石瑞桃,許曉敏,許喆,馬堃,鄒宇,李瑤瑤,韓世英,李婷婷,韓玲鈺

(大連民族大學 生命科學學院,遼寧 大連,116600)

我國擁有豐富的魚類資源,隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖及魚類產(chǎn)品加工產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展,魚糜制品的消費量也越來越大。魚糜制品因其食用簡便、營養(yǎng)價值高、保質(zhì)期長而受到消費者喜愛[1]。我國大連地區(qū)盛產(chǎn)鲅魚,是北方重要的經(jīng)濟魚,其具有產(chǎn)量高、肉質(zhì)肥厚、刺少等特點,是魚糜加工的主要原材料。但由于冷藏保鮮過程中魚肉蛋白容易變質(zhì),從而使魚肉的保水性、凝膠性等性能下降,影響產(chǎn)品的質(zhì)量和營養(yǎng)價值[2]。關于開發(fā)能夠提升魚糜制品品質(zhì)添加劑的研究有待進一步深入。

隨著水產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展,水產(chǎn)品生產(chǎn)中的魚皮、魚頭、魚鱗等廢棄物也隨之產(chǎn)生,而國內(nèi)的鱈魚產(chǎn)量大,加工時所產(chǎn)生的魚皮廢棄物占總重量的7%～8%,既浪費了資源,又對環(huán)境造成了極大的污染。研究表明,鱈魚皮中膠原蛋白含量占總蛋白含量的70%以上[3]。鱈魚魚皮肽由魚皮經(jīng)蛋白酶酶解獲得,具有保水性等良好的功能特性[4]?？ɡz是從紅海藻的細胞外基質(zhì)中提取的主要多糖成分,具有優(yōu)異的穩(wěn)定性和凝膠形成性能,已廣泛應用于食品和化妝品行業(yè)。當前用于魚糜產(chǎn)品加工的卡拉膠類型多是Kappa(κ-型)與Iota(ι-型),而對于Ramota(λ-型)的應用研究較少。其中,κ-卡拉膠已被廣泛應用于改善魚糜凝膠品質(zhì)。CHEN等[5]研究表明κ-卡拉膠能顯著提高鯉魚魚糜的凝膠強度。當前對κ-型、ι-型、λ-型3種不同類型卡拉膠之間的性質(zhì)差異研究并不充分。美拉德反應是由蛋白質(zhì)的游離氨基和還原糖的羰基發(fā)生的非酶促褐變的化學反應,劉建華等[6]研究表明蛋清蛋白與刺槐豆膠和瓜爾豆膠的美拉德產(chǎn)物顯著增強魚糜制品的凝膠特性。許亞彬等[7]研究表明糖基化改性蛋清粉能提高鰱魚魚糜凝膠的凝膠強度和白度。何進武等[8]研究表明糖基化大豆分離蛋白能顯著提高鯉魚魚糜凝膠的硬度、彈性和黏結性。本實驗采用干法美拉德反應,將3種不同構型的卡拉膠與鱈魚魚皮膠原蛋白肽進行糖基化反應,以鲅魚魚糜作為對象,探究3種不同構型的卡拉膠制備的糖基化產(chǎn)物對魚糜凝膠產(chǎn)生的性能影響,為保障2次成型魚糜產(chǎn)品的質(zhì)量提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱈魚魚皮膠原蛋白肽,濱州萬嘉生物科技有限公司;κ-型、ι-型、λ-型卡拉膠,源葉生物科技有限公司;KBr(光譜純),科密歐;β-巰基乙醇、1-苯胺基-8-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS),阿拉丁試劑有限公司;其他化學品和試劑均為分析級。

1.2 儀器與設備

FD-1C-50型冷凍干燥機,北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;NicoletTMiS50傅里葉變換紅外光譜儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;UV-160型紫外可見分光光度計,上海美譜達儀器有限公司;LS55熒光光譜儀,珀金埃爾默儀器有限公司;TA.XT.plus質(zhì)構儀,北京微訊超技儀器技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 鱈魚魚皮膠原蛋白肽-卡拉膠美拉德反應體系制備

