鄧廣輝，賈慧，李允家，李俊杰，吳潮鋒，石皓，秦夢晨，趙嘉敏，劉暢，廖雨欣，高磊

1南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515；2南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州510315

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是以脂質(zhì)代謝紊亂為主要特征的一種代謝性疾病。在NAFLD的進(jìn)展中，肝臟會發(fā)生一系列典型的組織病理學(xué)變化，從單純的脂肪性變到伴有或不伴有纖維化的脂肪性肝炎，并最終發(fā)展為肝硬化或肝癌［1,2］。近年來，其發(fā)病率逐年上升，成年人發(fā)病率達(dá)20%～33%，已成為我國第1大慢性肝?。?,4］。目前針對脂肪性肝病的治療藥物雖然有很多，但因其副作用多或療效有限，無法適用于所有人群，迄今為止還沒有藥物獲得美國食品及藥物管理局批準(zhǔn)用于NAFLD［5］。目前的研究表明，部分肥胖者機(jī)體內(nèi)不僅存在脂代謝紊亂的現(xiàn)象，還伴隨鐵離子異常累積的表現(xiàn)。這提示脂質(zhì)代謝紊亂與鐵代謝紊亂密切相關(guān)［6］。已有研究［7］證明鐵過載會加劇NAFLD中的肝損傷程度，而減少鐵的攝入量可以有效緩解脂肪性肝病的進(jìn)一步惡化。而過量的鐵離子通過芬頓反應(yīng)生成大量的活性氧自由基（ROS），后者直接導(dǎo)致細(xì)胞DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的損傷［8］。我們前期的研究也證實高脂飲食可誘導(dǎo)小鼠鐵離子代謝紊亂，加劇肝組織內(nèi)鐵離子累積，而抑制鐵離子累積可部分緩解NAFLD的進(jìn)展［9］。

二陳湯由半夏、陳皮、茯苓、甘草、烏梅、生姜組成，具有燥濕化痰、理氣和中功效?！豆沤衩t(yī)方論》：“二陳為治痰之妙劑，其于上下左右無所不宜”。臨床統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，二陳湯加減治療組總有效率為87%，高于對照組67%的有效率［10］?；A(chǔ)研究表明二陳湯通過抑制脂質(zhì)累積和炎癥反應(yīng)，可有效緩解大鼠NAFLD的進(jìn)展［11,12］。研究表明NAFLD 患者證型以肝郁脾虛證型最為普遍，占比32.3%，發(fā)病原因與主要癥狀均與脾臟密切相關(guān)［13］。然而，從鐵穩(wěn)態(tài)的角度探討二陳湯調(diào)控脾臟功能緩解NAFLD的研究仍舊缺乏。

綜上所述，結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于脾臟功能的理解和認(rèn)識［14,15］，我們試圖從脾臟調(diào)控鐵離子代謝的角度探討二陳湯防治NAFLD的作用機(jī)制。因此，本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)小鼠NAFLD模型，以多烯磷脂酰膽堿為陽性對照藥［16］，以不同劑量二陳湯為干預(yù)手段，深入探究二陳湯通過改善脾臟鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控NALFD進(jìn)展的作用機(jī)制，為中藥防治疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 野生型C57BL/6J 小鼠36只，6～8 周齡，SPF級，體質(zhì)量20±2 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。動物合格證號：44007200 065781；許可證號：SCXK（粵）2018-0002。飼養(yǎng)溫度23～25 ℃，相對濕度50%～65%；每天更換墊料，給予充足飼料。該動物實驗方案由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（倫理編號：L2020044）。

1.1.2 藥物及試劑 模型組飼料：高脂飼料，飼料代碼：TP 26305（熱量：4.5 kcal/g，熱量組成：脂肪42%，蛋白質(zhì)14%，碳水化合物44%。膽固醇含量0.2%）；對照組飼料：低脂低糖飼料，飼料代碼：TP26362。均購買于南通特洛菲飼料科技有限公司。二陳湯（半夏15 g、橘紅15 g、茯苓9 g、炙甘草4.5 g、烏梅3 g、生姜3.5 g）的藥材均購買于安徽同化堂中藥飲片科技有限公司，經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院邵萌副研究員鑒定，均符合2020年版《中國藥典》規(guī)定。多烯磷脂酰膽堿（PPC，易善復(fù)，賽諾菲北京制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20059010，9.12 mg/kg）作為陽性對照藥物，將其溶解于蒸餾水中備用。

