林曉豐,黃馬養(yǎng),陳君千,周遜,鐘卓丹,陸文聰,黃顯瑩,劉添文
1廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院脾胃病科,廣東 廣州 510515;2廣東省婦幼保健院兒科,廣東 廣州 510515;3南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院血管介入科,廣東廣州510515
惡性腫瘤已成為大多數患者死亡的主要原因,其中結直腸癌和胃癌的死亡率居全世界第2和第3位[1-3],目前根治性手術切除仍是胃腸道惡性腫瘤患者治愈的唯一機會,據報道約50%的患者術后5年內復發(fā),且中晚期胃腸道惡性腫瘤患者的復發(fā)率更高[4,5]。多項研究證實,對于晚期腫瘤或腫瘤術后復發(fā)轉移患者,一線、二線化療為最佳支持治療,可延長中位生存時間,提高生活質量[6-9]。針對此類患者而言,2020年美國國立綜合癌癥網絡、歐洲腫瘤協會以及中國衛(wèi)生部均推薦鉑類聯合氟尿嘧啶類藥物作為一線治療藥物。盡管其研究工作取得了重大的進展,但此類治療藥物選擇仍然有限,且毒副作用嚴重[10,11]。因此,尋找一種既能提高療效又能避免傳統輔助化療毒副作用的新治療方案是突破目前突破胃腸道惡性腫瘤治療瓶頸的關鍵。
化學動力治療(CDT)是利用金屬催化劑在腫瘤缺氧微環(huán)境下,將細胞內過表達H2O2轉化為高毒性羥基自由基(·OH),在不需要外界刺激的情況下引起腫瘤細胞嚴重的氧化損傷[12]。與其他治療方式相比,CDT由腫瘤微環(huán)境特異性觸發(fā),能夠有效減少對體內正常組織的損傷[13]。另外,CDT與化療聯合具有顯著的協同作用,一方面可以通過化療藥物增加H2O2濃度,使CDT治療效果增強,另一方面可以減少化療藥物的副作用,因此,CDT與化療相結合有望成為一種新型、有效的胃腸道惡性腫瘤治療方案[14,15]。而作為化學動力試劑的錳基金屬納米材料,如MnO、MnO2、MnSiO3、MnS等,適合在腫瘤組織的微酸性(pH 4.5~6.5)環(huán)境中催化類芬頓反應,從而重塑腫瘤微環(huán)境,誘導腫瘤細胞死亡,因而在腫瘤治療中極具潛力。一般情況下,被動的錳基納米藥物療效差、副作用大。因此,需要賦予納米藥物具備主動遞送能力及催化屬性來促進腫瘤細胞內攝取并提高類芬頓催化效率,進而強化CDT作用。基于此,本研究制備了一種新型的納米材料,即攜載葡萄糖氧化酶的富含錳介孔二氧化硅(MSN@Mn-GOx),探索了其物化表征以及在胃腸癌細胞系中的抗腫瘤效應,以證實該材料是否能夠用于胃腸道惡性腫瘤的CDT。
首先,將2 g 十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)與0.02 g三乙胺(TEA)混合,加入20 mL ddH2O,在80 ℃下攪拌20 min 進行預熱。加入1.5 mL 正硅酸乙酯(TEOS)并在80 ℃下攪拌4 h。離心后,分別用乙醇和ddH2O洗3次。然后將產物溶于20%鹽酸,75 ℃洗滌12 h,洗滌3次,除掉CTAC。其次,10 mL得到的純凈MSN 溶液加入10 mL MnSO4·H2O(8 mg/mL),攪拌20 min,然后將混合物轉移至高溫反應器中(180 ℃12 h),將所得產物ddH2O洗滌3次,得到MSN@Mn納米。將GOx(1 mg/mL)添加到MSN@Mn納米溶液中,室溫避光攪拌4 h,得到MSN@Mn-GOx納米顆粒。
將MSN@Mn-GOx 納米顆粒稀釋并滴加到鎳網上,使用JEM-2100F透射電子顯微鏡(日本JEOL)拍攝MSN@Mn-GOx的表面形態(tài)。利用動態(tài)光散射原理測定MSN@Mn和MSN@Mn-GOx納米顆粒的粒徑和電勢。用能源分析EDS分析納米元素種類。用電感耦合等離子體質譜分析儀ICP 分析納米復合物中錳的含量。用光電子能譜儀XPS分析納米復合物中錳的價態(tài)。
