李洪濤，鄧宇，王添樂，黃克勇，于傳沛，陳朝俊

1廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510006；2連山縣小三江鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院，廣東 清遠 513224；3廣州中醫(yī)藥大學附屬廣州中西醫(yī)結合醫(yī)院腦病科，廣東 廣州510800

動脈粥樣硬化（AS）是大多數(shù)心肌梗死、卒中以及致殘性外周動脈疾病的誘因，在世界范圍內具有較高的發(fā)病率和死亡率［1］。內皮細胞炎癥是AS始動因素和推動因素，表現(xiàn)為氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）沉積、內皮細胞損傷以及血管壁上斑塊的形成和堆積［2］。細胞焦亡是新近發(fā)現(xiàn)的由消皮素D（GSDMD）介導的一種炎癥性程序性細胞死亡方式［3］，與AS病理過程關系密切［4］，而核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體激活下游的caspase家族是導致細胞焦亡的經(jīng)典途徑［5］，其分子機制之一為caspase-1 激活，切割GSDMD使細胞膜完整性破壞，細胞破裂并釋放IL-1β等炎癥因子［6］，引發(fā)AS并促進其發(fā)展。NF-κB是一個可誘導轉錄因子家族，也是已知的NLRP3主要激活因素，可提高NLRP3的mRNA表達水平，促進NLRP3炎癥小體的合成，并推動其介導的細胞焦亡［7］，NF-κB1（p50）是NF-κB家族的主要成員之一。相關研究表明，ox-LDL可通過NF-κB信號通路，激活NLRP3炎癥小體，導致caspase-1前體被活化并促進IL-1β分泌［8］，引發(fā)細胞焦亡，加劇炎癥反應，導致AS的發(fā)生和進展。

AS可歸屬于中醫(yī)“脈痹”、“胸痹”、“中風”等范疇［9］，以元氣虧虛為本，病邪內生為標。元氣虧虛，運轉無力而氣機壅滯，氣虛無法助血運，則血停而為瘀，形成“氣虛-氣滯-血瘀”的病理過程，而血脈不通、停而為瘀是AS核心病機，“瘀久化熱，醞釀成毒”形成的“瘀毒互結”是AS產(chǎn)生及斑塊破裂的關鍵［10］。廣東省名中醫(yī)陳朝俊教授針對AS“因虛而滯，因滯而瘀”特點所研制的中成藥“參七脈心通膠囊”具有良好的抗AS作用［11］，前期研究表明其作用機制可能與干預NF-κB有關［12］。丹參是其主要藥物組成之一［13］，味苦能泄，性寒能除熱，具有“活血，祛瘀，涼血”等作用［14］，《重慶堂隨筆》謂之“降而行血，血熱而滯者宜之”［15］，《本草匯言》亦稱其“善治血分，去滯生新”［16］，切中AS“瘀久化熱，瘀毒互結”的關鍵病機。丹參及其制劑現(xiàn)已在抗AS、抗腫瘤及治療腦卒中、冠心病、心絞痛等方面廣泛應用［17］。丹參新醌乙是丹參二萜醌類有效成分［18］，已有研究表明該類成分具有免疫調節(jié)、抗炎、抗腫瘤等作用［19］，而相關體外實驗已證實丹參新醌乙對NF-κB通路具有抑制作用［20］，但其下游反應涉及的相關因子及機制尚不明確。此外，國內外尚缺乏關于丹參新醌乙抗AS及其作用機制的相關研究?；诖?，本研究擬從NF-κB/NLRP3信號通路入手，探討丹參新醌乙對ox-LDL誘導內皮細胞損傷的影響并從體外水平分析其抗AS的可能機制，以期為藥物的開發(fā)和應用提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞和試劑

