劉 勝，趙夢圓，金 巍，段長恩，可 鈺

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普通外科,河南 衛(wèi)輝 453100;2.河南醫(yī)藥健康技師學院,河南 開封 475006;3.鄭州大學藥學院,河南 鄭州 450001)

胰腺癌是最常見的消化系統(tǒng)癌癥之一,在發(fā)達國家和發(fā)展中國家均呈現(xiàn)發(fā)病率和病死率雙高的態(tài)勢[1]。胰腺癌的特點是解剖結構隱蔽,生物學侵襲性強,對常規(guī)治療藥物易產(chǎn)生耐藥性[2]。胰腺癌的治療選擇非常有限,只有不到20%的胰腺癌患者被診斷為可切除或潛在可治愈。胰腺癌在早期階段難以發(fā)現(xiàn),大多數(shù)胰腺癌患者在發(fā)現(xiàn)癥狀時已屬晚期,預后較差[3]。

冬凌草是河南省優(yōu)勢資源,其抗腫瘤作用是目前國內(nèi)外研究的熱點之一。冬凌草的化學成分主要為單萜、二萜、三萜等萜類化合物,同時還有揮發(fā)油、甾體、黃酮、生物堿等[4],其中二萜類成分是冬凌草的主要抗腫瘤活性成分[5]。目前,各學者對冬凌草甲素的研究最為普遍和全面。冬凌草甲素是一種四環(huán)二萜類化合物,可抑制胰腺癌細胞增殖,抑制胰腺癌細胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成,以及誘導胰腺癌細胞凋亡[6]。濟源冬凌草素(Jiyuan oridonin A,JOA)為本課題組首次從濟源冬凌草中分離得到的對映-貝殼杉烯型二萜,其具有較冬凌草甲素更為良好的體內(nèi)外抗腫瘤細胞增殖活性,且能夠升高細胞內(nèi)活性氧水平和抑制鐵死亡[7]。本研究旨在探討對映-貝殼杉烯型二萜類化合物 J32對胰腺癌SW1990細胞株的作用及機制,以期為胰腺癌的基礎和臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑與儀器

人胰腺癌細胞SW1990購自武漢普諾賽生命科技有限公司;化合物J32是本課題組前期以JOA為母核合成的全新結構化合物,達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbeco′s modified Eagle′s medium,DMEM)、結晶紫染色液、活性氧檢測試劑盒、二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司,蛋白酶抑制劑購自美國Biamake 公司,放射免疫沉淀(radio-immunoprecipitation,RIPA)裂解液、DNA損傷檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司,吐溫-20購自北京博奧拓達科技有限公司,兔抗人單克隆抗體B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein,Bax)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、β-actin、磷酸化H2組蛋白家族成員X(phosphorylated H2A histone family member X,γ-H2AX)、共濟失調(diào)毛細血管擴張和Rad3相關蛋白(ataxia telangiectasia and Rad3 related protein,ATR)、細胞周期檢查點激酶1(checkpoint kinase 1,Chk1)、磷酸化p53(phospho-p53,p-p53)、caspase-3、細胞周期素D1(Cyclin D1)購自武漢三鷹生物技術有限公司;CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司,穩(wěn)壓恒流電泳儀購自北京六一實驗儀器廠,酶標儀購自美國寶特有限公司,光學顯微鏡購自廈門麥克奧迪公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組

將SW1990細胞置于直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng),待細胞融合度達到80%～90%時,用胰蛋白酶消化細胞,以1×1010L-1接種于5個培養(yǎng)皿中,每個培養(yǎng)皿中加入10 mL含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。將細胞隨機分為對照組、0.5 μmol·L-1J32組、1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組、4.0 μmol·L-1J32組,24 h后棄去舊培養(yǎng)液,并分別加入含終濃度0.0、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol·L-1J32的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集各組細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞劃痕試驗檢測細胞遷移能力