采亞甲基藍(MB)評估MSN@Mn-GOx的化學動力效能,即類芬頓催化能力。MSN@Mn-GOx與不同pH的PBS(pH=6.0和pH=7.5)孵育后,采用分光光度計檢測各組溶液在λ=664 nm的吸光度。
MSN@Mn-GOx與含/不含葡萄糖的含氧溶液中進行孵育,使用溶解氧儀(Thermo)檢測不同時間點溶液中的氧含量。
雌性裸鼠(4~5周齡)購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。將腸癌細胞(HT-29)以5×106/200 μL的密度注射到雌性裸鼠的右背部,構建荷瘤小鼠腸癌模型。當荷瘤小鼠腫瘤體積超過20 mm×20 mm×20 mm時,在麻醉下將MSN@Mn-GOx納米顆粒(6 mg/kg)經尾靜脈注射到荷瘤小鼠體內。使用7.0 T MAGNETOM Skyra 磁共振成像系統(Philips)對不同濃度的MSN@Mn-GOx納米顆粒溶液(50、100、150、200、250 μg/mL)和注射MSN@Mn-GOx納米顆粒前后的小鼠進行T1加權序列掃描,獲得MRI成像圖片。
胃腸癌細胞(AGS和HT-29)購自中科院上海細胞庫,使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每24 h更換1次培養(yǎng)基,細胞密度超過70%時,以0.25%胰酶消化進行傳代培養(yǎng)。
取對數生長期的胃腸癌細胞進行體外實驗,實驗分為Control組(PBS)、MSN@Mn組(20 μg/mL MSN@Mn納米顆粒)和MSN@Mn-GOx組(20 μg/mL MSN@Mn-GOx納米顆粒)。
胃腸癌細胞(AGS和HT-29)按10 000/孔接種于共聚焦培養(yǎng)皿,細胞貼壁后分別加入MSN@Mn 和MSN@Mn-GOx納米顆粒(均為20 μg/mL),常規(guī)培養(yǎng)24 h后按照檢測試劑盒說明書加入DCFH-DA綠色熒光探針,37 ℃避光孵育30 min,加入含DAPI的抗熒光淬滅封片液,激光共聚焦顯微鏡(Olympus)下觀察細胞內的熒光強度。
胃腸癌細胞(AGS和HT-29)按1000/孔接種于96孔板,細胞貼壁后分別加入不同濃度的MSN@Mn和MSN@Mn-GOx納米顆粒(均為0、2、4、16、25、50 μg/mL)并繼續(xù)培養(yǎng)24 h,加入10 μL CCK-8試劑,37 ℃孵育2 h,酶標儀設置450 nm波長測定吸光度A450nm。
胃腸癌細胞(AGS和HT-29)按10 000/孔接種于共聚焦培養(yǎng)皿,細胞貼壁后分別加入MSN@Mn 和MSN@Mn-GOx納米顆粒(均為20 μg/mL),常規(guī)培養(yǎng)24 h 后加入含10 μmol/L EdU 染液,繼續(xù)孵育2 h;EdU 標記細胞完成后加入1 mL 4%多聚甲醛室溫固定30 min;繼續(xù)加入0.5%Triton X-100孵育10 min,最后加入DAPI染液,室溫避光孵育10 min,激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞內的熒光強度。
所有數據均采用IBM SPSS 20.0處理。計量資料以均數±標準差表示,兩組間數據比較采用t檢驗,多組間數據比較采用單因素方差分析,組間數據比較采用LSD-t檢驗。以α=0.05為檢驗水準,對以上結果均進行雙側檢驗,P<0.05為差異具有統計學意義。
