張 莉，馬云昊，王 穎*，徐寶才*

（合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

醬鹵肉制品營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，深受消費(fèi)者喜愛[1-2]。為保持產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值和良好口感，工廠在制作過程中加熱溫度較低，而較低溫度僅殺死部分耐熱性低的細(xì)菌，導(dǎo)致產(chǎn)品易腐敗，保質(zhì)期短，這限制了醬鹵肉制品的產(chǎn)品質(zhì)量和銷售范圍。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計(jì)，全球因食品腐敗造成的浪費(fèi)約占產(chǎn)出的1/3[3]。食品腐敗除會(huì)造成資源浪費(fèi)，還會(huì)對(duì)食品安全帶來威脅。因此，研究不同食品的腐敗微生物對(duì)控制其腐敗變質(zhì)具有重要意義[4]。

微生物污染是食品腐敗變質(zhì)的最根本原因，醬鹵肉制品中的微生物主要是在原材料和鹵制完成后的冷卻、包裝及貯存過程中引入。目前，許多學(xué)者對(duì)醬鹵肉制品中的腐敗菌做了廣泛研究。德州扒雞的主要腐敗菌有假單胞菌屬、腸桿菌屬、葡萄球菌屬和乳酸菌屬[5]；氣調(diào)包裝獅子頭的菌群結(jié)構(gòu)主要由芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、鏈球菌屬、不動(dòng)桿菌屬、熱殺索絲菌屬、腸桿菌屬、乳酸菌屬以及嗜冷桿菌屬組成[6]；金黃色葡萄球菌、暹羅芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌是筍子燒牛肉中的優(yōu)勢腐敗菌[7]。前期研究方法主要基于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法肉眼可見醬鹵肉制品中微生物數(shù)量的變化，但只適用于可培養(yǎng)的微生物，如乳酸菌、霉菌和酵母菌等。由于許多微生物無法培養(yǎng)，因此傳統(tǒng)培養(yǎng)方法受到很大限制[8]。近年來，高通量測序技術(shù)發(fā)展較快，其具有通量高、成本低、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，可作為微生物研究的免培養(yǎng)方法之一，在微生物研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[9-10]。

燒雞是典型的醬鹵肉制品，鹵制后的冷卻和包裝工序容易引入微生物，造成燒雞產(chǎn)品的二次污染。微生物的大量繁殖會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品貨架期縮短，所以鹵制后的殺菌和包裝工藝過程對(duì)燒雞的貨架期有很大影響[11]。氣調(diào)包裝（modified atmosphere packaging，MAP）是一種通過控制充入高阻隔性包裝中的氣體比例達(dá)到延長肉制品貨架期目的的保鮮包裝方式，常用的氣體有O2、CO2和N2。CO2可以抑制假單胞菌屬、氣單胞菌屬、莫拉氏菌屬和灰桿菌屬等常見肉制品腐敗菌的生長，從而延長產(chǎn)品的保質(zhì)期，N2一般充當(dāng)填充氣體[12-13]。近年來MAP已逐漸用于熟肉制品的貯藏，能夠解決高溫高壓滅菌等傳統(tǒng)方法造成的食品品質(zhì)下降等問題，在肉品行業(yè)被廣泛應(yīng)用，是肉制品保鮮的重要方法之一[14]。與托盤包裝相比，MAP避免了產(chǎn)品與外界空氣接觸，且充入的氣體能有效延長保質(zhì)期；相比于真空包裝，MAP不會(huì)對(duì)產(chǎn)品造成擠壓，從而能夠保持產(chǎn)品良好的口感品質(zhì)。MAP可解決產(chǎn)品短期貯藏銷售過程中產(chǎn)品質(zhì)量劣變等問題[15-16]。

本研究選取燒雞為研究對(duì)象，旨在研究MAP燒雞在貯藏過程中的理化特性變化，通過高通量測序技術(shù)分析燒雞在低溫貯藏過程中微生物菌群的多樣性和動(dòng)態(tài)變化；在此基礎(chǔ)上通過傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)對(duì)腐敗菌分離鑒定，從而明確MAP燒雞的腐敗菌。旨在為燒雞腐敗變質(zhì)的控制提供技術(shù)參考，也為進(jìn)一步研究MAP保鮮機(jī)制提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燒雞購于安徽省宿州市徽香源食品有限公司。