取對照組、1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組、 4.0 μmol·L-1J32組細胞,用胰蛋白酶消化,然后接種到6孔板中,每組設3個復孔,置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,棄去培養(yǎng)液,用100 μL槍頭的尖端垂直劃痕,用1 mL 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solation,PBS)清洗后,加入含不同濃度J32的培養(yǎng)基,置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0、24、48 h時,置于顯微鏡下對各孔劃線位置拍照。應用 Image J 軟件測量圖中空白區(qū)域面積,并計算劃痕愈合率,劃痕愈合率 = (0 h 空白面積-24 h或48 h 空白面積) /0 h 空白面積 ×100%,劃痕愈合率越高表示細胞遷移能力越強。實驗重復 3 次,取均值。

1.2.3 單克隆形成試驗檢測細胞增殖能力

取對照組、0.5 μmol·L-1J32組、1.0 μmol·L-1J32組細胞,以每孔1×104個細胞接種到6孔板中,置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,棄去上清,沿孔壁分別加入含不同濃度J32的培養(yǎng)基。再將6孔板放入細胞培養(yǎng)箱中,每隔1～2 d更換一次培養(yǎng)液。當細胞呈現(xiàn)肉眼可見的克隆時,棄去上清,用PBS清洗3次,加入多聚甲醛固定細胞,20 min后,棄去上清,PBS清洗3次,加入結晶紫染液染色30 min,緩慢洗去染液,靜置晾干,然后計數(shù)克隆形成數(shù),并計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?克隆形成數(shù)/接種細胞數(shù)×100%,克隆形成率越低表示J32對細胞增殖的抑制作用越強。實驗重復3次,取均值。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

取對照組、1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組、 4.0 μmol·L-1J32組細胞,用胰蛋白酶消化,以每孔1×105個細胞接種于6孔板中,置于 37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,棄去上清,沿孔壁分別加入含不同濃度J32的培養(yǎng)基。將6孔板再次放入培養(yǎng)箱中,24 h后,將每個孔內(nèi)的懸浮細胞以及胰蛋白酶消化得到的細胞合并在同一EP管中,1 000 r·min-1離心 5 min,收集細胞沉淀,用Binding Buffer將細胞沉淀吹打均勻,然后加入2 μL人膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-fluorescein isothiocyanate,Annexin V-FITC)及2 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色液,渦旋混勻,放置于冰盒中,避光反應5～15 min,最后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次,取均值。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞中活性氧水平

取對照組、1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組、 4.0 μmol·L-1J32組細胞,用胰蛋白酶消化,然后以每孔6×104個細胞接種于6孔板中,于對數(shù)生長期時舍棄舊培養(yǎng)液,沿孔壁分別加入含不同濃度J32的培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中孵育 24 h 后,加入活性氧熒光探針(用無血清培養(yǎng)液稀釋2,7-二氯熒光素二乙酸酯,終濃度為10 μmol·L-1),置于細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min,用無血清培養(yǎng)液清洗細胞后,立即用流式細胞儀檢測細胞平均熒光強度,細胞平均熒光強度越高表示細胞中活性氧水平越高。實驗重復3次,取均值。

1.2.6 γ-H2AX免疫熒光法檢測細胞DNA損傷程度

取對照組、1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組細胞,用胰蛋白酶消化,以每孔6×103個細胞接種于96孔板中,置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后,更換含不同濃度J32的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,吸除培養(yǎng)液,PBS洗滌1次,每孔加入100 μL固定液,固定 5～15 min 后吸除固定液,洗滌液洗滌3次,每次 3～5 min。 每孔加入100 μL免疫染色封閉液,室溫封閉10～20 min。吸除免疫染色封閉液,每孔加入50 μL γ-H2AX兔單抗,室溫孵育1 h后吸出,用洗滌液洗滌3次,每次5～10 min,然后加入抗兔488,室溫孵育1 h后用洗滌液洗滌2次,加入細胞核染色液4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)室溫染色5 min左右。吸除細胞核染色液,洗滌液洗滌3次,每次3～5 min,使用熒光顯微鏡直接進行觀察和拍照,γ-H2AX被染成綠色熒光,細胞核被DAPI染成藍色熒光。應用Image J軟件分析熒光強度值,綠色熒光強度值越高表示細胞的DNA損傷程度越高。實驗重復3次,取均值。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞周期