透射電鏡圖顯示(圖1A、B),MSN@Mn 及MSN@Mn-GOx納米顆粒均為直徑約100 nm的實心圓球。透射電鏡下的EDS 能譜分析結果顯示:MSN@Mn-GOx 納米復以硅(Si)及錳(Mn)元素為主(圖1C)。電感耦合等離子體質譜分析儀ICP分析結果顯示:MSN@Mn-GOx中錳的含量約為25%。光電子能譜儀XPS分析結果顯示:MSN@Mn-GOx在641.37 eV和653.26 eV處有歸屬于Mn 2p3/2和Mn 2p1/2的特殊吸收峰,MSN@Mn-GOx納米復合物大部分為二價態(tài)的Mn (II)(圖1D)。馬爾文粒徑儀測定顯示,MSN@Mn及MSN@Mn-GOx納米顆粒的水合平均粒徑均約為100 nm(圖1E),平均Zeta電位分別為-32 mV及-35 mV(圖1F)。
同樣H2O2濃度的條件下,不同pH 溶液的MSN@Mn-GOx展示出不同的吸光度。相比于pH=7.4的Control組,pH=7.4的溶液中加入MSN@Mn-GOx納米顆粒后其吸光度明顯下降,而加入MSN@Mn-GOx納米顆粒的pH=6.0 溶液,其吸光度進一步下降(P<0.05,圖2A)。氧消耗實驗顯示:MSN@Mn-GOx與葡萄糖混合后,培養(yǎng)液中溶解的氧氣水平隨著時間的延長而降低(圖2B)。
MRI成像結果顯示:相比于Control組,MSN@Mn-GOx組可顯示出更強的T1加權核磁成像信號值,且隨著濃度的升高,其T1信號值越強(圖3A)?;铙w成像數據可看出:相比于注射MSN@Mn-GOx納米顆粒前的圖片,注射MSN@Mn-GOx納米顆粒4 h后的裸鼠腫瘤部位有明顯的T1增強信號(P<0.01,圖3B)。
圖3 MSN@Mn-GOx的核磁成像能力Fig. 3 MRI capability of MSN@Mn-GOx.A:MRI and SNR quantitative analysis of different concentration of MSN@Mn-GOx.B:MRI and SNR quantitative analysis of tumor-bearing mice treated with MSN@Mn-GOx.**P<0.01.
激光共聚焦圖片分析顯示:相比于Control組,MSN@Mn及MSN@Mn-GOx組能增加胃腸癌細胞內的活性氧(ROS)水平;相比于MSN@Mn組,MSN@Mn-GOx組處理產生的ROS水平明顯增加(圖4)。
CCK-8 細胞毒性實驗結果顯示,不同濃度MSN@Mn及MSN@Mn-GOx納米顆粒(0、2、4、16、25、50 μg/mL)處理的胃腸癌細胞存活率呈濃度依賴性降低,具有顯著的抗增殖作用;與相同濃度的MSN@Mn相比,MSN@Mn-GOx處理的細胞存活率更低下(P<0.05,圖5)。
圖5 MSN@Mn-GOx對胃腸癌細胞生長活力的影響Fig. 5 Effects of MSN@Mn-GOx on viability ofAGS and HT-29 cells.*P<0.05.
EdU實驗結果顯示,相比于Control組,MSN@Mn及MSN@Mn-GOx組能顯著減少胃腸癌細胞內的EdU熒光陽性率;MSN@Mn-GOx組細胞EdU熒光陽性率較MSN@Mn組降低(圖6)。