抗體：鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Fpn1，NOVUS），前列腺六跨膜上皮抗原3（Steap3，Abcam），轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR，Abcam），血紅素加氧酶1（HO-1，Abcam），GAPDH（CST），CD68（Abcam），CD163（proteintech），Ter-119（ThermoFisher），鐵蛋白輕鏈（proteintech），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（CST），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（CST）。RIPA裂解緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），ECL 蛋白質(zhì)印跡檢測試劑（MA），尼羅紅粉末（Sigma），DAPI（索萊寶生物科技有限公司），免疫組化試劑盒（上?；蚩萍加邢薰荆F離子檢測試劑盒（Abcam），普魯士藍(lán)染色試劑盒（貝博）。單體：野漆樹苷（曼思特），柚皮素（曼思特），甘草酸（曼思特），甘草查爾酮A（曼思特）。

1.1.3 儀器與設(shè)備 全波長酶標(biāo)檢測儀（Thermo Fisher Scientific），低溫高速離心機(jī)（5427R，Eppendorf），臺式高速大容量離心機(jī)（5810R，Eppendorf），RM2245石蠟切片機(jī)、EG1160包埋機(jī)、CM-1850冰凍切片機(jī)（徠卡公司），病理顯微鏡Eclipse E100、激光共聚焦顯微鏡C2（尼康公司），正置激光共聚焦顯微鏡（LSM 880，蔡司），KZ-Ⅱ高速組織研磨儀（Servicebio），曝光儀（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司），Chemray 240和Chemray 800全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技），高效液相色譜儀（UltiMate3000，ThermoFisher賽默飛）。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 中藥煎煮方法參考《中藥藥理實驗方法學(xué)》（上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006 年版），將藥物按照比例混合放于陶制中藥鍋內(nèi)，加適量去離子水浸泡30 min，開始煎煮直至水沸騰，文火慢煮30～40 min。收集剩余藥液，倒入500 mL燒杯中。重新加水于鍋中進(jìn)行二次煎煮。將兩次煎出藥液混合后，置95～98 ℃水浴鍋中加熱濃縮，并制備成相應(yīng)濃度的水煎劑。

1.2.2 分組給藥和模型制備 參考本人既往發(fā)表文章采用的NAFLD 小鼠模型構(gòu)建方法［9］，36 只雄性野生型C57BL/6J 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為對照組（Control）、模型組（Model）、二陳湯低劑量組（ECDL）、二陳湯中劑量組（ECDM）、二陳湯高劑量組（ECDH），多烯磷脂酰膽堿組（PPC），6只/組。對照組喂養(yǎng)低脂飼料（飼料代碼：TP26362），其余組則喂養(yǎng)高脂飼料（飼料代碼：TP 26305），所有小鼠均采用自由飲食模式進(jìn)食。于第12周末結(jié)束造模。所有小鼠均自由飲水進(jìn)食。

藥物組小鼠在高脂飲食第7周開始灌胃給藥，二陳湯低劑量組、中劑量組和高劑量組生藥給藥量分別為7.5、15、30 g/kg，多烯磷脂酰膽堿組為9.12 mg/kg。其中低劑量組，由臨床常用劑量生藥質(zhì)量/體質(zhì)量，按照人鼠比例進(jìn)行換算；其余各組灌胃等量飲用水。各組均按1 mL/100 g小鼠體質(zhì)量進(jìn)行灌胃，3次/周，持續(xù)給藥6周，隔天觀察小鼠毛發(fā)、飲食、自主活動及精神狀態(tài)等情況，每周記錄小鼠體質(zhì)量1次。

