲酯混合標準溶液,上海安譜實驗科技股份有限公司。

試劑:NaOH、KOH、甲醇、無水乙醇、NaCl、質(zhì)量分數(shù)14%三氟化硼-甲醇溶液,均為分析純,國藥化學試劑有限公司;異辛烷(色譜純),美國Thermo Fisher Scientific公司;正己烷(色譜純),德國Merck公司;試驗所用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

TSQ 8000 Evo三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀、TG-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、TG-FAME色譜柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm),美國Thermo Fisher Scientific公司;GC-2010Plus氣相色譜儀,日本Shimadzu公司;TW20水浴鍋,德國Julabo公司;CPA224S分析天平,德國Sartorius公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的制備

稱取β-香樹脂醇5.00 mg于10 mL容量瓶中,加入正己烷溶解并定容至10 mL,配制成500 mg/L的標準儲備液,在-20 ℃下保存,待用。分別移取0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、1 mL標準儲備液于10 mL容量瓶中,加入正己烷稀釋并定容至10 mL,系列濃度的混合標準溶液現(xiàn)配現(xiàn)用,供GC-MS檢測。

1.3.2 模擬混合摻假山茶籽油的制備

將花生油、玉米油、菜籽油和大豆油分別按100%、70%、50%、30%、20%、10%、5%、3%、0%的體積分數(shù)摻入山茶籽油,制成模擬摻假山茶籽油。

1.3.3 樣品前處理

β-香樹脂醇提取:稱取植物油樣品0.1 g(精確至0.000 1 g)于40 mL樣品瓶中,加入2 mL 2 mol/L KOH-乙醇溶液,渦旋混勻30 s;80 ℃水浴加熱皂化40 min,每隔10 min取出振搖30 s;結(jié)束后取出并冷卻至室溫,再加入1 mL超純水和5 mL正己烷,渦旋混勻2 min,靜置分層;將上層清液轉(zhuǎn)移至新的50 mL離心管中,下層再分別用5 mL正己烷重復萃取3次,收集提取液于上述同一離心管中。測試提取液的pH,如若pH>7,則加入約15 mL超純水將溶液洗滌至中性,渦旋混勻10 s,4 ℃、10 000 r/min離心10 min;吸取上層正己烷提取液于新的50 mL離心管中,40 ℃ N2吹近干,再加入10 mL正己烷定容,取上清液過0.22 μm濾膜,供GC-MS檢測。

脂肪酸甲酯的制備:參照GB 5009.168—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》中規(guī)定的前處理方法。

1.3.4 β-香樹脂醇測定的色譜、質(zhì)譜條件

色譜條件:TG-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度280 ℃;柱溫程序180 ℃保持3 min,以30 ℃/min升溫至300 ℃,保持10 min;流速1.0 mL/min;載氣高純氦氣(99.999%);不分流進樣,進樣量1.0 μL。

質(zhì)譜條件:質(zhì)譜接口溫度280 ℃;溶劑延遲5 min;離子源溫度230 ℃;四級桿溫度150 ℃;電離方式EI;掃描模式:SCAN∼掃描參數(shù):35～400 amu &203, 218, 426。

1.3.5 脂肪酸測定的色譜條件

參照GB 5009.168—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》中第三法(歸一化法)規(guī)定的色譜條件。

1.3.6 山茶籽油定性鑒別方法的建立

β-香樹脂醇的測定:①檢出限、定量限與線性范圍的確定:基于已建立的檢測方法,將配制好的β-香樹脂醇標準溶液上機測定,質(zhì)量濃度梯度為1、2、5、10、20、50 mg/L,共設定6個濃度點。以β-香樹脂醇質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線,以此確定最佳線性范圍以及相關(guān)系數(shù)。本試驗以3倍信噪比計算檢出限(limit of detection, LOD),10倍信噪比計算定量限(limit of quantitation, LOQ)。②準確度與精密度試驗:本試驗分別選取花生油、玉米油、菜籽油和大豆油樣品,在其中分別加入質(zhì)量濃度為5、10、25 mg/L的β-香樹脂醇標準溶液,按1.3.3節(jié)方法進行前處理,上機進行加標回收測定,根據(jù)3個濃度與6個平行測定的峰面積計算其平均回收率與相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)。③方法的實際應用:選取國產(chǎn)食用植物油25種,其中山茶籽油6種、花生油6種、玉米油5種、菜籽油5種、大豆油3種,其樣品前處理方法和檢測條件參照1.3.3和1.3.4節(jié)方法,以此評價自建方法的實際應用效果。