將鱈魚魚皮肽溶于磷酸鹽緩沖液中(0.05 mmol/L,pH 7.0),將卡拉膠加入鱈魚魚皮肽水溶液中攪拌至完全溶解(肽∶卡拉膠質(zhì)量比4∶1),冷凍后在冷凍干燥機中凍干。將凍干樣品置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d,每2 d采集樣品,相對溫度和濕度為60 ℃和79%,制得3種不同美拉德產(chǎn)物:ι-卡拉膠-魚皮肽美拉德產(chǎn)物(ι-car-CSCP MRPs)、κ-卡拉膠-魚皮肽美拉德產(chǎn)物(κ-car-CSCP MRPs)、λ-卡拉膠-魚皮肽美拉德產(chǎn)物(λ-car-CSCP MRPs),密封保存于-20 ℃。

1.3.2 紅外光譜分析

根據(jù)李靈誠[9]的方法進行制樣,采用Nicoletis-50紅外光譜儀在4 000～400 cm-1掃描。

1.3.3 接枝度的測定

根據(jù)MAO等[10]的方法稍作修改。通過使用鄰苯二甲醛(o-phthaldialdehyde,OPA)測定游離氨基酸的減少來測定結合效率,OPA具體配制方法如下:稱取40 mg OPA溶于1.0 mL體積分數(shù)95%的乙醇中,依次加入25 mL四硼酸鈉緩沖溶液(0.1 mol/L)、2.5 mL SDS溶液(20%,體積分數(shù))、0.1 mL β-巰基乙醇后混合均勻,最后加水至總體積為50 mL。

用OPA法定量游離氨基,0.05 mL的5 mg/mL樣品與1.35 mL的OPA試劑混合,室溫下水浴1 min,立即用紫外-分光光度計在340 nm處測定吸光度。以L-亮氨酸(1～5 mmol/L)作為含氨基的標準化合物繪制標準曲線。接枝度的計算如公式(1)所示:

接枝度/%=(1-結合后的氨基含量/結合前的氨基含量)×100

(1)

1.3.4 褐變顏色測定

采用紫外-分光光度計在420 nm處測定3種不同種類鱈魚魚皮膠原蛋白肽-卡拉膠美拉德產(chǎn)物棕色溶液(10 mg/mL)的吸光度。

1.3.5 表面疏水性測定

根據(jù)LUO等[11]的方法稍作修改。將蛋白質(zhì)量濃度稀釋至0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2 mg/mL(0.02 mol/L、pH 7磷酸緩沖液),分別向4 mL樣品溶液中加入20 μL 8 mmol/L的ANS溶液,立即混勻,在390/470 nm(激發(fā)/發(fā)射)下檢測熒光強度。用熒光強度對蛋白質(zhì)量濃度作圖并進行線性回歸,表面疏水性的值即為線性回歸斜率。

1.3.6 熒光光譜測定

根據(jù)CAO等[12]的方法做簡要修改,配制基于不同類型卡拉膠糖的糖肽樣品,質(zhì)量濃度為2 mg/mL,熒光光譜儀設置參數(shù):激發(fā)波長為347 nm,掃描范圍為360～600 nm。

1.3.7 鲅魚魚糜凝膠的制備

取魚肉,用5倍體積浸泡20 min,漂洗2次。再用體積分數(shù)0.3%的NaCl溶液浸泡20 min后過濾。將魚肉、魚肉質(zhì)量3%的食鹽和魚肉質(zhì)量5%的8 g/L卡拉膠糖基化產(chǎn)物溶液分別放入攪拌機內(nèi),混合攪拌2 min,之后把制備好的魚糜二段式加熱獲得魚糜凝膠,40 ℃加熱35 min后90 ℃加熱20 min。然后冷卻至室溫,放入4 ℃冰箱保存。

1.3.8 鲅魚魚糜凝膠質(zhì)構特性分析

利用質(zhì)構儀測定魚糜凝膠強度和全質(zhì)構分析(texture profile analysis,TPA),魚糜凝膠強度的測定如公式(2)所示[13]:將魚糜樣品制成各邊長度為20 mm的立方體,測試條件:探頭型號P/5S;測前測后速度均為1 mm/s;觸發(fā)力15 g。

凝膠強度/(g·mm)=破斷力(g)×破斷距離(mm)

(2)

魚糜凝膠TPA參數(shù)的測定:將魚糜樣品制成各邊長度為20 mm的立方體,測試條件:探頭型號P/50;測前,測中,測后速度均為1 mm/s;觸發(fā)力5 g。