人臍靜脈內皮細胞（HUVECs），由廣州合創(chuàng)生物提供。

丹參新醌乙（Biopurify）；ox-LDL（翊圣生物）；胎牛血清、Ham's F-12K（Kaighn's）培養(yǎng)基、PBS磷酸鉀緩沖液、青鏈霉素（Hyclone）；肝素（北京索萊寶）；牛內皮細胞促分裂劑（ECGS Bovine）（Adooq）；總RNA抽提試劑（Trizol）（Invitrogen）；引物由上海生工定制合成；PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、TB Green?Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）（Takara）；極超敏ECL化學發(fā)光試劑盒、CCK-8溶液(碧云天)；LDH測試盒（南京建成）；Rabbit Anti-Mouse IgG(H+L)(1∶4000)、Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)(1∶5000)(southern biotec)；peroxidase-Rabbit Anti-Goat IgG (1∶3000)、peroxidase-Rabbit Anti-Rat IgG(1∶2000)(武漢博士德)；Anti-beta-Actin antibody (1∶10000)、Anti-NLRP3 antibody(1∶1000)、Anti-IL-1β antibody(1∶1000)、Anti-NFκB p105/p50 antibody(1∶1000)(Bioss)；蛋白marker(Thermo)；Anti-cleaved N-terminal GSDMD antibody(1∶1000) (Abcam)；Anti-Cleaved caspase-1 antibody(1∶1000)(Cell Signaling)；GSDMD 抗 體-N-terminal(Affinity)。

1.2 儀器

潔凈工作臺（蘇州安泰）；低速離心機（中科中佳）；倒置光學顯微鏡（OLYMPUS）；細胞恒溫培養(yǎng)箱（Thermo scientific）；酶標儀（Thermo Fisher Scientific）；分析天平（德國賽多利斯）；控溫磁力攪拌器（金壇市醫(yī)療儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀（Bio-Rad）；高速冷凍離心機（SIGMA）；旋渦混合器（海門其林貝爾）；電熱恒溫水槽（上海一恒）；Real Time PCR儀（ABI）；垂直電泳槽、轉移電泳槽、電泳儀、半干轉移電泳槽、顯影儀（上海天能）；臺式高速冷凍離心機（上海天美）；核酸蛋白檢測儀（上海嘉鵬）。

1.3 HUVECs的培養(yǎng)

取出復蘇細胞培養(yǎng)瓶，吸掉舊培養(yǎng)液，離心收集細胞，用PBS洗滌細胞2次，加入trypsin-EDTA溶液（1 mL/25 cm2，2 mL/75 cm2），吹打散細胞，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin作用，然后離心收集細胞。以吸管上下吸放數(shù)次以打散細胞團塊，混和均勻后，補足3n（n為傳代瓶數(shù)）mL培養(yǎng)基，依稀釋比例轉移至新的培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)條件為5%CO2、飽和濕度、37 ℃的CO2培養(yǎng)箱。

1.4 CCK-8法篩選最佳藥物濃度及作用時間

用DMSO 溶解藥物，配成5 mg/mL母液，微孔過濾，-20 ℃長期保存，加藥時現(xiàn)用現(xiàn)配。取對數(shù)生長期HUVECs，消化細胞后吹打散細胞，計數(shù)，調整細胞濃度為1×105/mL，分到96孔板，1×104/孔，待細胞貼壁后，分為處理組（分別加入50、100、500、1000、2000ng/mL丹參新醌乙）和對照組（一組不進行處理，另一組加入DMSO），恒溫37℃，5%CO2培養(yǎng)24、48、72 h，收集各個時間點的細胞按1∶10比例加入CCK-8溶液，孵育2 h后，酶標儀讀板，CCK-8檢測讀取A450nm數(shù)據(jù)。

結果顯示不同濃度丹參新醌乙對HUVECs 處理48 h有微弱的增殖抑制作用，處理72 h后增殖抑制有較明顯的增強并有一定劑量效應；而處理24 h的分組中，不同濃度丹參新醌乙對細胞無明顯的增殖抑制作用，故選擇100 ng/mL，處理24 h作為后續(xù)實驗的條件。同時設置以DMSO處理的HUVECs作對照。

1.5 造模與分組

取HUVECs分為4組；正常組，ox-LDL組、二甲基亞砜（DMSO）組和丹參新醌乙組。干預方式如下：正常組為HUVECs加入10%胎牛血清，ox-LDL組在正常組基礎上加入100 μg/mL（濃度選擇參考既往相關研究［21］的結果）的ox-LDL構建內皮細胞損傷模型，DMSO組在ox-LDL組基礎上加入0.1%濃度藥物溶劑DMSO，丹參新醌乙組在ox-LDL組基礎上分別加入用DMSO溶解的100 ng/mL濃度丹參新醌乙，置于條件為37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h進行后續(xù)實驗。