TG261750 PP氣調(diào)保鮮盒 上海特冠包裝材料有限公司；乳酸菌MRS（Man Rogosa Sharpe）選擇性培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（violet red bile glucose agar，VRBGA）培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、葡萄球菌BP（Baird-Parker）瓊脂基礎(chǔ)選擇性培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、氯化鉀、氧化鎂、硼酸、溴甲酚綠、甲基紅、瓊脂糖（均為化學(xué)純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑（上海）有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）、引物、Phusion Master Mix（2×）、TAE電泳緩沖液生工生物工程（上海）有限公司；E.Z.N.A.?Soil DNA Kit美國BioTek公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen Biosciences公司；NEXTflex?Rapid DNA-Seq Kit美國Bioo Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SCIENTZ-09無菌均質(zhì)器 寧波新芝生物科技股份有限公司；YX280手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器上海三申醫(yī)療器械有限公司；DL-410K氣調(diào)包裝機(jī)大江機(jī)械設(shè)備有限公司；GeneAmp?9700聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR） 美國ABI公司；QuantusTM熒光計(jì) 美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

燒雞鹵煮冷卻后，取24 只同一批次燒雞（每只約600 g）作為樣品，每只燒雞單獨(dú)放入鎖鮮盒中進(jìn)行MAP（25% CO2/75% N2），然后放入冰盒中，加入冰袋，立即運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，4 ℃貯藏。在貯藏0、2、4、6、8、10 d取樣進(jìn)行指標(biāo)測定，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品均設(shè)4 個(gè)平行。取貯藏時(shí)間為0、4、8 d的樣品分別記為Q0（初期）、Q4（中期）和Q8（末期）進(jìn)行高通量測序。

1.3.2 MAP燒雞低溫貯藏期間理化指標(biāo)的測定

1.3.2.1 pH值測定

根據(jù)GB 5509.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》的方法，選取雞胸肉和雞腿肉（不含皮）部位若干小塊切碎混合并稱質(zhì)量，按1∶10（m/V）加入0.9 g/100 mL氯化鉀溶液，用均質(zhì)器進(jìn)行均質(zhì)，過濾，濾液用pH計(jì)測定，得到燒雞pH值。

1.3.2.2 揮發(fā)性鹽基氮含量測定

根據(jù)GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》的自動(dòng)凱氏定氮儀法并稍作修改，使用全自動(dòng)凱氏定氮儀測定燒雞的揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量。選取雞胸肉和雞腿肉（不含皮）切碎混合均勻，稱取10 g加入100 mL蒸餾水，超聲15 min。取10 mL液體與10 mL MgO懸液（0.01 g/mL）混合，然后使用全自動(dòng)凱氏定氮儀測定。根據(jù)0.01 mol/L鹽酸溶液的消耗量計(jì)算TVB-N含量，單位為mg/100 g。

1.3.2.3 硫代巴比妥酸反應(yīng)物值測定

將雞胸肉和雞腿肉（去皮）部分切碎混合均勻，稱取10 g，根據(jù)Chen Xue等[17]的方法使用分光光度法測定硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值。

1.3.3 微生物計(jì)數(shù)

每種細(xì)菌計(jì)數(shù)操作按照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》進(jìn)行。菌落總數(shù)（total viable counts，TVC）和乳酸菌分別采用PCA和MRS培養(yǎng)基，分別在正常和厭氧環(huán)境下于37 ℃培養(yǎng)48 h。腸桿菌科細(xì)菌和葡萄球菌分別采用VRBGA和MSA培養(yǎng)基，在37 ℃下培養(yǎng)48 h。假單胞菌在假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)48 h[5]。結(jié)果以每克燒雞中所含的細(xì)菌總數(shù)表示（lg（CFU/g））。

1.3.4 高通量測序

1.3.4.1 樣本收集

選取Q0（初期）、Q4（中期）和Q8（末期）雞胸肉和雞腿肉（帶皮）2 g切碎混合，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4.2 DNA抽提和PCR擴(kuò)增

根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行微生物群落總DNA抽提，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量，使用超微量分光光度計(jì)測定DNA質(zhì)量濃度和純度；使用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對(duì)16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性3min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27 個(gè)循環(huán)；然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4 ℃保存。PCR反應(yīng)體系為：5×Trans Start FastPfu緩沖液4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、上游引物（5 μmol/L）0.8 μL、下游引物（5 μmol/L）0.8 μL、TransStart FastPfuDNA聚合酶0.4 μL、模板DNA 10 ng，高純水補(bǔ)足至20 μL。每個(gè)樣本3 個(gè)重復(fù)。