1.2.3 標(biāo)本采集 用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，完成采血后使用灌注儀進(jìn)行心臟灌注，然后采集肝臟和脾臟，部分放置于4%多聚甲醛中浸泡，剩余部分的肝臟和脾臟組織分裝到1.5 mL EP管中，放置-80 ℃冰箱保存以備后用。小鼠全血在室溫靜置2～4 h后，放置常溫離心機(jī)離心（3000 r/min，離心15min），離心結(jié)束后分離上清，放置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.4 肝組織病理學(xué)檢測及分析 4%多聚甲醛溶液固定的肝組織和脾組織常規(guī)處理固定，脫水、石蠟包埋，切成4 μm厚切片，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行脫蠟和水化。此外部分固定的組織用OCT膠包埋，切成14 μm厚的切片。采用相應(yīng)的切片進(jìn)行HE和尼羅紅染色，光鏡下觀察肝臟脂肪變性情況。

1.2.5 HPLC-MS分析法 采用高效液相色譜法對二陳湯水煎劑的活性成分進(jìn)行鑒定分析。取500 μL藥液，加入500 μL乙醇，18 000×g離心5 min，離心后留取上清。另取500 μL藥液稱重，用500 μL超純水提取，再次18 000×g離心5 min，離心后留取上清。取500 μL兩上清混合液，用0.22 μm過濾器過濾混合液，制備原液，最后對樣品進(jìn)行分析?；贖PLC分析結(jié)果，從二陳湯樣品中鑒定出的4個單體組成分別與標(biāo)準(zhǔn)混合物中的相應(yīng)峰匹配。

1.2.6 普魯士藍(lán)染色法 切片脫蠟至水后，蒸餾水洗3遍，2 min/次。滴加適量的試劑A溶液，孵育15～30 min；孵育結(jié)束后蒸餾水洗3遍，3 min/次。然后往切片上滴加適量核固紅試劑B溶液染細(xì)胞核8 min。自來水流沖洗直至水變干凈。脫水封片，正置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7 免疫蛋白印跡法 將適量的肝、脾組織剪碎后加入組織裂解液（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液），勻漿機(jī)勻漿，4 ℃，12 000×g離心15 min，收集上清液。用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。制好蛋白樣后進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)膜。5%BSA封閉后，孵育一抗Fpn1（兔，1∶1000）、Steap3（兔，1∶1000）、HO-1（兔，1∶1000）、TfR（兔，1∶1000）、GAPDH（兔，1∶1000），4 ℃過夜。用TBST洗滌3次，10 min/次，二抗室溫孵育1 h。最后，多功能成像系統(tǒng)檢測。通過Image J進(jìn)行定量。

1.2.8 免疫組織化學(xué)法 切片脫蠟至水后，用枸櫞酸鈉溶液進(jìn)行組織抗原修復(fù)，PBS洗3遍，3 min/次。加入3%過氧化氫溶液清除組織的內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育10 min。PBS洗3遍，3 min/次。免疫組化封閉液室溫孵育1～2 h。加入一抗溶液，4 ℃孵育12～16 h。PBS洗3遍，5 min/次。二抗溶液室溫孵育1 h。PBS洗3遍，3 min/次。根據(jù)劑盒的說明書使用DAB溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)。滴加蘇木精染料染細(xì)胞核，3 min/張。脫水封片，放置通風(fēng)櫥中靜置晾干，正置顯微鏡中觀察拍照。

1.2.9 免疫熒光染色法 冰凍切片用PBS洗2次，10 min/次。通透液通透10 min后，PBS洗3 min；加適量封閉液，室溫封閉1 h。滴加適量一抗溶液，4 ℃孵育12 h。次日PBS洗3遍，10 min/次。室溫下孵育二抗溶液1 h。PBS 洗2遍，10 min/次。使用DAPI 溶液孵育5min，PBST洗2遍，5 min/次?？篃晒獯銣鐒┓馄?，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.10 鐵離子濃度檢測 采用全自動生化分析儀（深圳雷都生命科技：Chemray 240或Chemray 800）檢測血清鐵離子濃度。操作方法參既往發(fā)表的文章［9］。

1.2.11 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism8.0軟件作圖和SPSS22.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組樣本比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗；多組樣本間比較采用單因素方差分析，若方差齊性，采用Turkey檢驗方法進(jìn)行組間兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett's T3檢驗方法進(jìn)行組間比較。P＜0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二陳湯活性成分的鑒定