1.6 檢測指標

1.6.1 微板法檢測乳酸脫氫酶（LDH）水平 取HUVECs在6孔板接種2×105/孔，在條件為37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，分別按上述各組干預方式進行處理，每組設置3個復孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集細胞上清液，根據(jù)乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒說明書進行操作。實驗重復3次，取平均值。

1.6.2 qRT-PCR 法檢測NF-κB1、NLRP3、GSDMD、IL-1β的mRNA表達 按每個培養(yǎng)皿5×107個將HUVECs接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，分別按上述各組干預方式進行處理，培養(yǎng)24 h后，按照總RNA 抽提試劑Trizol 說明書操作，提取各組細胞總RNA，按照PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明逆轉錄成cDNA，采用Primer 3.0設計RT-PCR引物，引物序列見表1，引物序列經(jīng)NCBI nBlast比對無非特異性擴增，進行反應體系的配制，反應參數(shù)參考TB Green?Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明進行，RT-PCR的擴增曲線和融解曲線應用ABI VII a7 Real-Time PCR System 的操作方法進行，對NF-κB1、NLRP3、GSDMD、IL-1β的基因進行擴增，以GAPDH為內參，以2-ΔΔCt計算NF-κB1、NLRP3、GSDMD、IL-1β的mRNA相對表達量。

表1 RT-PCR各基因所用引物序列及產(chǎn)物片段Tab.1 Primer sequences for RT-PCR and the product length

1.6.3 Western blot 檢測NF-κB1、NLRP3、caspase-1、GSDMD-N的蛋白表達 在6孔板上接種HUVECs，待覆蓋率達到80%～90%時對各組進行相應干預并培養(yǎng)24 h，后取樣品1000 r/min離心10 min，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，再1000 r/min 離心5 min 后棄上清，PBS 洗滌，1000 r/min離心5 min后吸去PBS溶液，加入提取緩沖液以4 ℃輕搖15 min，收集裂解液以14 000 r/min離心15 min后取上清，以BCA法測量蛋白濃度。按2∶1加入上樣緩沖液充分混合，煮沸變性5 min，凍存?zhèn)溆茫瑓⒄照f明書進行SDS-PAGE電泳（80 V恒壓50 min，120 V恒壓電泳至溴酚藍剛出膠底部），將凝膠上蛋白轉至PVDF膜，以5%脫脂奶粉溶液37 ℃封閉1 h，封閉結束后以TBST洗膜3次，每次5 min，1∶1000稀釋比例一抗4 ℃孵育過夜，洗膜，二抗稀釋液37 ℃孵育1 h，洗膜，蒸餾水漂洗膜2 min，棄去液體，共洗3次，后將雜交膜置于一透明塑料板上，用干移液器將化學熒光發(fā)光底物均勻地加到膜的表面，使反應持續(xù)5 min，濾紙吸去膜表面多余底物溶液，放至暗盒，最后進行顯影。

1.6.4 免疫熒光法觀察GSDMD表達 在24孔板上按2×104/孔接種HUVECs，同上方法處理后，吸除廢液，PBS 洗滌2次，通透，封閉。加入一抗4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，每次5 min。標記二抗（GSDMD抗體-Nterminal，以1∶200 比例稀釋），37 ℃孵育1 h，PBS 洗3次，每次5 min。滴入DAPI，孵育15 min，PBS漂洗后加入防熒光淬滅劑，封片，最后用熒光顯微鏡獲取圖像。

1.7 統(tǒng)計學處理

運用SPSS25.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理及分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組間Western blot灰度值統(tǒng)計比較采用配對樣本t檢驗，其余兩組間比較使用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組LDH水平比較

與正常組比較，ox-LDL組、DMSO組LDH濃度水平明顯增加（P＜0.01）；與ox-LDL組、DMSO組比較，丹參新醌乙組LDH濃度水平顯著下降（P＜0.05，圖1）。

圖1 LDH濃度比較Fig. 1 Comparison of lactate dehydrogenase concentration in the supernatant of human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)among the groups.A:Standard curve of sodium pyruvate.B:Comparison of lactate dehydrogenase concentration.**P＜0.01,*P＜0.05 vs control group.

