吳宇,曹佳媛,劉伊索,劉銀雪,易華西*

1(中國海洋大學 海德學院,山東 青島,266100)2(中國海洋大學 食品科學與工程學院,山東 青島,266500)

高尿酸血癥(hyperuricemia, HUA)是嘌呤代謝異常所致的慢性代謝疾病,常伴有痛風、肥胖、糖尿病、高血壓等并發(fā)癥。研究表明,我國已經(jīng)成為HUA的多發(fā)地[1]。調(diào)查顯示,目前我國HUA患者集中于中老年男性和絕經(jīng)女性,呈現(xiàn)男性多于女性,沿海高于內(nèi)陸的分布,并具有年輕化的趨勢[2]。2000—2014年我國HUA患病率達13.3%[3]。2019—2020年廣州8 832名調(diào)查對象中患HUA比例達39.1%,其中男性患病率為53.6%,女性患病率為20.9%[4]。HUA已經(jīng)成為我國僅次于糖尿病的第二大代謝疾病。

目前治療HUA的藥物分為以下幾類:抑制嘌呤代謝相關(guān)酶的降尿酸藥物(別嘌呤醇、非布司他、托匹司他)[5],促進尿酸排泄藥物(苯溴馬隆、丙磺舒)[6],雙重抑制降尿酸藥物,尿酸酶類藥物[7]。然而這些藥物可能引發(fā)肝功能受損、胃腸道不良反應和腸道菌群失調(diào)等副作用[8]。研究發(fā)現(xiàn),益生菌可能對尿酸異常具有一定的調(diào)節(jié)作用[9]。益生菌可以影響尿酸合成關(guān)鍵酶活性從而抑制尿酸的合成,也可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群等方式促進尿酸的排泄,從抑制尿酸合成和加速尿酸排泄2個層面發(fā)揮降尿酸作用[[10]。據(jù)此,益生菌通過調(diào)節(jié)腸道菌群或者促進嘌呤和尿酸代謝可能是緩解或治療HUA的重要途徑之一。WANG等[11]認為,腸道菌群對尿酸的生出、代謝、排泄有重要的影響。XIAO等[12]從傳統(tǒng)泡菜中篩選出14株乳酸菌,發(fā)現(xiàn)其對高尿酸血癥腎功能損傷具有一定的保護治療作用。酸乳是一種深受消費者青睞的酸乳制品,也是益生菌發(fā)揮益生功能的重要載體。2015年,日本發(fā)現(xiàn)格氏乳桿菌PA-3通過降解嘌呤達到降低尿酸的效果,并據(jù)此研究開發(fā)了具有降尿酸功效的明治PA-3益生菌酸乳。YAMANA等[13]也成功篩選了具有降尿酸活性的格氏乳桿菌LG08。目前國內(nèi)外關(guān)于降尿酸益生菌及其產(chǎn)品的研究不多,主要原因是缺乏降尿酸活性穩(wěn)定和發(fā)酵特性優(yōu)良的益生菌菌株。實驗室前期從健康嬰兒糞便中篩選得到了1株發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)F40-4,體外研究和體內(nèi)動物實驗驗證均具有明顯的降尿酸效果。本研究旨在探究這株發(fā)酵乳桿菌F40-4在酸乳發(fā)酵中的應用潛力,為進一步研究與開發(fā)具有降尿酸功效的益生菌酸乳提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

全脂乳粉、白砂糖、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、發(fā)酵乳桿菌F40-4,中國海洋大學功能性乳品與益生菌工程實驗室;MRS肉湯培養(yǎng)基、脫脂乳培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司;PBS緩沖液,北京索萊寶生物科技有限公司;NaOH、酚酞,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-75KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-1D超凈工作臺,蘇州市凈化設(shè)備有限公司;202-3AB電熱恒溫干燥箱、LRH-250生化培養(yǎng)箱、DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋,天津市泰斯特儀器有限公司;PB-10酸度計,德國賽多利斯集團;TG20KR-D高速冷凍離心機,長沙東旺實驗儀器有限公司;iCinac型酸化監(jiān)控儀,法國AMS公司;YP202 N電子天平,上海精科儀器有限公司;TA.XT PLUS質(zhì)構(gòu)儀,英國SMS公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化

將冷凍保存L.fermentumF40-4菌株的甘油菌液以2%的接菌量接入10 mL滅菌MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h進行活化,按此方法繼續(xù)活化3代,取活化第3代的菌株進行實驗。

1.3.2 抑菌實驗

參考楊慧等[14]的方法。分別取10 μL活化的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌菌液分別接種于0.6% MRS肉湯半固體培養(yǎng)基中,然后倒入提前放置牛津杯的平皿中,待培養(yǎng)基凝固后,取出牛津杯,向孔洞中加入150 μLL.fermentumF40-4菌液,以150 μL MRS肉湯為空白對照,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。觀察抑菌圈大小,用游標卡尺測量抑菌圈的直徑。