對比標(biāo)準(zhǔn)品混合物溶液圖譜（圖1A）與二陳湯樣品圖譜（圖1B），柚皮素的保留時間分別為10.08 s 和10.07 s，相應(yīng)保留時間處m/z 分別是271.06085、271.06088；甘草酸的保留時間分別為12.25 s和12.26 s，相應(yīng)保留時間處m/z分別是821.39484、821.39471；野漆樹苷的保留時間分別為7.60 s 和7.65 s，相應(yīng)保留時間處m/z 分別是577.15558、577.15662；甘草查爾酮A的保留時間分別為13.62 s 和13.63 s，相應(yīng)保留時間處m/z分別是337.14401、337.14374。

2.2 二陳湯有效改善NAFLD小鼠模型的脂代謝紊亂

圖2A顯示模型構(gòu)建和給藥處理的時間節(jié)點(diǎn)，從第7周開始灌胃給藥，在第12周末結(jié)束造模。首先觀察小鼠肝臟的整體形態(tài)變化，對照組肝臟形態(tài)正常，顏色呈紅褐色。模型組肝臟表面光滑有脂滴，顏色呈橘黃色。二陳湯中劑量組和高劑量組可明顯改善肝臟的病變，而多烯磷脂酰膽堿降脂效果比二陳湯的降脂效果差（圖2B）。HE染色和尼羅紅染色結(jié)果表明，與模型組相比，中劑量組和高劑量組二陳湯可有效緩解肝臟的脂質(zhì)累積，而低劑量二陳湯和多烯磷脂酰膽堿減輕肝臟脂質(zhì)累積的效果明顯較差（圖2C、D）。

圖2 二陳湯抑制高脂飲食誘導(dǎo)的脂代謝紊亂Fig. 2 Erchen Decoction inhibits lipid metabolism disorder induced by high-fat diet. A: Flow chart of NAFLD mouse model establishment and drug intervention.B:Overall lesion map of mouse liver.C:HE staining results of the liver tissue in each group.D:Nile Red staining of the liver tissue in each group.ECDL:Erchen Decoction low-dose group;ECDM:Erchen decoction mediumdose group;ECDH:Erchen decoction high-dose group;PPC:Polyene phosphatidyl choline group.

2.3 高脂飲食通過抑制TfR表達(dá)抑制脾臟細(xì)胞的鐵攝入能力

普魯士藍(lán)染色結(jié)果表明，高脂飲食引起脾臟紅髓的鐵含量顯著降低（圖3A）。免疫蛋白印跡方法發(fā)現(xiàn)與對照組比較，模型組小鼠脾臟組織的TfR蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01，圖3B），免疫組織化學(xué)染色方法結(jié)果也證實高脂飲食抑制脾臟TfR蛋白的表達(dá)（P＜0.05，圖3C）。

圖3 高脂飲食降低脾臟細(xì)胞的鐵離子攝入能力Fig. 3 High-fat diet reduces iron uptake capacity of the spleen cells.A:Prussian blue staining for observing iron content in the spleen.B:Expression of TfR protein in the spleen detected by Western blotting.C: Expression of TfR protein in the spleen detected by immunohistochemistry.*P＜0.05,**P＜0.01 vs Control group.

2.4 高脂飲食通過上調(diào)Fpn1表達(dá)促進(jìn)脾臟細(xì)胞的鐵排出能力

免疫蛋白印跡結(jié)果分析顯示，與對照組相比，模型組小鼠脾臟組織Fpn1和Steap3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05，圖4A）。免疫組織化學(xué)染色方法分析顯示，高脂飲食促進(jìn)脾臟Fpn1蛋白表達(dá)（P＜0.01，圖4B）。免疫熒光染色方法分析再次證實，與對照組相比，模型組脾臟Fpn1蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05，圖4C）。