胃腸道惡性腫瘤是較常見的消化道惡性腫瘤之一[3]。目前,進展期胃腸道惡性腫瘤患者的治療主要以根治性切除聯合術后輔助化療為主。但傳統化療藥物容易引發(fā)脫發(fā)、惡心嘔吐、骨髓抑制等全身多系統毒副作用,也易造成化療耐藥,一定程度上限制了該類藥物的臨床應用。近年來,光動力療法(PDT)、光熱療法(PTT)、和化學動力療法(CDT)等新的腫瘤治療策略正在積極開發(fā)和探索。其中,CDT是一種基于芬頓化學原理的有效抗腫瘤策略,因其獨特的活性氧(ROS)生成方式而受到廣泛關注[13,16]。各種化學動力試劑金屬離子的納米材料已經被開發(fā),例如Fe2+、Cu+、Co2+、Mn2+、Ti3+等[17-19]。本研究以介孔二氧化硅(MSN)為載體,成功制備了含有Mn2+的納米載藥復合物MSN@Mn-GOx,該材料充分發(fā)揮了MSN載藥量高、毒性低的優(yōu)點,借助Mn2+及GOx的偶聯,實現了強大的芬頓催化效應;同時,體外細胞實驗表明,MSN@Mn-GOx對胃腸癌細胞的增殖特性具有顯著抑制作用,展現出高效的抗腫瘤作用。
鐵基材料是以往研究最廣泛的CDT 納米催化劑[20]。然而,近年來的研究表明,Mn2+介導的類芬頓反應比Fe2+介導的芬頓反應具有更高的催化活性,特別是在接近中性的微酸性環(huán)境中[21-23]。因此,錳基納米材料也被開發(fā)用于CDT,例如有研究報道了用于CDT 和PDT的H-MnCO3/Ce6-PEG多功能納米顆粒,Mn2+可在腫瘤微環(huán)境弱酸性條件下由MnCO3快速釋放并實現CDT[24]。有研究開發(fā)了一種用于聲動力治療和CDT的Au@MnO納米顆粒[25]。在超聲輻射和谷胱甘肽作用下,Au@MnO可分解為Mn2+和超小Au納米粒子,超小Au納米納米粒子實現聲動力治療,Mn2+催化H2O2實現CDT。同時,用于CDT的錳基納米材料還有MnO2[26]、MnSiO3[27]、MnS[28]等。除此之外,作為順磁性物質,Mn2+是一種良好的MRI造影劑,具備較高的R1值,這提示本研究制備的MSN@Mn-GOx在體內MRI成像中也將具備良好的成像效果[29,30]。為驗證這一假設,我們在藥物處理后麻醉了小鼠并進行了MRI掃描。結果顯示:經MSN@Mn-GOx處理后,腫瘤部位出現增強T1加權信號,表明該材料不僅能夠能實現腫瘤治療,而且能夠精確定位腫瘤病灶,對制定臨床診治方案具有重要的指導意義。
Mn毒性大,且腫瘤細胞內H2O2濃度有限,難以達到滿意的抗腫瘤效果。本研究在引入錳基材料的同時加入了天然酶GOx。GOx能夠與細胞內的葡萄糖和氧氣發(fā)生反應,生成大量的H2O2和葡萄糖酸,該過程中產生的H2O2可用于后續(xù)Mn納米顆粒催化的類芬頓反應,而葡萄糖酸的生成不斷增強了腫瘤低pH環(huán)境,進一步提高了類芬頓反應催化效率,而這些連續(xù)的催化反應產生大量強氧化損傷的·OH,從而引發(fā)腫瘤細胞的凋亡和壞死[27,31-33]。因此,GOx是腫瘤饑餓治療的理想內源性氧化還原酶。有研究以聚乙二醇修飾的GOx為模板,采用仿生礦化的方法制備銅離子摻雜的磷酸鈣納米顆粒,再負載藥物DOX得到PGC@DOX納米復合材料。該材料在進一步提升GOx的穩(wěn)定性和安全性的同時,還具備生成H2O2及清除GSH的功能,可有效進一步提升Cu2+介導的CDT的療效[34]。Zhang等[27]還開發(fā)了負載GOx的納米復合材料,該材料將Mn納米材料與GOx雜化,實現腫瘤葡萄糖代謝的自放大調控。一方面,錳納米材料催化H2O2生成O2;形成的O2能夠促進納米復合物中GOx 的葡萄糖消耗能力,有效調控葡萄糖代謝。另一方面,后一反應形成的H2O2也有利于Mn納米材料的催化反應。本研究還證實,MSN@Mn-GOx組較MSN@Mn組細胞ROS生成水平更高,在細胞增殖實驗中表現出更強的抗腫瘤作用。因此,MSN@Mn-GOx的成功制備有望做到腫瘤饑餓治療和CDT的雙模式協同治療。
綜上所述,本研究成功制備了納米復合物MSN@Mn-GOx,并初步驗證該材料具有良好的類芬頓催化反應,并能夠協同GOx實現腫瘤的饑餓療法,表現出顯著的抗腫瘤作用,可用于磁共振成像和級聯反應增強的協同腫瘤治療,在臨床上具有治療腫瘤的潛力。