孫麗，邢海艷，吳義春，趙燕，周義國，孟慶順

（淮安市食品藥品檢驗所，江蘇淮安 223000）

瘦肉精是一類藥物的統稱，能夠抑制動物脂肪生成，促進瘦肉生長的物質都可以稱為瘦肉精。能夠實現此類功能的物質主要是一類叫做β-受體激動劑(也稱β-興奮劑)的藥物，其中較常見的有鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等。β-受體激動劑類藥物進入牲畜體內后能夠改變養(yǎng)分的代謝途徑，促進動物肌肉生長，尤其是促進骨路肌蛋白瘦肉質的合成，加速脂肪的轉化和分解，提高牲畜的瘦肉率[1]。但由于瘦肉精在動物體內吸收快，代謝慢，人食用瘦肉精殘留量較高的動物產品后，會出現嚴重的不良反應，如呼吸困難、心跳加速、頭暈頭疼等癥狀，嚴重時能引起心臟病、高血壓等疾病[2?4]。目前我國瘦肉精監(jiān)管的對象主要是飼料和豬肉，牛羊肉由于其檢測技術的相對缺乏，存在較高的瘦肉精檢出風險[5?6]。隨著我國居民肉類消費結構逐漸升級，以及受非洲豬瘟的影響，牛羊肉消費需求不斷增加，因此為了確保牛羊肉的食品質量與安全，亟需開展測定其瘦肉精的方法研究。

當前瘦肉精的測定方法主要有膠體金試紙條法[7?8]、酶聯免疫法[9]、氣相色譜-質譜聯用法[10?11]和液相色譜-質譜聯用法[12?14]等。膠體金試紙條法和酶聯免疫法是基于抗原-抗體特異性結合的快篩方法，此方法具有操作簡便、快捷、特異性強等特點，但存在難以一次分析多個化合物且會出現一定假陽性的缺點。氣相色譜-質譜聯用法需要復雜的衍生化步驟以增強目標物的揮發(fā)性，且分析物不穩(wěn)定、分析耗時較長。液相色譜-質譜聯用法以其高靈敏度和專一性測定目標物，近幾年來在瘦肉精檢測方法研究中應用越來越多。筆者建立了一種準確、高效、簡單的測定牛羊肉中克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺3種瘦肉精含量的方法，為食品安全監(jiān)測提供了技術手段。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯質譜儀：AB QQQ4000+型，美國AB SCIEX公司。

電子天平：XS205DU 型，感量為0.01 mg，梅特勒托利多科技(中國)有限公司。

高速冷凍離心機：MULTIFUGE-X1R 型，美國賽默飛世爾科技公司。

超聲波清洗器：KH7200DE型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

超純水機：GenPure Pro 型，美國賽默飛世爾科技公司。

克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇混合標準溶液：各組分質量濃度均100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司。

克倫特羅-D9、沙丁胺醇-D3 內標溶液：質量濃度均為100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司。

甲酸：色譜純，上海易恩化學技術有限公司。

乙酸銨：色譜級，上海麥克林生化科技股份有限公司。

獸藥殘留專用提取包：日本島津公司。

獸藥殘留專用凈化管：日本島津公司。

牛羊肉樣品：市售。

實驗用氣：自制高純氮氣，純度大于99.9%。

1.2 溶液配制

克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺混合標準儲備液：各組分質量濃度均為10 μg/mL，準確移取克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺混合標準溶液1.0 mL至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至標線。

克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺混合標準中間液：各組分質量濃度均為1 μg/mL，準確移取克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺混合標準儲備液1.0 mL至10 mL容量瓶中，以甲醇稀釋并定容至標線。

混合內標儲備液：克倫特羅-D9、沙丁胺醇-D3質量濃度均為10 μg/mL，準確移取克倫特羅-D9 內標溶液1.0 mL、沙丁胺醇-D3 內標溶液1.0 mL 至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至標線。

混合內標中間液：克倫特羅-D9、沙丁胺醇-D3質量濃度均為1 μg/mL，準確移取混合內標儲備液1 mL 至10 mL 容量瓶中，以甲醇稀釋并定容至標線。

克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺系列混合標準工作溶液：分別移取克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺混合標準中間液0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.04 mL，加入混合內標中間液100 μL 至10 mL 容量瓶中，以空白基質溶液(陰性樣品溶液)定容至標線，得3 種組分質量濃度均分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 ng/mL 的系列混合標準工作溶液，其中內標物質量濃度均為10 ng/mL。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 液相色譜儀

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?BEH C18柱[100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，沃特世科技(上海)有限公司]；流動相：A相為0.1%(體積分數，下同)甲酸溶液(含5 mmol/L 乙酸銨)，B 相為甲醇；流動相流量：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣體積：2 μL；淋洗方式：梯度淋洗，淋洗程序見表1。