1.3.4.3 Illumina Miseq測序

將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用熒光計(jì)對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測定量。使用NEXTflex?Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫。具體步驟如下：接頭鏈接；使用磁珠篩選去除接頭自連片段；利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集；磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫。送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Miseq PE300平臺(tái)（Illumina公司）完成測序。

1.3.5 傳統(tǒng)培養(yǎng)微生物的分離、純化和鑒定

從1.3.3節(jié)中培養(yǎng)末期的平板中挑選典型菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，通過革蘭氏染色、顯微鏡觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)篩選出目的單菌落進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取純化菌株DNA。以提取的單菌落細(xì)菌DNA為模板，用細(xì)菌通用引物進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）有限公司測序，得到的16S rDNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索和BLAST比對(duì)。選取同源性高的相關(guān)菌株的16S rRNA序列作為參考對(duì)象，將同源性大于97%的序列歸為同一種[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

理化實(shí)驗(yàn)和微生物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)4 次平行實(shí)驗(yàn)后得到，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。SPSS 17.0和Microsoft Excel 2010軟件用于數(shù)據(jù)分析。高通量測序后，將原始測序數(shù)據(jù)按序列合并，利用QIIME軟件和FLASH功能進(jìn)行篩選，獲得有效序列。為得到每個(gè)序列信息擴(kuò)增序列變體（amplicon sequence variant，ASV）對(duì)應(yīng)的物種分類信息，采用Classify-Sklearn（Naive Bayes）、Classify-Consensus-Vsearch（Vsearch）、Classify-Consensus-Blast（Blast）對(duì)ASV代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，獲得ASV在不同分類水平的注釋信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 MAP燒雞低溫貯藏期間理化指標(biāo)的變化

2.1.1 pH值

由圖1可知，在低溫貯藏過程中，MAP燒雞pH值在貯藏前期無明顯變化，在貯藏后期（10 d）顯著下降（P＜0.05）。這可能與MAP環(huán)境中，CO2逐漸溶解在水中形成碳酸，從而降低產(chǎn)品的pH值有關(guān)[19]。同時(shí)，微生物的生長繁殖也會(huì)影響pH值變化，從樣品中分離出的彎曲乳桿菌等產(chǎn)酸微生物的大量繁殖會(huì)導(dǎo)致pH值降低[20]。貯藏前中期pH值無顯著變化與微生物數(shù)量較少有關(guān)，其分解糖類等物質(zhì)能力較低，因此pH值變化不顯著，貯藏后期微生物大量生長繁殖，消耗營養(yǎng)物質(zhì)生成乳酸、醋酸等，從而導(dǎo)致pH值下降。

圖1 MAP燒雞冷藏過程中pH值的變化Fig.1 Changes in pH during refrigerated storage of MAP braised chicken

2.1.2 TVB-N含量

如圖2所示，MAP燒雞在4 ℃貯藏期間TVB-N含量呈逐漸上升趨勢。TVB-N通常用作蛋白質(zhì)和胺降解的生物標(biāo)志物[21]，也常被用作肉制品的腐敗標(biāo)志物。燒雞經(jīng)加熱鹵制后，內(nèi)源酶已基本失活，TVB-N含量升高主要是微生物的生長繁殖導(dǎo)致。結(jié)合表1分析可知，燒雞達(dá)到貨架期終點(diǎn)（貯藏4 d）時(shí)，其TVB-N含量約為8.68 mg/100 g，隨后隨著微生物的生長繁殖，TVB-N含量快速升高。

表1 MAP燒雞貯藏過程中主要微生物數(shù)量的變化Table 1 Changes in major microorganisms in MAP braised chicken during storage lg（CFU/g）

圖2 MAP燒雞冷藏過程中TVB-N含量的變化Fig.2 Changes in TVB-N value during refrigerated storage of MAP braised chicken

2.1.3 MAP燒雞冷藏過程中TBARS值的變化

肉制品的TBARS值反映了脂肪過氧化的程度。由圖3可知，貯藏前中期TBARS值隨著貯藏時(shí)間的延長呈顯著上升趨勢（P＜0.05）；貯藏后期TBARS值不再顯著升高（P＞0.05）。值得注意的是，貯藏期間雖然TBARS值有所增加，但都維持在較低水平，表明MAP燒雞幾乎未發(fā)生氧化酸敗。結(jié)合后續(xù)對(duì)微生物生長的分析發(fā)現(xiàn)，脂肪氧化不是導(dǎo)致MAP燒雞腐敗變質(zhì)的主要因素。貯藏末期，樣品的TBARS值趨向平穩(wěn)，可能與MAP中氣體成分有關(guān)。Demirhan等[22]對(duì)MAP雞肉的研究結(jié)果表明厭氧環(huán)境明顯抑制了雞肉的脂肪氧化。Zhai Yang等[23]研究水煮鹽水鴨肉在正常和氣調(diào)貯藏條件下的貨架期，發(fā)現(xiàn)貯藏結(jié)束時(shí)MAP處理組樣品的TBARS值較低。