2 結果與分析

2.1 傅里葉紅外光譜分析

傅里葉紅外光譜常用于分析蛋白質(zhì)或多肽的二級結構,主要通過蛋白在中紅外區(qū)的典型的特征峰而分析肽鏈的結構變化。圖1為3種美拉德產(chǎn)物FTIR譜圖,在3 500～3 000 cm-1內(nèi)出現(xiàn)一個寬峰,這可能是游離羥基伸縮振動產(chǎn)生的,或是N—H鍵變形振動造成的;其次均在1 260～1 000 cm-1內(nèi)出現(xiàn)吸收峰,此范圍下的特征峰為碳氧鍵的伸縮振動造成的。這是由于美拉德反應后,糖鏈上的羥基引入到肽鏈上,使得肽鏈中羥基和碳氧鍵數(shù)量增加,使得對應的吸收增強[14]。GENG等[15]制備了卵清蛋白和羧甲基纖維素糖基化產(chǎn)物,同樣通過紅外光譜分析得到羥基的特征吸收峰增強。因此上述現(xiàn)象表明糖分子以共價鍵形式接入到了鱈魚魚皮肽中,形成了美拉德產(chǎn)物。另外,隨著反應時間的延長,鱈魚魚皮肽糖基化產(chǎn)物3 500～3 000 cm-1和1 260～1 000 cm-1光譜強度逐漸增強,主要是由于糖分子以共價鍵形式接入肽中,使游離羥基數(shù)量增多,而美拉德反應時間越長,反應越徹底,羥基數(shù)量越多,從而導致峰的強度越大。

a-ι-car-CSCP MRPs;b-κ-car-CSCP MRPs;c-λ-car-CSCP MRPs圖1 不同孵育時間糖基化產(chǎn)物的傅里葉紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of the glycosylated products at different reaction times

2.2 接枝度及褐變顏色分析

評價美拉德反應程度的重要指標是游離氨基酸的含量,隨著游離氨基酸消耗量的增多,反應越完全,隨之接枝度越高。利用OPA法測定了美拉德反應產(chǎn)物的結合效率,如圖2所示,隨著反應時間延長,3種不同美拉德產(chǎn)物的接枝度呈增長趨勢,且ι-car-CSCP MRPs、κ-car-CSCP MRPs、λ-car-CSCP MRPs在孵育14 d后,接枝度最高,最高接枝度分別為35.64%、32.25%、45.54%。美拉德反應伴隨著褐變,據(jù)目前研究表明棕色物質(zhì)來源于二次美拉德反應的產(chǎn)物。圖2同時顯示在不同孵育時間下,3種美拉德產(chǎn)物在420 nm處的吸光值,結果表明吸光值與孵育時間成正相關,即溶液褐變程度隨著孵育時間越來越深,此現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于美拉德反應后期形成大量的褐色聚合體類黑精,隨著反應時間的延長,產(chǎn)生的色素物質(zhì)增加,導致褐變程度加深[16]。其次,在美拉德反應中,鱈魚魚皮膠原蛋白肽-卡拉膠美拉德反應速率與接枝度成正比。

2.3 熒光強度分析

熒光物質(zhì)是褐變產(chǎn)物形成之前產(chǎn)生的,是美拉德反應的早期指標。美拉德反應過程中,初始中間體通過Strecker降解轉化為一種熒光物質(zhì),然后進一步反應,發(fā)生褐變[17]。如圖3所示,3種不同卡拉膠美拉德產(chǎn)物均在孵育4 d后,熒光強度達到最大,隨后隨著時間的延長熒光強度逐漸減少,LIU等[18]在乳清分離蛋白和葡萄糖美拉德產(chǎn)物中也得到類似的結論,研究表明,乳清蛋白葡萄糖美拉德產(chǎn)物的熒光強度在第4天達到最大,然后下降。JING等[19]制備了核糖與酪蛋白美拉德產(chǎn)物,研究發(fā)現(xiàn)美拉德產(chǎn)物的熒光強度同樣在第4天達到最大,然后下降。產(chǎn)生此現(xiàn)象可能是因為肽鏈在加熱過程中結構被破壞,暴露出更多具有熒光吸收能力的苯環(huán)基團,使熒光強度增加。而在熒光強度達到峰值后隨反應時間的增加而降低,可能是由于肽與卡拉膠發(fā)生共價反應,反應產(chǎn)物的空間位阻增加,減弱了氨基酸吸收熒光的信號,導致熒光強度降低[20]。因此熒光物質(zhì)在前4天不斷生成,4 d后熒光物質(zhì)轉化為褐色化合物,導致熒光物質(zhì)減少,熒光強度降低。

a-ι-car-CSCP MRPs;b-κ-car-CSCP MRPs;c-λ-car-CSCP MRPs圖3 不同孵育糖基化時間產(chǎn)物的熒光光譜圖Fig.3 Intrinsic fluorescence spectra of glycosylated products with different reaction time