1.3.3 酸乳制備

參考張穎等[15]的方法。將蒸餾水加熱至55 ℃后,加入12%脫脂奶粉和6%白糖,攪拌均勻后使溶液保持在65 ℃,水合30 min進行分裝。用溫控水浴鍋加熱,使體系保持在95 ℃,高溫滅菌5 min后迅速冷卻至42 ℃。實驗設(shè)置3組酸乳,按接種比例分為0∶1組(L.fermentumF40-4和發(fā)酵劑接種比例0∶1)、1∶1組(L.fermentumF40-4和發(fā)酵劑接種比例1∶1)、1∶2組(L.fermentumF40-4和發(fā)酵劑接種比例0.5∶1)。42 ℃恒溫發(fā)酵,利用酸化監(jiān)控儀每10 min測一次pH,每30 min測定一次可滴定酸度,待pH接近4.5時,達到發(fā)酵終點,4 ℃冷卻后熟24 h,進行酸乳理化性質(zhì)測定。

1.3.4 析水率測定

稱取10 g酸乳樣品,4 ℃,1 000 r/min離心10 min,稱取沉淀質(zhì)量,析水率按公式(1)計算:

(1)

1.3.5 可滴定酸度測定

參照GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》。利用酸堿滴定法,以酚酞為指示劑,0.1 mol/L NaOH測定酸乳中可滴定酸的含量。

1.3.6 微生物指標測定

總活菌數(shù)測定參照GB 4789.2—2022《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》,利用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。

1.3.7 質(zhì)構(gòu)測定

使用質(zhì)構(gòu)儀采用2次咀嚼測試程序?qū)λ崛檫M行質(zhì)構(gòu)分析[16-17]。參數(shù)設(shè)置如下:底部類型為直徑50 mm圓柱形探頭,力量感應源ILC/500 N,底部類型為直徑50 mm圓柱形探頭,形變百分量35%,檢測速度60.0 mm/min,觸發(fā)力0.75 N。

1.3.8 感官評價

挑選10名接受過專業(yè)感官分析培訓的學生組成評價組(男女比例為1∶1),分別對發(fā)酵酸乳進行感官評價。

1.3.9 風味化合物測定

樣品準備:準確稱取2.0 g酸乳樣品于頂空瓶中,3組樣品每個樣品設(shè)置3個平行。

頂空條件:孵育溫度60 ℃,時間10 min,孵育速度250 r/min,進樣速率51 mL/min,進樣針溫度T3為65 ℃,進樣體積為500 μL。

GC-IMS條件:FS-SE-54-CB-1色譜柱(15 m×0.53 mm,1 μm);IMS溫度T145 ℃;柱溫T240 ℃;漂移氣(E1)和載氣(E2)均為氮氣,純度99.999%。色譜洗脫程序為程序升壓,E1和E2流量隨時間變化情況如表1所示。

表1 色譜柱洗脫參數(shù)Table 1 Elution parameters of column

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 7.0進行統(tǒng)計分析,以星號表示顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 L.fermentum F40-4對酸乳發(fā)酵劑菌株生長的影響

保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌是酸乳發(fā)酵劑的主體菌株。開發(fā)復合發(fā)酵劑的前提是輔助發(fā)酵菌株與保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌之間不能有明顯的生長拮抗作用。據(jù)此,研究了L.fermentumF40-4對酸乳發(fā)酵劑主體菌株保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長的影響,結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明,L.fermentumF40-4對嗜熱鏈球菌的生長沒有抑制作用,對保加利亞乳桿菌的生長有輕微抑制作用,但其程度不影響菌株的生長發(fā)酵。保加利亞乳桿菌是酸乳發(fā)酵劑中的主要產(chǎn)酸菌株,若能在酸乳后熟期一定程度地抑制保加利亞乳桿菌的生長,則可以有效減輕后酸化[18],改善酸乳的風味和口感。L.fermentumF40-4對保加利亞乳桿菌生長的輕度抑制特性有可能在酸乳后熟和貯藏期間起到延緩后酸化的作用。另外,L.fermentumF40-4對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長的影響研究是在MRS培養(yǎng)基中進行,L.fermentumF40-4在牛乳基質(zhì)中對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長的影響還待進一步研究。

a-保加利亞乳桿菌;b-嗜熱鏈球菌圖1 L.fermentum F40-4對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長的影響Fig.1 Effect of L.fermentum F40-4 on the growth of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus

2.2 L.fermentum F40-4對酸乳發(fā)酵過程中pH和酸度的影響

將L.fermentumF40-4與酸乳發(fā)酵劑配比分別調(diào)配為0∶1、1∶1和1∶2,于42 ℃發(fā)酵,每隔10 min測定pH和可滴定酸度,結(jié)果如圖2所示。3組酸乳的pH在發(fā)酵過程中均呈現(xiàn)降低的趨勢,在3 h后3組發(fā)酵樣品中的pH均為4.5左右,達到發(fā)酵終點。1∶1和1∶2組發(fā)酵酸乳樣品的pH在前90 min一直高于0∶1組。在90 min后,3組樣品pH的下降速率均有所減緩;相對1∶1組和0∶1組而言,1∶2組發(fā)酵酸乳pH下降速率最快,且發(fā)酵終點pH最低。上述結(jié)果表明L.fermentumF40-4在前90 min發(fā)酵過程中對發(fā)酵劑菌株具有輕微的抑制作用,這與前面L.fermentumF40-4對保加利亞乳桿菌生長的影響結(jié)果一致,但在發(fā)酵后期這種抑制作用基本消失。酸乳發(fā)酵過程中的酸度變化趨勢與pH變化基本一致。結(jié)合3組樣品發(fā)酵過程中pH和酸度的整體變化情況,L.fermentumF40-4的添加不會影響酸乳的正常發(fā)酵進程。

圖2 發(fā)酵過程中酸乳的pH變化Fig.2 Change of pH value of yogurt during fermentation

2.3 L.fermentum F40-4對酸乳冷藏過程中pH的影響

酸乳發(fā)酵結(jié)束后,冷藏后熟是賦予酸乳更佳風味和口感的重要步驟。在本研究中,酸乳發(fā)酵停止后,將酸乳置于4 ℃冷藏24 h,3組酸乳樣品的pH如圖3所示。

圖3 L.fermentum F40-4對酸乳樣品冷藏pH的影響Fig.3 Effect of L.fermentum F40-4 on pH of refrigerated yogurt samples

3組樣品在貯藏過程中pH都降低了,其中1∶1樣品組酸乳下降最少,0∶1組下降最多,說明L.fermentumF40-4的添加對主要產(chǎn)酸菌保加利亞乳桿菌具有一定的抑制作用。市售酸乳的pH一般在4～4.5[21-22],3組酸乳樣品的pH均在此范圍。后酸化是目前酸乳冷藏和貯藏過程中的一種負面現(xiàn)象,主要是由于保加利亞乳桿菌持續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酸導致,影響了酸乳的口感和風味。上述研究結(jié)果表明,L.fermentumF40-4可以延緩酸乳在冷藏過程中的pH下降進程,具有改善酸乳后酸化的效果。這可能是由于L.fermentumF40-4對保加利亞乳桿菌生長具有一定程度的抑制作用,從而延緩了后酸化。

2.4 L.fermentum F40-4對酸乳貯藏過程中活菌數(shù)的影響

活菌數(shù)是評判酸乳品質(zhì)的重要指標之一。3組酸乳樣品在貯藏過程中的最終活菌數(shù)如圖4所示。1∶1組的總活菌數(shù)最高,1∶2組樣品活菌數(shù)次之,0∶1組樣品的總活菌數(shù)最低,原因可能是1∶1組樣品中L.fermentumF40-4的接種量比0∶1組和1∶2組樣品多,所以該組酸乳樣品的總活菌數(shù)最高。3組樣品的活菌數(shù)都在109以上,符合酸乳品質(zhì)要求。

圖4 L.fermentum F40-4對酸乳貯藏活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of L.fermentum F40-4 on the number of bacteria in yogurt samples during storage

2.5 L.fermentum F40-4對酸乳析水率的影響

析水率是表征酸乳凝固特性的重要指標。添加不同比例的L.fermentumF40-4對酸乳冷藏過程中析水率的影響結(jié)果如圖5所示。

圖5 L.fermentum F40-4對酸乳貯藏析水率的影響Fig.5 Effect of L.fermentum F40-4 on water-discharging rate of yogurt during storage

結(jié)果表明,1∶1組樣品的析水率最低,0∶1組樣品的析水率最高。酸乳的析水率與酸度、菌粉添加量等因素有關(guān),若酸度較低或菌粉添加較多且有震動收縮過程均會導致析水率上升[21]。酸度過高,超過了酪蛋白的等電點,酪蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)會出現(xiàn)脫水現(xiàn)象,導致乳清析出較多;菌粉添加量較多,則凝乳微粒數(shù)量較多,一旦受到震動,水從酪蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中流出。根據(jù)結(jié)果可知,添加L.fermentumF40-4能夠降低酸乳析水率,減少了乳清析出,且最佳添加比例為1∶1。