2.5 二陳湯改善脾臟細(xì)胞的鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力

與對照組比較，模型組血清鐵含量顯著增多（P＜0.01），而二陳湯和多烯磷脂酰膽堿均可有效降低血清鐵離子濃度（P＜0.01，圖5A）。普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示，二陳湯和多烯磷脂酰膽堿可上調(diào)NAFLD模型中脾臟紅髓的鐵含量（圖5B）。免疫組織化學(xué)法檢測脾臟TfR、Fpn1和Steap3蛋白的表達(dá)水平。與對照組相比，模型組脾組織TfR蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.001）。與模型組相比，中劑量二陳湯、高劑量二陳湯以及多烯磷脂酰膽堿上調(diào)脾組織TfR蛋白的表達(dá)（P＜0.05，圖5C）。與對照組相比，模型組脾組織Fpn1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）。與模型組相比，中劑量和高劑量二陳湯均可下調(diào)脾組織Fpn1蛋白的表達(dá)（P＜0.01，圖5D）。與對照組相比，模型組脾組織的Steap3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）。與模型組相比，中劑量二陳湯組和多烯磷脂酰膽堿組Steap3蛋白的表達(dá)較模型組下調(diào)（P＜0.05，圖5E）。

圖5 二陳湯調(diào)控脾臟細(xì)胞的鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力Fig. 5 Erchen Decoction regulates iron transport in the spleen cells.A:Serum iron level in each group.B:Prussian blue staining of the spleen tissue in each group.C:Expression of TfR protein in the spleen detected by immunohistochemistry.D:Expression of Fnp1 protein in the spleen detected by immunohistochemistry. E: Expression of Steap3 protein in the spleen detected by immunohistochemistry.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs Control group.#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001 vs Model group.

2.6 二陳湯改善脾臟巨噬細(xì)胞降解紅細(xì)胞的能力

接著檢測脾臟中Ter-119蛋白表達(dá)的情況以及不同表型巨噬細(xì)胞的數(shù)量。模型組小鼠脾組織Ter-119蛋白表達(dá)水平與對照組無顯著性差異（圖6A）。與對照組相比，模型組脾組織CD68和CD163蛋白的表達(dá)顯著增多（P＜0.05，圖6B）。與模型組比較，中劑量二陳湯和多烯磷脂酰膽堿均未改變CD163 和CD68 蛋白的表達(dá)（圖6B）。有趣的是，與對照組比較，模型組小鼠HO-1蛋白表達(dá)降低（P＜0.01，圖6C），而二陳湯中劑量組和多烯磷脂酰膽堿組小鼠脾組織HO-1蛋白表達(dá)較模型組上調(diào)（P＜0.05，圖6C）。

圖6 二陳湯調(diào)控脾臟巨噬細(xì)胞降解紅細(xì)胞的能力Fig. 6 Erchen Decoction regulates the ability of splenic macrophages to degrade red blood cells.A:Expression of Ter-119 protein in the spleen detected by immunohistochemistry.B:Expressions of CD163 and CD68 proteins detected by immunofluorescence assay.C:Expression of HO-1 protein in the spleen detected by immunoblotting.*P＜0.05,**P＜0.01 vs Control group.#P＜0.05,##P＜0.01 vs Model group.

3 討論

目前的研究表明NAFLD是一種復(fù)雜的代謝性疾病，而脂質(zhì)代謝紊亂是引起NAFLD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)累積所誘發(fā)的其它變量可能是NAFLD進(jìn)展的關(guān)鍵，并且提出“多次打擊”的學(xué)說［17］：脂代謝紊亂引起的鐵過載［18］、炎癥細(xì)胞激活、氧化應(yīng)激、腸道菌群失調(diào)、脂肪組織功能障礙、線粒體功能障礙等引起的細(xì)胞損傷和死亡，是決定NAFLD進(jìn)展的關(guān)鍵。這表明NAFLD的發(fā)生發(fā)展存在多種潛在的干預(yù)因素，仍需進(jìn)一步探討。目前主流的治療方案主要是從維護(hù)體內(nèi)脂質(zhì)代謝和抗氧化平衡等角度出發(fā)，常選用辛伐他汀等降脂類藥物、吡格列酮等胰島素增敏劑、維生素E等抗氧化劑以及多烯磷脂酰膽堿［19-21］。雖然上述部分藥物已經(jīng)在臨床上被應(yīng)用，并在一定程度上緩解NAFLD患者的病情，但是這些藥物由于副作用多或療效有限，無法適用于所有人群［22］。而中醫(yī)藥具有改善胰島素抵抗，降低肝臟脂質(zhì)沉積和減輕肝臟炎癥的顯著作用，對本病的治療有其獨(dú)特優(yōu)勢，并且可極大程度的減弱毒副作用［23,24］。為此，從中醫(yī)藥寶庫深入挖掘防治NAFLD的中藥和治療方案，具有重大的臨床意義。