取對照組、1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組細胞,用胰蛋白酶消化,以每孔2×105個細胞接種于6孔板中,37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后,更換為含不同濃度J32的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用預冷的PBS清洗細胞,胰蛋白酶消化,1 200 r·min-1離心5 min,收集細胞沉淀,用預冷PBS洗滌細胞2次,用200 μL PBS重懸細胞,加入720 μL 體積分數(shù)95%乙醇吹打混勻,4 ℃下固定8 h,2 000 r·min-1離心5 min,再用1 mL預冷PBS洗滌2次,加入 400 μL PI染色液重懸細胞,用流式細胞儀檢測細胞周期。實驗重復3次,取均值。

1.2.8 Western blot法檢測ATR-Chk1-p53-CyclinD1通路及凋亡相關蛋白相對表達量

取對照組、1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組、 4.0 μmol·L-1J32組細胞, 用胰蛋白酶消化,以每個培養(yǎng)皿2×105個細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中,然后置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h,棄去上清,更換為含不同濃度J32的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用胰蛋白酶消化,收集細胞至離心管中,加入RIPA裂解液,混合均勻后,于冰盒上裂解30 min, 4 ℃下25 000 r·min-1離心15 min,將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中,用二喹啉甲酸法進行蛋白定量,煮沸10 min使蛋白變性,取 30 μg 蛋白進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶封閉,加入ATR、磷酸化ATR(phospho-ATR,p-ATR)、Chk1、p-p53、CyclinD1、Bax、caspase-3、Bcl-2、β-actin一抗孵育過夜、洗膜,二抗孵育、洗膜后,顯色、曝光。應用Image J軟件分析條帶灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。實驗重復3次,取均值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 對照組、1.0 μmol·L-1 J32組、2.0 μmol·L-1 J32組和4.0 μmol·L-1 J32組細胞遷移能力比較

培養(yǎng)24、48 h 時,1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組和4.0 μmol·L-1J32組細胞的遷移能力均顯著低于對照組,2.0 μmol·L-1J32組和4.0 μmol·L-1J32組細胞的遷移能力均顯著低于1.0 μmol·L-1J32組,4.0 μmol·L-1J32組細胞的遷移能力顯著低于2.0 μmol·L-1J32組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05) 。結果見圖1和表1。

表1 對照組、1.0 μmol·L-1 J32組、2.0 μmol·L-1 J32組、4.0 μmol·L-1 J32組細胞遷移能力比較Tab.1 Comparison of the migration ability of cells among the control group,1.0 μmol·L-1 J32 group,2.0 μmol·L-1 J32 group and 4.0 μmol·L-1 J32 group

A:對照組;B:1.0 μmol·L-1 J32組;C:2.0 μmol·L-1 J32組;D:4.0 μmol·L-1 J32組。圖1 對照組、1.0 μmol·L-1 J32組、2.0 μmol·L-1 J32組、4.0 μmol·L-1 J32組細胞遷移情況Fig.1 Migration of cells in the control group,1.0 μmol·L-1 J32 group,2.0 μmol·L-1 J32 group and 4.0 μmol·L-1 J32 group

2.2 對照組、0.5 μmol·L-1 J32組和1.0 μmol·L-1 J32組細胞增殖能力比較

對照組、0.5 μmol·L-1J32組、1.0 μmol·L-1J32組細胞克隆形成率分別為(72.04±8.17)%、(54.62±7.31)%、(8.39±1.72)%。0.5 μmol·L-1J32組、1.0 μmol·L-1J32組細胞的增殖能力顯著低于對照組,1.0 μmol·L-1J32組細胞的增殖能力顯著低于0.5 μmol·L-1J32組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 對照組、1.0 μmol·L-1 J32組、2.0 μmol·L-1 J32組和4.0 μmol·L-1 J32組細胞凋亡情況比較

對照組、1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組、4.0 μmol·L-1J32組細胞的凋亡率分別為(6.78±0.47)%、(17.50±1.05)%、(49.40±3.21)%、(69.70±2.42)%。 1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組、 4.0 μmol·L-1J32組細胞的凋亡率顯著高于對照組,2.0 μmol·L-1J32組、 4.0 μmol·L-1J32組細胞的凋亡率顯著高于1.0 μmol·L-1J32組,4.0 μmol·L-1J32組細胞的凋亡率顯著高于2.0 μmol·L-1J32組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果見圖2。