圖3 MAP燒雞冷藏過程中TBARS值的變化Fig.3 Changes in TBARS value during refrigerated storage of MAP braised chicken

2.2 MAP燒雞貯藏過程中微生物的變化

由表1可知，MAP燒雞貯藏過程中主要微生物呈動(dòng)態(tài)變化。貯藏0 d時(shí)TVC為3.77（lg（CFU/g）），到第4天達(dá)到5.26（lg（CFU/g）），超過GB 2726—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 熟肉制品》規(guī)定的熟肉制品可接受閾值（≤5（lg（CFU/g）））。在冷藏過程中，葡萄球菌和乳酸菌增殖較快，其次為腸桿菌，假單胞菌增殖最慢。這些結(jié)果表明，乳酸菌和葡萄球菌在新鮮燒雞中就已存在，隨著貯藏時(shí)間的延長其數(shù)量逐漸增長；至貯藏后期，葡萄球菌數(shù)量最多，其次是腸桿菌，假單胞菌數(shù)量最少。

2.3 MAP燒雞高通量測序結(jié)果

2.3.1 豐度等級(jí)曲線

豐度等級(jí)曲線可用于解釋物種豐度和群落均勻度。物種的豐富度越高，曲線在橫軸上的范圍越大；曲線越平緩，群落中物種分布越均勻[24]。由圖4可知，燒雞貯藏初期的曲線寬度最大，貯藏末期的曲線寬度最小，說明貯藏初期燒雞中微生物的豐富度很高，隨后逐漸下降。與貯藏初期燒雞相比，貯藏中期和末期燒雞樣本的曲線更陡峭，說明貯藏中期和末期燒雞中的微生物分布不均勻。貯藏末期樣品微生物物種豐富度最小[25]，分布不均勻，這同樣表明了貯藏末期只有少數(shù)細(xì)菌占據(jù)主要地位，具有生長優(yōu)勢，可能在燒雞腐敗過程中起到主要作用。

圖4 MAP燒雞貯藏過程中微生物豐度等級(jí)曲線Fig.4 Rank-abundance curves of bacterial community in MAP braised chicken during storage

2.3.2 稀釋曲線和Shannon曲線

稀釋曲線反映各樣本在不同測序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性，可以用于比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度、均一性或多樣性，也可以用于說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理[26]。從圖5可以看出，當(dāng)測序數(shù)據(jù)量大于15 000時(shí)，樣本曲線上所有點(diǎn)的斜率均趨于0，說明樣品的測序數(shù)據(jù)量科學(xué)合理。Shannon曲線趨向平坦時(shí)，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息。稀釋曲線和Shannon曲線表明，實(shí)驗(yàn)中燒雞樣品測序數(shù)據(jù)合理，測序結(jié)果真實(shí)有效。

圖5 MAP燒雞貯藏過程中微生物的稀釋曲線（A）和Shannon曲線（B）Fig.5 Rarefaction curves (A) and Shannon-Wiener curves (B) of bacterial community in MAP braised chicken during storage

2.3.3α多樣性

α多樣性主要用于研究某一環(huán)境內(nèi)（或樣本中）的群落多樣性，可獲得環(huán)境群落中物種的豐富度、多樣性等信息。Chao1指數(shù)反映群落豐富度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映群落多樣性，Coverage指數(shù)反映群落覆蓋度。由表2可知，樣本覆蓋率均為100%，表明燒雞樣品中幾乎所有細(xì)菌都可以被檢測到。MAP燒雞中細(xì)菌的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Coverage指數(shù)在貯藏0 d時(shí)最高，Simpson指數(shù)在貯藏0 d時(shí)最低；Chao1指數(shù)和Simpson指數(shù)在貯藏8 d時(shí)最低，說明MAP燒雞在貯藏初期微生物種類、多樣性和豐富性最高，隨著貯藏時(shí)間的延長，一些對(duì)冷藏環(huán)境不適應(yīng)的微生物會(huì)失去生理活性，而競爭力較強(qiáng)的微生物大量增殖，占據(jù)主導(dǎo)地位，導(dǎo)致微生物種群多樣性的下降。