二陳湯最早見于《太平惠民和劑局方》，被譽(yù)為“千年祛痰方”。后世各醫(yī)家根據(jù)“異病同治”的理論，將該方隨證化裁，應(yīng)用于一系列由“痰濕”之邪所誘發(fā)的疾病，比如代謝性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病等。現(xiàn)代研究［25-28］發(fā)現(xiàn)，二陳湯具有良好的化痰、降血脂的藥理作用，可以從降低脂質(zhì)累積和減輕氧化應(yīng)激損傷等角度改善NAFLD的進(jìn)展。為了解二陳湯的可能藥理機(jī)制，經(jīng)HPLC-MS分析，我們發(fā)現(xiàn)二陳湯的活性成分包含柚皮素、野漆樹苷、甘草酸和甘草查爾酮A。其中柚皮素、野漆樹苷及甘草查爾酮A均為黃酮類化合物，具有護(hù)肝解毒和抗氧化等作用。研究表明柚皮素可有效降低機(jī)體內(nèi)TC和TG的生成和累積，亦具有良好的抗炎作用［29,30］；野漆樹苷具有抗過氧化、清除自由基、抗炎的作用［31,32］；甘草酸具有抗炎、降脂、抗氧化等多種生化與藥理特性，亦可以抑制高糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷［33］；甘草查爾酮A可以通過Nrf2介導(dǎo)的防御機(jī)制起到良好的護(hù)肝作用［34］。本研究選用高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠經(jīng)典模型，成模率高，穩(wěn)定性好。研究結(jié)果顯示，高脂飲食3個月成功誘導(dǎo)小鼠肝臟發(fā)生明顯的脂質(zhì)累積。經(jīng)多烯磷脂酰膽堿和二陳湯干預(yù)后，小鼠的脂質(zhì)代謝狀態(tài)均得到部分改善，與既往研究結(jié)果相符［25,35］，但是二陳湯的降脂效果較多烯磷脂酰膽堿顯著。上述結(jié)果表明二陳湯對NAFLD中脂質(zhì)代謝具有良好的調(diào)節(jié)作用。

鐵離子是有機(jī)生物維持正常過程所需的重要元素，通過參與氧氣運(yùn)輸、線粒體呼吸、物質(zhì)代謝和細(xì)胞信號傳導(dǎo)等維持機(jī)體的正常生理功能。而鐵代謝失調(diào)將會導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生，包含貧血、NAFLD、心血管疾病、腫瘤等多種疾?。?6］。在部分肥胖者中，脂代謝紊亂與鐵過載往往并存。我們前期的研究表明，高脂飲食可加劇小鼠鐵離子代謝紊亂，并上調(diào)血清鐵離子和肝組織鐵離子濃度［9］。所以調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)可能是防治NAFLD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。另外，有研究表明，除了肝臟、小腸和骨髓，脾臟也是鐵離子代謝的關(guān)鍵靶器官，與機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)［37,38］。因此，為了進(jìn)一步揭示NAFLD小鼠體內(nèi)鐵代謝紊亂的可能調(diào)控機(jī)制，本研究重點(diǎn)探討脾臟功能改變對鐵離子代謝的影響和可能存在的作用機(jī)制。我們采用普魯士藍(lán)染色方法證實高脂飲食顯著降低脾臟鐵離子的含量。上述結(jié)果表明，高脂飲食不僅誘導(dǎo)肝臟鐵代謝紊亂，還加劇脾臟鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào)。研究表明與Tf結(jié)合的三價鐵離子，通過與肝細(xì)胞膜上的TfR蛋白結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞鐵離子的吸收［39］。進(jìn)入胞內(nèi)的三價鐵離子通過鐵還原酶Steap3將三價鐵還原為二價鐵。Fpn1，作為一種跨膜的鐵輸出蛋白，是鐵離子釋放的唯一出口，負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)的二價鐵離子排出胞外［40,41］。我們的研究表明，高脂飲食通過抑制TfR蛋白表達(dá)減少脾臟細(xì)胞鐵離子的攝入。上調(diào)的Steap3可以促進(jìn)三價鐵轉(zhuǎn)換成二價鐵，然后通過Fpn1蛋白將脾臟細(xì)胞鐵離子排出，進(jìn)而降低脾臟鐵離子含量，最終導(dǎo)致NAFLD鐵代謝紊亂。目前大部分的研究主要從脂代謝紊亂方向探討二陳湯防治NAFLD的效果。結(jié)合前面所述，脂代謝紊亂所誘發(fā)的“二次打擊”才是NAFLD 進(jìn)一步惡化的關(guān)鍵。為此，我們試圖從另外的角度探討二陳湯防治NAFLD的作用機(jī)制。中醫(yī)理論認(rèn)為脾主運(yùn)化水液和水谷精微以化生氣血，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中脾臟代謝鐵離子的生理功能不謀而合。結(jié)合中藥“多靶點(diǎn)、多層面”的優(yōu)勢，我們猜測二陳湯可能通過調(diào)控脾臟鐵穩(wěn)態(tài)緩解NAFLD的進(jìn)展。此外，我們已經(jīng)證實化橘紅可有效降低高脂飲食誘導(dǎo)的鐵離子代謝紊亂［9］。如預(yù)期那樣，二陳湯可以有效逆轉(zhuǎn)上述結(jié)果，而多烯磷脂酰膽堿與二陳湯相比，改善鐵離子代謝的能力無顯著性差異。因此，二陳湯通過改善脾臟細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子的能力以維持NAFLD鐵穩(wěn)態(tài)。