A:對照組;B:1.0 μmol·L-1 J32組;C:2.0 μmol·L-1 J32組;D:4.0 μmol·L-1 J32組。圖2 對照組、1.0 μmol·L-1 J32組、2.0 μmol·L-1 J32組、4.0 μmol·L-1 J32組細胞凋亡情況Fig.2 Cell apoptosis in the control group,1.0 μmol·L-1 J32 group,2.0 μmol·L-1 J32 group and 4.0 μmol·L-1 J32 group

2.4 對照組、1.0 μmol·L-1 J32組、2.0 μmol·L-1 J32組和4.0 μmol·L-1 J32組細胞中活性氧水平比較

對照組、1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組、4.0 μmol·L-1J32組細胞平均熒光強度分別為2.19±0.21、4.31±0.89、7.74±1.27、45.40±3.24。1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組、 4.0 μmol·L-1J32組細胞的活性氧水平顯著高于對照組,2.0 μmol·L-1J32組、4.0 μmol·L-1J32組細胞的活性氧水平顯著高于1.0 μmol·L-1J32組,4.0 μmol·L-1J32組細胞的活性氧水平顯著高于2.0 μmol·L-1J32組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.5 對照組、1.0 μmol·L-1 J32組和 2.0 μmol·L-1 J32組細胞DNA損傷程度比較

對照組、1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組細胞的綠色熒光強度值分別為13.72±1.09、22.28±2.15、29.25±1.48。1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組細胞的DNA損傷程度顯著高于對照組,2.0 μmol·L-1J32組細胞的DNA損傷程度顯著高于1.0 μmol·L-1J32組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結果見圖3。

2.6 對照組、1.0 μmol·L-1 J32組和2.0 μmol·L-1 J32組細胞周期比較

對照組、1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組細胞中G1/S期細胞占比分別為(23.4±1.16)%、(46.4±2.02)%、(54.3±0.69)%。1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組細胞中G1/S期細胞占比顯著高于對照組,2.0 μmol·L-1J32組細胞中G1/S期細胞占比顯著高于1.0 μmol·L-1J32組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.7 對照組、1.0 μmol·L-1 J32組、2.0 μmol·L-1 J32組和4.0 μmol·L-1 J32組細胞中ATR-Chk1-p53-Cyclin D1通路及凋亡相關蛋白相對表達量比較

對照組、1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組、4.0 μmol·L-1J32組細胞中隨著J32濃度的增加,p-ATR/ATR值及p-p53蛋白相對表達量呈升高趨勢(F=25.534、3.970,P<0.05),Chk1、Cyclin D1蛋白相對表達量呈降低趨勢(F=19.532、0.485,P<0.05)。1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組、4.0 μmol·L-1J32組細胞中p-ATR/ATR值及p-p53蛋白相對表達量顯著高于對照組,2.0 μmol·L-1J32組、4.0 μmol·L-1J32組細胞中p-ATR/ATR值及p-p53蛋白相對表達量顯著高于1.0 μmol·L-1J32組,4.0 μmol·L-1J32組細胞中p-ATR/ATR值及p-p53蛋白相對表達量顯著高于2.0 μmol·L-1J32組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組、4.0 μmol·L-1J32組細胞中Chk1蛋白相對表達量顯著低于對照組,2.0 μmol·L-1J32組細胞中Chk1蛋白相對表達量顯著高于1.0 μmol·L-1J32組、4.0 μmol·L-1J32組,4.0 μmol·L-1J32組細胞中Chk1蛋白相對表達量顯著低于1.0 μmol·L-1J32組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組、4.0 μmol·L-1J32組細胞中Cyclin D1蛋白相對表達量顯著低于對照組,2.0 μmol·L-1J32組、4.0 μmol·L-1J32組細胞中Cyclin D1蛋白相對表達量顯著低于1.0 μmol·L-1J32組,4.0 μmol·L-1J32組細胞中Cyclin D1蛋白相對表達量顯著低于2.0 μmol·L-1J32組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