2.2 NF-κB1、NLRP3、GSDMD、IL-1β的mRNA 表達比較（圖2）

圖2 各組NF-κB1、NLRP3、GSDMD、IL-1β的mRNA表達水平比較Fig. 2 Comparison of NF-κB1,NLRP3,GSDMD and IL-1β mRNA expression levels among the groups.**P＜0.01,*P＜0.05 vs control group.

與正常組比較，ox-LDL 組、DMSO 組NF-κB1、NLRP3、GSDMD、IL-1β的mRNA 水平均有顯著上調（P＜0.01）；與ox-LDL組、DMSO組比較，丹參新醌乙組NF-κB1、NLRP3、GSDMD、IL-1β的mRNA水平均有顯著下調（P＜0.01）。

2.3 NF-κB1、NLRP3、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β的蛋白表達水平比較

Western Blot 法檢測各組細胞NF-κB1、NLRP3、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β的蛋白表達差異，對各蛋白平均灰度值進行半定量分析，結果（圖3）顯示：與正常組比較，ox-LDL 組、DMSO 組NF-κB1、NLRP3、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β的蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）；與ox-LDL組、DMSO組比較，丹參新醌乙組NF-κB1、NLRP3、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β的蛋白水平顯著下調（P＜0.01）。

圖3 NLRP3、GSDMD-N、caspase-1、IL-1β、NF-κB1蛋白表達水平比較Fig. 3 Protein expression levels in each group. A:Western blot of NLRP3,GSDMD-N,caspase-1,IL-1β and NF-κB1 proteins. B: Relative expressions of these proteins.**P＜0.01,*P＜0.05 vs control group.

2.4 細胞免疫熒光及GSDMD表達

經(jīng)ox-LDL處理后，GSDMD表達水平明顯上升，免疫熒光圖片表明ox-LDL處理的GSDMD有侵犯細胞質的表現(xiàn)，且有明顯入核蛋白出現(xiàn)。而經(jīng)丹參新醌乙處理后，GSDMD整體表達水平明顯下降，在細胞質中的表達下降，提示丹參新醌乙可有效限制GSDMD的表達，減輕細胞形態(tài)破壞（圖4）。

圖4 GSDMD表達和定位的免疫熒光染色Fig. 4 Immunofluorescence staining for observing gaselermin D (GSDMD) expression and localization (Original magnification:×400).

3 討論

血管內皮細胞損傷被認為是AS發(fā)生的始動因素，而炎癥反應在其中發(fā)揮重要作用，促炎因子的產(chǎn)生加劇AS的進程，導致斑塊增厚、破裂、積聚、血栓形成，從而引起急性心腦血管疾?。?2］。在這一過程中，ox-LDL通過刺激內皮細胞釋放單核細胞趨化蛋白-1促進單核細胞對內皮黏附，同時促進內皮細胞活性氧的生成使促炎相關基因表達增加并加劇炎癥反應，導致內皮細胞損傷［23］。GSDMD是介導細胞焦亡關鍵蛋白，其受到活化后可分解成N端（GSDMD-N）和C端（GSDMD-C)，GSDMD-N可與細胞膜上的磷脂蛋白結合，發(fā)生多聚化并在細胞質膜上形成孔洞，細胞質膜遭受破壞，從而誘導細胞焦亡的發(fā)生［24］。我們使用ox-LDL對HUVECs進行處理，以LDH作為HUVECs損害的標志產(chǎn)物［25］，并以免疫熒光標記及觀察，結果表明ox-LDL處理可導致HUVECs損傷，且GSDMD在細胞質高表達并具有入核表現(xiàn)，與上述結論一致。而經(jīng)過丹參新醌乙處理后HUVECs損傷明顯減少，且能抑制GSDMD表達，其作用機制值得進一步探究。