脂肪酸的測定:參照GB 5009.168—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》中規(guī)定的方法,采用GC檢測各類植物油以及摻假山茶籽油,以脂肪酸甲酯標準混合溶液各組分保留時間對色譜峰進行定性,采用面積歸一化法計算樣品中各脂肪酸組成及含量。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

GC-MS使用Thermo Xcalibur軟件分析數(shù)據(jù),GC使用Lab solutions軟件分析數(shù)據(jù)。所得數(shù)據(jù)使用OriginPro軟件制圖。采用SAS 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計,差異顯著性分析使用ANOVA的Duncan’s Multiple Range Test模式。所有樣品均平行測定6次,計算其RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-香樹脂醇的測定

2.1.1 檢出限、定量限和線性范圍

利用GC-MS對β-香樹脂醇的標準工作溶液進行檢測,得到其標準品色譜圖,并繪制其標準曲線,以此來確定β-香樹脂醇的定量限、檢出限和線性范圍。由圖1可知,該方法檢測β-香樹脂醇保留時間為13.08 min。線性方程為Y=210 189X+150 159。β-香樹脂醇定量限為1.7 mg/L,檢出限為0.51 mg/L,在1～50 mg/L呈良好的線性關(guān)系(R2=0.999)。

圖1 β-香樹脂醇的標準品色譜圖Fig.1 The chromatogram of β-amyrin standard product

2.1.2 準確度與精密度

本試驗選取花生油、玉米油、菜籽油和大豆油樣品,在其中分別添加3個不同質(zhì)量濃度水平的β-香樹脂醇標準溶液,并對其加標回收率與精密度進行測定,每個濃度平行測定6次。如表1所示,該方法的平均回收率為82.6%～111.5%,RSD均低于5.36%。

表1 各類植物油中β-香樹脂醇的加標回收率與精密度(n=6)Table 1 Recovery and precision of β-amyrin in various vegetable oils (n=6)

2.1.3 方法的實際應用

為評價該方法的實際應用效果,本試驗選取5類純植物油,檢測其中的β-香樹脂醇,結(jié)果見表2。6種純山茶籽油中均檢出β-香樹脂醇,其平均含量為773.59 mg/kg。而其他純植物油(花生油、玉米油、菜籽油、大豆油)中均未檢出β-香樹脂醇。

表2 市售植物油中β-香樹脂醇的含量(n=6)Table 2 β-amyrin content in commercial vegetable oil (n=6)

2.2 脂肪酸的測定

2.2.1 純植物油的脂肪酸組成分析

基于β-香樹脂醇可作為摻假山茶籽油的定性鑒別初篩指標,本試驗結(jié)合GC檢測各類植物油的脂肪酸相對含量,以提高定性鑒別的準確性。結(jié)果如表3所示,各種植物油的脂肪酸含量差異較顯著(P<0.05)。山茶籽油中的油酸平均含量為81.497%,遠高于其他植物油,而亞油酸平均含量低至8.551%。在玉米油和大豆油中亞油酸含量較高,平均含量分別為56.325%、53.685%,其在花生油和菜籽油中也有檢出,其含量均高于山茶籽油。此外,僅在菜籽油中檢測到芥酸,其含量為0.257%～10.320%。而其他脂肪酸在植物油中的含量均較低甚至未檢出。

表3 各類純植物油主要脂肪酸含量檢測結(jié)果(n=6)Table 3 Determination results of main fatty acids in various pure vegetable oils (n=6)

2.2.2 模擬摻假山茶籽油的特征脂肪酸組成分析

本試驗分別將花生油、玉米油、菜籽油和大豆油按100%、70%、50%、30%、20%、10%、5%、3%、0%的比例摻入山茶籽油,制成模擬摻假油。采用GC對摻假山茶籽油進行檢測,分析各種脂肪酸含量隨摻假比例增加而發(fā)生的變化。結(jié)果見表4,隨著其他油類摻入量的增加,油酸含量均明顯降低,亞油酸含量均明顯升高。棕櫚酸含量會隨花生油、玉米油和大豆油摻入比例的增加而升高,但變化量不大;而摻入菜籽油時,其含量會有所降低。當山茶籽油中摻入花生油和大豆油時,硬脂酸含量會有所升高,但變化不明顯。摻入任何一種植物油,α-亞麻酸的含量沒有明顯的變化規(guī)律。此外,在山茶籽油中摻入菜籽油時,芥酸含量會隨著摻入比例的增加而升高。