對照組、1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組、4.0 μmol·L-1J32組細胞中隨著J32濃度的增加,促凋亡蛋白caspase-3、Bax的表達呈升高趨勢(F=0.219、4.314,P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表達呈下降趨勢(F=0.324,P<0.05)。1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組、4.0 μmol·L-1J32組中Bax蛋白相對表達量顯著高于對照組,2.0 μmol·L-1J32組、4.0 μmol·L-1J32細胞組中Bax蛋白相對表達量顯著高于1.0 μmol·L-1J32組,4 μmol·L-1J32組細胞中Bax蛋白相對表達量顯著高于2.0 μmol·L-1J32組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組、4.0 μmol·L-1J32組細胞中caspase-3蛋白相對表達量顯著高于對照組,2 μmol·L-1J32組細胞中caspase-3蛋白相對表達量顯著低于1.0 μmol·L-1J32組、4.0 μmol·L-1J32組,4.0 μmol·L-1J32組細胞中caspase-3蛋白相對表達量顯著高于1.0 μmol·L-1J32組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。2.0 μmol·L-1J32組、4.0 μmol·L-1J32組細胞中Bcl-2蛋白相對表達量顯著低于對照組、1.0 μmol·L-1J32組,4.0 μmol·L-1J32組細胞中Bcl-2蛋白相對表達量顯著低于2.0 μmol·L-1J32組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);對照組與 1.0 μmol·L-1J32組細胞中Bcl-2蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見圖4和表2。

表2 對照組、1.0 μmol·L-1 J32組、2.0 μmol·L-1 J32組、4.0 μmol·L-1 J32組細胞中ATR-Chk1-p53-Cyclin D1通路及凋亡相關蛋白相對表達量比較Tab.2 Comparison of relative expression levels of ATR-Chk1-p53-Cyclin D1 pathway and apoptosis related proteins among the control group,1.0 μmol·L-1 J32 group,2.0 μmol·L-1 J32 group and 4.0 μmol·L-1 J32 group

A:對照組;B:1.0 μmol·L-1 J32組;C:2.0 μmol·L-1 J32組;D:4.0 μmol·L-1 J32組。圖4 對照組、1.0 μmol·L-1 J32組、2.0 μmol·L-1 J32組、4.0 μmol·L-1 J32組細胞中ATR-Chk1-p53-Cyclin D1通路及凋亡相關蛋白表達Fig.4 Expression of ATR-Chk1-p53-Cyclin D1 pathway and apoptosis related proteins in the control group,1.0 μmol·L-1 J32 group,2.0 μmol·L-1 J32 group and 4.0 μmol·L-1 J32 group

3 討論

惡性腫瘤已成為全球第二大死因,但目前尚無有效的根治手段,胰腺癌的治療更是臨床中的難題[8-9]。中草藥是天然的藥物寶庫,多種中草藥在腫瘤治療中具有顯著的療效。冬凌草是近年來天然抗腫瘤植物研究的熱點之一,對映-貝殼杉烯型二萜是冬凌草中重要的抗腫瘤活性成分,其不僅具有良好的抗腫瘤作用,還具有抗炎、抗氧化等作用[10]。本課題組對冬凌草及其對映-貝殼杉烷型二萜化合物進行了長期研究,合成了多個對映-貝殼杉烷型二萜類化合物[11-13]。 然而,對映-貝殼杉烷型二萜類化合物對胰腺癌的作用及機制尚不明確。

本研究結果顯示,培養(yǎng)24、48 h 時,1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組、4.0 μmol·L-1J32組細胞的遷移能力顯著低于對照組,2.0 μmol·L-1J32組、4.0 μmol·L-1J32組細胞的遷移能力均顯著低于1.0 μmol·L-1J32組,4.0 μmol·L-1J32組細胞的遷移能力顯著低于2.0 μmol·L-1J32組,表明J32可抑制胰腺癌SW1990細胞的遷移能力,且這種抑制作用呈明顯的濃度依賴性。本研究結果顯示,0.5 μmol·L-1J32組、1.0 μmol·L-1J32組細胞的增殖能力顯著低于對照組,1.0 μmol·L-1J32組細胞的增殖能力顯著低于0.5 μmol·L-1J32組,表明J32對胰腺癌細胞的增殖能力具有抑制作用,并表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。