2.4 表面疏水性分析

圖4為3種不同美拉德產(chǎn)物的表面疏水性分析,分析可知,當具有多羥基的卡拉膠與鱈魚魚皮膠原蛋白肽發(fā)生共價交聯(lián),且隨著反應時間加長,表面疏水性明顯降低。說明糖基化后肽表面親水簇分子減少,有研究表明,當在肽上接入卡拉膠分子時,打破了肽自身的親水和疏水平衡,肽鏈中親水基團數(shù)量增加,分子表面的親水性增強;其次,引入卡拉膠后,肽鏈分子內(nèi)部的極性基團暴露出來,疏水性降低[21]。3種美拉德產(chǎn)物表面疏水性隨著孵育時間增長而降低,當孵育14 d時,ι-car-CSCP MRPs與第0天相比降低了40.78%;κ-car-CSCP MRPs與第0天相比降低了33.95%;λ-car-CSCP MRPs與第0天相比降低了30.73%。三者對比,ι-car-CSCP MRPs對表面疏水性改變最大。由此可知,隨著卡拉膠接枝到鱈魚魚皮膠原蛋白肽上,膠原蛋白肽的表面疏水性降低,整個體系的親水性增強,使膠原蛋白肽更易于在體系中分散,故通過美拉德反應,鱈魚魚皮膠原蛋白肽的溶解性得到改善,其次較大的溶解有利于鱈魚魚皮膠原蛋白肽向氣-水或油-水界面的擴散,極大地改善了肽的乳化性、起泡性等功能性質(zhì)[22]。

a-ι-car-CSCP MRP;b-κ-car-CSCP MRPs;c-λ-car-CSCP MRPs圖4 不同孵育時間糖基化產(chǎn)物的表面疏水性Fig.4 Surface hydrophobicity of glycosylated products at different reaction times注:不同小寫字母表示差異顯著,P<0.05。

2.5 三種不同卡拉膠美拉德產(chǎn)物對魚糜凝膠TPA性能的影響

表1、表2和表3為3種不同卡拉膠糖基化產(chǎn)物在不同孵育時間下對魚糜凝膠TPA性能的影響。分析可得,添加糖基化產(chǎn)物后的魚糜凝膠相比于未添加的空白組來說,硬度都有顯著的提升,而彈性、黏聚性和回復性無太大差別。對于κ-car-CSCP MRPs,當樣品孵育時間為6 d時,硬度達到最大,相較于空白組提高了36.63%;對于ι-car-CSCP MRPs,當樣品孵育時間為4 d時,硬度達到最大,相較于空白組提高了40.91%;對于λ-car-CSCP MRPs,當樣品孵育時間為2 d時,硬度達到最大,相較于空白組提高了7.65%。在此基礎上,分析可得當κ-car-CSCP MRPs在孵育6 d時,魚糜凝膠的硬度達到最大。因此,添加糖基化產(chǎn)物能增加魚糜硬度,且當κ-car-CSCP MRPs孵育6 d時,硬度達到最大,為31.31 N。產(chǎn)生此差異的原因是由于卡拉膠自身的凝膠性質(zhì)決定,不同類型卡拉膠的增稠和膠凝性質(zhì)有很大的不同,κ-型卡拉膠與K+形成硬且脆的凝膠,而ι-型和λ-型卡拉膠形成的凝膠較為柔軟。因此糖基化反應后,添加κ-car-CSCP MRPs的魚糜硬度也相應較大。

表1 添加不同孵育時間ι-卡拉膠糖基化產(chǎn)物對魚糜凝膠質(zhì)構的影響Table 1 Effects of adding ι-car-CSCP MRPs at different reaction times on the texture properties of surimi gel

表2 添加不同孵育時間κ-卡拉膠糖基化產(chǎn)物對魚糜凝膠質(zhì)構的影響Table 2 Effects of adding κ-car-CSCP MRPs at different reaction times on the texture properties of surimi gel

表3 添加不同孵育時間λ-卡拉膠糖基化產(chǎn)物對魚糜凝膠質(zhì)構的影響Table 3 Effects of adding λ-car-CSCP MRPs at different reaction times on the texture properties of surimi gel