表2 MAP燒雞貯藏過程中微生物種群的α多樣性指數(shù)Table 2 α-Diversity indexes of bacterial community in MAP braised chicken during storage

2.3.4 MAP燒雞低溫貯藏過程中的菌相變化

如圖6A、B所示，貯藏期間，主要菌群為厚壁菌門（Firmicutes，52.0%（相對(duì)豐度，下同））和變形菌門（Proteobacteria，40.79%），這一結(jié)果與關(guān)于肴肉的結(jié)果[27]一致。MAP燒雞貯藏初期微生物豐富度最高，其中腸桿菌科（Enterobacteriqceae，15.24%）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，13.39%）和氣單胞菌屬（Aeromonas，8.26%）占優(yōu)勢，地?zé)嵫挎邨U菌屬（Geobacillus，3.81%）、乳球菌屬（Lactococcus，2.09%）、乳桿菌屬（Lactobacillus，1.71%）和假單胞菌屬（Pseudomonas，1.48%）也占有一定比例。這些微生物天然存在于土壤和水中，并且在人體皮膚、家禽胃腸道和肉制品中也檢測到[28-29]。隨著貯藏時(shí)間的延長，燒雞中的微生物豐富度逐漸下降，到貯藏中期，魏斯氏菌屬（Weissella）成為MAP燒雞中的優(yōu)勢菌，相對(duì)豐度達(dá)到62.79%。哈夫尼亞菌肥桿菌（Hafnia-Obesumbacterium，21.24%）、腸桿菌（7.25%）、乳球菌（2.45%）和嗜冷菌（Psychrobacter，1.01%）也占一定比例。到貯藏末期，魏斯氏菌相對(duì)豐度仍為最高（52.60%），腸桿菌相對(duì)豐度從初期的15.24%上升到28.62%，明串珠菌屬（Leuconostoc）相對(duì)豐度由貯藏初期的不到1%上升到8.11%，乳球菌屬相對(duì)豐度從2.09%上升到7.95%。而不動(dòng)桿菌和假單胞菌相對(duì)豐度則不同程度降低。魏斯氏菌屬為革蘭氏陽性、兼性厭氧菌，屬于異型發(fā)酵乳酸菌，能夠?qū)е率称返母瘮∽冑|(zhì)[30]，廣泛存在于肉制品中；劉彩云等[31]研究發(fā)現(xiàn)魏斯氏菌是引起本地鹵牛肉腐敗變質(zhì)的腐敗菌之一；魏斯氏菌屬和乳桿菌屬也是MAP烤鴨中常見優(yōu)勢腐敗菌[32]。明串珠菌屬和乳球菌屬具有兼性厭氧特性，肉制品厭氧包裝條件通常有利于其生長[33]。魏斯氏菌屬、乳球菌屬和明串珠菌屬均可利用肉制品中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行代謝產(chǎn)酸，以乳酸為主，從而導(dǎo)致產(chǎn)品pH值降低。假單胞菌是一種嚴(yán)格需氧的革蘭氏陰性菌，是有氧條件下新鮮肉類和肉制品中常見的腐敗菌，在無氧環(huán)境下生長受到抑制是其相對(duì)豐度降低的主要原因[34]。從Circos圖（圖6C）可以看出，不動(dòng)桿菌屬、氣單胞菌屬和地?zé)嵫挎邨U菌屬在貯藏過程中相對(duì)豐度呈下降趨勢，推測它們來源于產(chǎn)品加工過程帶入的污染，由于不適應(yīng)MAP和低溫的貯藏環(huán)境，生長受到抑制。而魏斯氏菌屬、腸桿菌、乳球菌屬和明串珠菌的相對(duì)豐度在貯藏過程中升高，表明其適應(yīng)貯藏環(huán)境，具有生長優(yōu)勢。這幾種微生物耐高溫、高鹽，在最終產(chǎn)品中存活，具有兼性厭氧特點(diǎn)，可在MAP條件下生長繁殖，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)品變質(zhì)。它們可能來源于肉制品加工過程（如動(dòng)物屠宰、食品加工和包裝）環(huán)境。因此，食品企業(yè)需要加強(qiáng)對(duì)原料和加工溫度的控制，控制生產(chǎn)環(huán)境帶入的微生物并加強(qiáng)相關(guān)抑菌措施，以延長保質(zhì)期。