本研究結果顯示,1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組、 4.0 μmol·L-1J32組細胞的凋亡率顯著高于對照組, 2.0 μmol·L-1J32組、 4.0 μmol·L-1J32組細胞的凋亡率顯著高于1.0 μmol·L-1J32組,4.0 μmol·L-1J32組細胞的凋亡率顯著高于2.0 μmol·L-1J32組,表明J32可呈濃度依賴性地促進胰腺癌細胞凋亡。

機體在某些應激條件下,尤其是暴露于環(huán)境氧化劑和某些導致氧化應激的藥物中,可能會導致產(chǎn)生過量活性氧。過量的活性氧會破壞DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等細胞分子,最終導致細胞死亡。本研究結果顯示,1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組、 4.0 μmol·L-1J32組細胞的活性氧水平顯著高于對照組,2.0 μmol·L-1J32組、 4.0 μmol·L-1J32組細胞的活性氧水平顯著高于1.0 μmol·L-1J32組,4.0 μmol·L-1J32組細胞的活性氧水平顯著高于2.0 μmol·L-1J32組,說明J32可呈濃度依賴性地提高胰腺癌細胞的活性氧水平,進而促進細胞DNA損傷及細胞凋亡的發(fā)生。

DNA的完整性對細胞至關重要,DNA發(fā)生損傷可能使細胞喪失某些生物功能甚至死亡。本研究結果顯示,1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組細胞的DNA損傷程度顯著高于對照組,2.0 μmol·L-1J32組細胞的DNA損傷程度顯著高于1.0 μmol·L-1J32組,說明J32可呈濃度依賴性地導致胰腺癌細胞核內(nèi)發(fā)生DNA損傷。此外,本研究結果顯示,1.0 μmol·L-1J32組、2.0 μmol·L-1J32組細胞中G1/S期細胞占比顯著高于對照組,2.0 μmol·L-1J32組細胞中G1/S期細胞占比顯著高于1.0 μmol·L-1J32組,說明J32可將細胞周期阻滯于G1/S期。原因可能為,DNA損傷引起p53依賴的細胞周期阻滯和細胞凋亡[14],DNA損傷可誘導p53激活,p53激活可促進細胞周期調(diào)節(jié)因子轉(zhuǎn)錄,使細胞周期停滯在G1檢查點,從而引起細胞周期停滯和凋亡[15]。 p53在DNA損傷反應(DNA damage response,DDR)中發(fā)揮重要作用,可協(xié)調(diào)多種DDR通路,是DDR和腫瘤抑制之間的關鍵環(huán)節(jié)[16-17]。p53相關信號通路是腫瘤的經(jīng)典信號通路,有研究發(fā)現(xiàn),四環(huán)二萜類代表化合物冬凌草甲素可通過調(diào)節(jié)此通路相關蛋白的表達來發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖或促進其凋亡的作用[18-19]?；诖?本研究探討了J32作用于胰腺癌細胞后,p53相關的ATR-Chk1-p53-Cyclin D1通路中ATR、Chk1、p-p53、Cyclin D1蛋白、促凋亡蛋白(Bax、caspase-3)以及抗凋亡蛋白(Bcl-2)的表達變化情況。結果表明,隨著J32濃度的增加,p-ATR/ATR值及p-p53蛋白表達呈升高趨勢,Chk1、Cyclin D1蛋白表達呈降低趨勢;促凋亡蛋白caspase-3、Bax的表達呈升高趨勢,抗凋亡蛋白Bcl-2表達呈下降趨勢。進一步驗證了J32可促進胰腺癌細胞凋亡,此外, J32對胰腺癌細胞生物學過程的影響可能與ATR-Chk1-p53-Cyclin D1通路有關。

4 結論

對映-貝殼杉烯型二萜類化合物J32可以呈濃度依賴性地抑制胰腺癌SW1990細胞的遷移和增殖、促進細胞凋亡及細胞內(nèi)活性氧水平,促進細胞發(fā)生DNA損傷及細胞周期阻滯,其作用機制可能與ATR-Chk1-p53-Cyclin D1通路有關。本研究可為進一步研究對映-貝殼杉烯型二萜類化合物的抗腫瘤作用機制及其作用靶點提供線索和思路。