現(xiàn)代研究表明飲食和紅細(xì)胞降解釋放是鐵離子的主要來源［42,43］。人體每天需要20～25 mg的鐵離子以維持正常的生理功能，但飲食來源的鐵離子只有1～2 mg/d［35］。因此紅細(xì)胞來源的鐵離子是維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)的重要來源。而脾臟紅髓的巨噬細(xì)胞是降解衰老和損傷紅細(xì)胞的重要細(xì)胞。CD163+巨噬細(xì)胞是一類重要的噬紅細(xì)胞，可通過血紅素加氧酶(HO-1)降解血紅素以回收再利用鐵離子［44］。因此，我們通過Ter-119標(biāo)記紅細(xì)胞，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示高脂飲食并沒有改變脾臟紅細(xì)胞的數(shù)量。與對照組相比，模型組CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)量雖然顯著升高，但模型組脾臟鐵離子含量卻明顯降低（普魯士藍(lán)染色結(jié)果），似乎兩者相互矛盾。此外，二陳湯未能顯著改變CD163+巨噬細(xì)胞的數(shù)量。有趣的是，與對照組相比，高脂飲食顯著降低脾臟細(xì)胞HO-1蛋白的表達(dá)。而二陳湯和多烯磷脂酰膽堿可上調(diào)HO-1的表達(dá)。綜上所述，二陳湯通過上調(diào)CD163+巨噬細(xì)胞HO-1蛋白的表達(dá)影響該類噬紅細(xì)胞的功能，以改善機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)。

綜上，本研究證實二陳湯不僅可以改善NAFLD脂代謝紊亂，而且可以通過調(diào)控脾臟細(xì)胞鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力和脾臟巨噬細(xì)胞降解紅細(xì)胞能力改善NAFLD鐵代謝紊亂，為臨床治療NAFLD提供新的切入點(diǎn)和方向。然而，二陳湯作為中藥復(fù)方，具有多靶點(diǎn)、多層面干預(yù)的優(yōu)勢和特色，本研究仍存在一些局限性。其對于NAFLD脾臟細(xì)胞鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力相關(guān)靶標(biāo)蛋白的調(diào)控仍需相應(yīng)的基因調(diào)控小鼠進(jìn)一步深入探討。此外，后續(xù)將依據(jù)HPLC-MS分析的結(jié)果，進(jìn)一步明確二陳湯中活性成分干預(yù)NAFLD進(jìn)展的具體作用機(jī)制。