2.3.5 MAP燒雞貯藏期間微生物菌群LEfSe分析

LEfSe分析可用于發(fā)現(xiàn)兩組或多組樣本中最能解釋組間差異的物種特征。為找到組間豐度（即生物標(biāo)志物）有顯著差異的物種，對(duì)不同貯藏時(shí)期樣品之間的微生物進(jìn)行LEfSe分析（圖7）。MAP燒雞在貯藏初期微生物豐富度最高，多種微生物在貯藏初期富集；明串珠菌科魏斯氏菌屬在貯藏中期顯著富集；桿菌綱乳桿菌科在貯藏末期顯著富集。腸桿菌科哈夫尼亞肥桿菌屬和乳球菌等在貯藏期間沒有顯著差異。

圖7 MAP燒雞貯藏期間微生物菌群LEfSe分析Fig.7 LEfSe analysis of bacterial community in MAP braised chicken during storage

2.4 傳統(tǒng)微生物的分離純化鑒定結(jié)果

16S rDNA全長擴(kuò)增及測序比對(duì)結(jié)果見表3。從MAP燒雞中分離得到彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）、哈夫尼菌屬（Hafniasp.）、腸桿菌（Enterobactersp.）和液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens）。大量研究表明，乳酸菌是低溫肉制品在冷藏過程中的腐敗菌。燒雞的主要腐敗菌為乳酸菌和假單胞菌[35]。乳酸菌和腸桿菌是熏培根的主要腐敗菌[36]。乳酸菌是革蘭氏陽性菌，在低溫肉制品中常分離出的主要乳酸菌有清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌、明串珠菌、肉明串珠菌、腸系膜明串珠菌和綠色魏斯氏菌。芽孢桿菌和腸桿菌在土壤、水、空氣以及動(dòng)物腸道中都有廣泛分布[37]，它們對(duì)溫度和養(yǎng)分的要求較低，能在低溫、高鹽環(huán)境下生存，因此可以在MAP燒雞低溫貯藏期間生長繁殖。芽孢桿菌在產(chǎn)品鹵制過程中受高溫刺激可形成芽孢進(jìn)入休眠狀態(tài)，在適宜環(huán)境條件下會(huì)重新恢復(fù)活性，在產(chǎn)品中生長繁殖[38]。腸桿菌在鹵制過程中很容易被殺死，但MAP產(chǎn)品在包裝前后容易受二次操作的污染而引入腸桿菌。乳酸菌、芽孢桿菌和腸桿菌這3 種腐敗菌可在厭氧條件下繁殖，并能發(fā)酵產(chǎn)酸。本實(shí)驗(yàn)中燒雞在MAP條件（25% CO2/75% N2）下冷藏，腐敗后產(chǎn)品出現(xiàn)表面發(fā)黏、產(chǎn)酸的現(xiàn)象，結(jié)合前人的研究，乳酸菌、芽孢桿菌和腸桿菌這3 種腐敗菌可能是使燒雞在MAP條件下產(chǎn)生腐敗的主要原因。

表3 傳統(tǒng)分離菌落16S rDNA鑒定結(jié)果Table 3 Results of 16S rDNA identification of traditional colony isolates

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究MAP燒雞冷藏期間理化特性、微生物群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。TVB-N含量和菌落總數(shù)等指標(biāo)結(jié)果表明，燒雞在貯藏第4天微生物超標(biāo)，到貯藏末期燒雞已經(jīng)腐敗。乳酸菌在貯藏初期就已大量存在，來自肉制品加工過程接觸的環(huán)境。TBARS值在貯藏末期趨向平穩(wěn)，與MAP中氣體成分有關(guān)。魏斯氏菌屬、腸桿菌、乳球菌屬和氣單胞菌屬的相對(duì)豐度在貯藏期間逐漸增加，具有生長優(yōu)勢。在MAP燒雞中分離鑒定出6 株腐敗菌，分別為彎曲乳桿菌、蠟狀芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌、液化沙雷氏菌、哈夫尼亞菌和大腸桿菌，這些腐敗菌可在厭氧條件下繁殖，是使燒雞在MAP條件下產(chǎn)生腐敗的主要原因。本研究有關(guān)MAP燒雞微生物群落多樣性和動(dòng)態(tài)變化的結(jié)果可以為MAP燒雞腐敗菌的控制提供理論參考。