2.6 三種不同卡拉膠美拉德產(chǎn)物對魚糜凝膠強度的影響

凝膠強度是評價魚糜品質(zhì)的重要指標。圖5顯示了3種美拉德產(chǎn)物對魚糜凝膠強度的影響。不同反應時間下,3種美拉德產(chǎn)物的添加對魚糜凝膠強度的影響類似。隨著孵育時間的的延長都呈先上升后下降的趨勢。對于κ-卡拉膠,孵育時間為6 d時凝膠強度最大,為1 825.48 g·mm;對于ι-卡拉膠,孵育時間為4 d時凝膠強度最大,為1 700.10 g·mm;對于λ-卡拉膠,孵育時間為2 d時凝膠強度最大,為1 408.03 g·mm。且添加卡拉膠美拉德產(chǎn)物的魚糜其凝膠強度均高于未添加卡拉膠美拉德產(chǎn)物的魚糜凝膠強度,說明3種卡拉膠美拉德產(chǎn)物的添加對于魚糜凝膠強度的提升有一定作用?？赡苁怯捎谠谥谱黥~糜的過程中,卡拉膠能與肌肉中蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用,強化了由于肌球蛋白受熱變性伸展交聯(lián)形成的凝膠網(wǎng)狀結構,從而增強凝膠網(wǎng)絡并減少水分損失[23]。其中,κ-car-CSCP MRPs孵育6 d時的凝膠強度最好,研究表明肌原纖維蛋白交聯(lián)是魚糜凝膠的骨架,而κ-卡拉膠可以作為黏合劑來加強這種基質(zhì),使其更緊湊和更堅固,從而增強凝膠強度[24]。其次,鱈魚魚皮肽在美拉德反應前期,由于肽的結構部分展開,可以提高肽的凝膠性,但過度結合亦使糖基化產(chǎn)物溶解度降低,導致凝膠網(wǎng)絡的弱化[25],因此,當添加孵育6 d的κ-卡拉膠糖肽物時,魚糜的凝膠強度達到最大。

圖5 添加不同孵育時間糖基化產(chǎn)物的魚糜凝膠強度Fig.5 Gel strength of surimi with glycosylated products at different reaction times

3 結論與討論

綜上所述,3種不同構型卡拉膠與鱈魚魚皮肽經(jīng)由糖基化反應制備肽糖基化產(chǎn)物,紅外光譜圖表明糖分子以共價鍵形式接入到了鱈魚魚皮肽中,形成了美拉德產(chǎn)物。其次隨著孵育時間的增加,反應物形成大量的褐色聚合體類黑精,使糖基化產(chǎn)物的接枝度、褐變程度逐漸提高;熒光強度是美拉德反應早期產(chǎn)物,在4 d達到最大值,隨后下降;而引入卡拉膠后,肽鏈分子內(nèi)部的極性基團暴露出來,表面疏水性隨時間的延長而降低。3種構型的卡拉膠糖基化產(chǎn)物的結構特性有所差異,但產(chǎn)生差異的機理還需進一步探究。將3種不同糖基化產(chǎn)物添加入鲅魚魚糜中,制得魚糜凝膠,相較于空白組,魚糜凝膠的凝膠強度和硬度都有顯著提升,其中孵育6 d的κ-car-CSCP MRPs加入到魚糜凝膠中后,使其凝膠強度和硬度達到最大,分別為1 825.48 g·mm和31.31 N,主要是由于κ-型卡拉膠形成的凝膠硬且脆,而ι-型和λ-型卡拉膠形成的凝膠較為柔軟。綜合考慮凝膠強度和質(zhì)構的測定結果,向魚糜凝膠中添加孵育6 d的κ-car-CSCP MRPs,魚糜凝膠的品質(zhì)最優(yōu)質(zhì)。本研究探討了不同構型卡拉膠與鱈魚魚皮肽制備肽糖基化產(chǎn)物,3種產(chǎn)物的結構性質(zhì)都存在差異,其次將3種糖基化產(chǎn)物添加至魚糜凝膠中,為改善鲅魚魚糜品質(zhì)提供了理論基礎,同時實現(xiàn)了鱈魚魚皮肽的廢物利用,提高了鱈魚魚皮肽的經(jīng)濟價值,拓寬了鱈魚魚皮肽的應用范圍。