轉錄因子NF-κB在細胞免疫、炎癥、焦亡等過程起著至關重要的作用［26］，其家族成員NF-κB1在通常情況下被前體蛋白p105隔離而穩(wěn)定在細胞質中。穩(wěn)定結構破壞后，NF-κB1可轉移至細胞核中啟動相關基因的表達，使NF-κB信號通路活化［27］。無活性的NLPR3受到引爆或啟動信號的激活而發(fā)生寡聚化，繼而組裝成NLPR3炎癥小體［28］，同時觸發(fā)procaspase-1向caspase-1的轉化以及成熟IL-1β的分泌［29,30］，裂解GSDMD并將其切割成GSDMD-N和GSDMD-C，成熟的IL-1β等可通過GSDMD-N形成的跨膜孔隙釋放到胞外并造成炎癥惡化［31］，導致細胞焦亡的發(fā)生。本研究中，經(jīng)ox-LDL處理后NF-κB1的mRNA及蛋白表達均明顯升高，證實了ox-LDL能破壞其與前體蛋白組成的穩(wěn)定結構，NLPR3表達提高，且表明NF-κB 信號具有活化NLPR3 促進NLPR3炎癥小體生成的作用。NF-κB/NLPR3通路激活后，損傷的HUVECs中caspase-1、IL-1β、GSDMD-N表達均明顯升高，表明ox-LDL可誘發(fā)NF-κB/NLPR3活化后引起的級聯(lián)反應引起細胞焦亡。經(jīng)丹參新醌乙處理后，NF-κB1表達作用被抑制，GSDMD表達下降，質膜成孔及入核表現(xiàn)抑制，細胞完整性得到保護，提示丹參新醌乙具有保護NF-κB穩(wěn)定結構及抑制GSDMD表達的作用，且通過阻止NF-κB/NLPR3信號通路的激活，抑制NLPR3活化，干預NLPR3炎癥小體的形成，抑制GSDMD裂解，阻止后續(xù)級聯(lián)事件的發(fā)生，從而抑制細胞焦亡反應。

相關研究表明，NF-κB信號通路激活導致血管壁損傷是斑塊形成的重要原因［32］，NLRP3的活化及NLRP3炎癥小體的合成促使炎癥發(fā)生和加劇是影響AS發(fā)生和發(fā)展的重要因素［33］，而通過降低caspase-1的水平，減少IL-1β的生成，可以抑制細胞炎癥反應從而減緩AS的發(fā)展［34,35］。本研究中，丹參新醌乙組處理后，NF-κB1、NLPR3 及后續(xù)反應產(chǎn)物caspase-1、IL-1β、GSDMD-N的表達均受到抑制，提示丹參新醌乙可通過干預NFκB/NLRP3通路發(fā)揮抗AS作用。此外，本研究設置藥物溶劑DMSO組作為對照，結果表明實驗結論不受藥物溶劑DMSO影響。

中醫(yī)藥雖無AS之病名，但由于其可辨證不辨病的獨特診治方式，在數(shù)千年臨床實踐中留下了寶貴的抗AS經(jīng)驗。AS的形成是以氣虛為始動因素，無力推動津血運行從而形成痰瘀，痰瘀膠結于脈壁，在時間推移下醞釀成毒從而使脈壁損害［36］。近年來研究發(fā)現(xiàn)中藥或制劑在調節(jié)內皮功能、炎癥反應、脂質代謝及腸道微生物等方面發(fā)揮積極的抗AS作用［37］，表明中藥成分在該領域具有深入研究的價值和廣闊的前景，而丹參是其中的代表之一。張凈生采用丹參生脈飲治療冠心病取得顯著療效，其有效成分丹參酮、丹參素被證實能調節(jié)血脂并抑制炎癥［38］。目前丹參酮ⅡA、丹酚酸B等有效成分均被證實具有調節(jié)信號通路、抗炎、免疫調節(jié)的作用［39,40］，提示了丹參“活血化瘀”的作用可能干預以“瘀”為主要病機的AS，我們選取了既往鮮有報道的二萜醌類成分丹參新醌乙作為研究藥物，證實了其具有可靠的改善內皮細胞損傷作用，可能為活血化瘀類藥物成分抗AS研究提供依據(jù)。

綜上，丹參新醌乙對ox-LDL誘導的HUVECs損傷具有保護作用，其機制可能與抑制NF-κB/NLRP3信號通路，下調caspase-1、IL-1β、GSDMD-N的表達，減輕其介導的炎癥反應，抑制細胞焦亡有關。提示丹參新醌乙具有較好的藥用價值，有望作為內皮細胞損傷保護劑進行開發(fā)和利用，其抗HUVECs損傷作用可能為抗AS藥物的研發(fā)及其相關臨床應用提供實驗支撐。然而，NLRP3炎癥小體的產(chǎn)生及其介導的細胞焦亡反應極其復雜，本研究未能明確其中是否涉及其他反應，尚需在后續(xù)研究中深入探討。