表4 山茶籽油中摻入各類植物油后主要脂肪酸含量檢測結(jié)果(n=6) 單位:%Table 4 Determination of main fatty acid content in camellia seed oil mixed with various vegetable oils (n=6)

由以上可知,山茶籽油中油酸含量遠高于其他植物油,且隨摻入比例的增加而降低;而亞油酸含量均低于其他植物油,會伴隨摻入比例的增加而升高,且變化規(guī)律均較明顯。因此,本文選用油酸和亞油酸作為山茶籽油摻假的鑒別指標。

2.3 摻假山茶籽油的定性鑒別

根據(jù)上述檢測結(jié)果,若待測植物油樣中β-香樹脂醇的含量大于本方法的檢出限時,則可初步判定其為純山茶籽油或摻假山茶籽油,再利用脂肪酸(油酸、亞油酸)含量的檢測分析進行確證。本文根據(jù)2.2.2節(jié)模擬摻假油脂肪酸測定結(jié)果,并結(jié)合GB 11765—2018 《油茶籽油》、GB/T 24569—2009 《地理標志產(chǎn)品 常山山茶油(含第1號修改單)》,制定摻假山茶籽油定性鑒別脂肪酸含量范圍(見表5),若待測油樣中脂肪酸組成有一項或一項以上不滿足表5的要求,則該樣品判定其摻假山茶籽油的結(jié)果為陽性;若脂肪酸含量均符合表5的要求,則該樣品判定其摻假山茶籽油的結(jié)果為陰性。根據(jù)本試驗的檢測結(jié)果可知,該方法適用于山茶籽油中摻入1種或幾種其他植物油(花生油、玉米油、菜籽油與大豆油)的定性鑒別,其摻假判定限為10%。

表5 摻假山茶籽油定性鑒別的脂肪酸指標Table 5 Fatty acid index for qualitative identification of adulterated camellia seed oil

3 討論與結(jié)論

本試驗采用GC-MS法檢測山茶籽油的特征物質(zhì)β-香樹脂醇,其出峰時間短,檢測速度快,檢出限低,在1～50 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。本試驗選取花生油、玉米油、菜籽油和大豆油樣品進行加標回收試驗,回收率較高、精密度良好,該方法適用于植物油中β-香樹脂醇的快速測定。市售植物油的檢測結(jié)果顯示,6種純山茶籽油中均檢出β-香樹脂醇,而其他純植物油(花生油、玉米油、菜籽油、大豆油)中均未檢出。因此,采用GC-MS法檢測β-香樹脂醇,可實現(xiàn)山茶籽油定性鑒別的批量初篩。

基于β-香樹脂醇可作為摻假山茶籽油的定性鑒別初篩指標,本試驗再結(jié)合GC法檢測其脂肪酸含量進行確證,提高定性鑒別的準確性。本試驗在對5種植物油中主要脂肪酸含量的檢測結(jié)果顯示,山茶籽油中的油酸平均含量高達81.497%,而亞油酸平均含量低至8.551%,這與相關(guān)標準以及文獻報道相一致[25]。其他4種植物油(花生油、玉米油、菜籽油和大豆油)中的油酸含量均遠低于山茶籽油,而亞油酸含量均遠高于山茶籽油。此外,本試驗在山茶籽油中分別按不同比例摻入其他4種植物油,檢測并分析其脂肪酸含量隨摻假比例增加而發(fā)生的變化。結(jié)果表明隨著其他油類摻入量的增加,油酸含量均明顯降低,亞油酸含量均明顯升高。因此,油酸和亞油酸含量可作為確證山茶籽油摻假的定性鑒別指標。本試驗基于GC法檢測植物油中脂肪酸的含量進行確證,該方法可實現(xiàn)山茶籽油中摻入1種或其他幾種植物油(花生油、玉米油、菜籽油與大豆油)的定性鑒別。

綜上所述,若待測植物油樣中β-香樹脂醇有檢出,油酸、亞油酸含量均符合表5要求,則判定該樣品其摻假山茶籽油的結(jié)果為陰性,其摻假判定限為10%(即山茶籽油含量<90%)。本研究可有效定性鑒別摻雜摻假山茶籽油,為山茶籽油真?zhèn)舞b別和維護油脂市場良性發(fā)展提供可靠的科學依據(jù)和堅實的技術(shù)保障。