2.6 L.fermentum F40-4對酸乳質(zhì)構(gòu)的影響

質(zhì)構(gòu)是評價酸乳品質(zhì)的另外一個重要指標,與酸乳的口感和風味密切相關(guān)。對L.fermentumF40-4不同添加量的3組酸乳樣品進行了質(zhì)構(gòu)檢測分析,結(jié)果如表2所示。3組樣品的內(nèi)聚性、硬度、咀嚼性、彈性、黏附性、膠黏性均無顯著差異。酸乳硬度是指質(zhì)構(gòu)探頭穿過酸乳過程中受到的壓力最大值,與原料乳、加熱強度、均質(zhì)參數(shù)、酸乳酸度等因素有關(guān)[14-15]。該3組樣品在原料乳、加熱處理、均質(zhì)強度等方面均保持一致,因此影響酸乳樣品硬度的因素可能與酸乳酸度有關(guān)。雖然L.fermentumF40-4的添加對酸乳的pH有一定的影響,但不會影響酸乳的質(zhì)構(gòu)指標,對酸乳口感不會帶來負面影響。

表2 不同酸乳樣品的質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果Table 2 Results of texture analysis of yogurt samples

2.7 L.fermentum F40-4對酸乳感官評價的影響

感官評價是評判酸乳品質(zhì)的最直觀指標。為研究添加L.fermentumF40-4對酸乳感官特性的影響,對3組酸乳樣品進行了感官評價,結(jié)果如圖6所示。

圖6 L.fermentum F40-4對對酸乳感官評價結(jié)果的影響Fig.6 Effect of L.fermentum F40-4 on the sensory evaluation of yogurt samples

結(jié)果表明,未添加L.fermentumF40-4的0∶1組酸乳樣品感官評價顯著低于其他2組酸乳樣品。1∶2組樣品的色澤、質(zhì)地、氣味較佳,但口感上略有顆粒感,口味偏酸。1∶1組樣品的色澤乳白,氣味香甜且富有乳香風味,質(zhì)地細膩無顆粒和裂紋,滋味酸甜適中,口感細膩綿密,無乳清析出,其在氣味、質(zhì)地、口感、滋味和色澤方面都高于0∶1組樣品,評分最高。上說結(jié)果說明接種L.fermentumF40-4可以提升酸乳的感官特性。

2.8 L.fermentum F40-4對酸乳揮發(fā)性風味化合物影響

測定了1∶1組樣品和0∶1組樣品的揮發(fā)性風味物質(zhì),對差異風味化合物進行比較分析研究,結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明,酸乳風味中化合物主要為烴類、酯類、醇類、醛類、酮類、酸類、芳香族。添加L.fermentumF40-4后,酸乳樣品中的酯類含量顯著提高,包括肉桂酸甲酯、乙酸異丙酯、乙酸龍腦酯等,提升了酸乳的香味。在2組酸乳樣品的差異風味組分中檢測出了乙酸辛酯、水楊酸甲酯、乙酸異丙酯、2-苯乙醇乙酸酯等酯類物質(zhì),其中肉桂酸甲酯、乙酸異丙酯、乙酸龍腦酯含量較高。在2組酸乳樣品中檢測出的差異酸類風味物質(zhì)為辛酸、壬酸、乙酸,其中辛酸含量最高,賦予酸乳清香風味。醛類化合物屬于微量香氣成分,對酸乳風味構(gòu)成有重要影響[22]。在2組樣品的差異風味組分中檢測出了正庚醛、壬醛等醛類物質(zhì)。酮類和醛類化合物由多不飽和脂肪酸氧化、熱降解、氨基酸或微生物代謝產(chǎn)生,可賦予酸乳特有的風味。在2組樣品的差異風味化合物中檢測到了酮類和醛類化合物有2-丁酮。正庚醛、反式-2-己烯醛、戊烯醛。L.fermentumF40-4是專性發(fā)酵乳桿菌,除了上述風味化合物之外,其發(fā)酵代謝產(chǎn)物還可能有乳酸、CO2和乙醇等物質(zhì)。綜上研究結(jié)果表明,添加L.fermentumF40-4賦予了酸乳更多的風味物質(zhì)。

3 結(jié)論

將具有降尿酸活性的L.fermentumF40-4和酸乳發(fā)酵劑以不同比例組成復合發(fā)酵劑,探究L.fermentumF40-4對發(fā)酵酸乳品質(zhì)的影響。與不添加L.fermentumF40-4的酸乳相比,添加L.fermentumF40-4的酸乳樣品活菌數(shù)更高,析水率更低,提高了酸乳的質(zhì)構(gòu)和感官特性,產(chǎn)生了更豐富的風味物質(zhì)。該研究結(jié)果表明添加L.fermentumF40-4有助于提高酸乳的品質(zhì),可作為輔助發(fā)酵劑用于降尿酸益生酸乳的發(fā)酵生產(chǎn)。