表1 流動相梯度淋洗程序

1.3.2 質譜儀

離子源：電噴霧電離源(ESI)；檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM)；碰撞氣壓力：48.3 kPa；氣簾氣壓力：241.3 kPa；霧化氣壓力：413.7 kPa；輔助加熱氣壓力：379.2 kPa；霧化電壓：5 500 V；離子傳輸溫度：550 ℃；克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺及內標物克倫特羅-D9、沙丁胺醇-D3的質譜參數見表2。

表2 克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺及內標物質譜參數

1.4 樣品預處理

稱取5 g 均勻樣品，置于50 mL 離心管中，加入50 μL 混合內標中間液，然后加入5 mL 5%(體積分數)甲酸乙腈溶液，均質1 min，加入獸藥殘留專用提取包，快速振搖渦旋提取2 min，以10 000 r/min轉速離心5 min。取離心后的樣品上清液加入到凈化管中，渦旋2 min，以13 000 r/min 轉速離心5 min。取上清液作為樣品溶液。

1.5 實驗步驟

在1.3儀器工作條件下，對克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺系列混合標準工作溶液和樣品溶液進行測定，同時做空白試驗。以克倫特羅、沙丁胺醇特征離子色譜峰的峰面積與對應內標物特征離子色譜峰的峰面積比值為縱坐標，相應的克倫特羅、沙丁胺醇質量濃度為橫坐標，繪制標準工作曲線，采用內標法定量；以萊克多巴胺特征離子色譜峰的峰面積為縱坐標，相應的萊克多巴胺質量濃度為橫坐標，繪制標準工作曲線，采用外標法定量。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

分別取克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺混合標準中間液、混合內標中間液進行質譜分析，確定最佳的定量離子對、定性離子對、去簇電壓和碰撞電壓，優(yōu)化結果見1.3.2。

2.2 液相條件的優(yōu)化

分別以純水、0.1%甲酸溶液、5 mmol 乙酸銨溶液、0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L 乙酸銨)為水相，以甲醇和乙腈為有機相，考察了不同流動相組合時目標物的色譜圖，各目標物色譜峰特點見表3。

表3 不同流動相的出峰情況

結果表明，水相流動相選擇0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L 乙酸銨)，有機相選擇甲醇時，3 種瘦肉精的峰形對稱，無拖尾，響應值高，線性關系好，流動相中添加甲酸可提高目標化合物的離子化效率，添加乙酸銨可調節(jié)流動相pH，使目標化合物色譜峰形對稱。因此選擇0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L 乙酸銨)與甲醇作為流動相，色譜圖見圖1和圖2。

圖1 克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺混合標準溶液的總離子色譜圖

圖2 混合內標溶液的總離子色譜圖

2.3 色譜柱的選擇

由于克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺均屬于極性化合物，常用C18色譜柱進行色譜分離。分別使用Waters ACQUITY UPLC?BEH C18柱[100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，沃 特 世 科 技(上 海)有 限 公 司]、Phenomenex KINEVEXR C18柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，廣州菲羅門科學儀器有限公司)、Thermo AcclaimTMTrinityTMB1 C18柱(100 mm ×2.1 mm，3 μm，美國賽默飛世爾科技公司)、Agilent Poroshell 120 EC-C18柱[100 mm ×3 mm，2.7 μm，安捷倫科技(中國)有限公司]4 種型號色譜柱對3 種瘦肉精的分離效果進行考察，結果發(fā)現，Waters ACQUITY UPLC?BEH C18柱分離效果最好，峰形對稱，無拖尾，因此選擇Waters ACQUITY UPLC?BEH C18柱。

2.4 線性范圍和定量限

按1.5 實驗步驟分別測定克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺系列混合標準工作溶液并繪制標準曲線，計算線性方程和相關系數。以空白樣品（加標準溶液）的3倍信噪比計算檢出限，以10倍信噪比計算定量限，結果見表4。結果表明，3 種瘦肉精質量濃度在0.1～4.0 ng/mL 范圍內呈線性關系，線性相關系數均大于0.998，檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.2 μg/kg。

表4 3種瘦肉精的線性方程、相關系數和檢出限

2.5 樣品加標回收試驗

向牛羊肉陰性樣品中添加克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺混合標準中間液，使樣品中3 種目標物質量分數均分別為0.2、0.4、2.0 μg/kg，每個點平行制備6 份，同時做空白試驗，按照1.5 實驗步驟處理樣品，測定樣品中克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺，結果見表5。

表5 加標回收試驗結果

由表5 可知，3 種瘦肉精平均回收率為65.3%～105.8%，相對標準偏差(RSD)為0.95%～9.65%(n=6)，空白試驗中未檢出克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺，表明該方法具有良好的準確度和精密度。

2.6 方法比對

對從市場抽檢的103 批牛羊肉樣品檢測，代表性的羊排樣品色譜圖如圖3，在這些樣品檢測過程中未發(fā)現有干擾目標物測定的雜質峰。103批牛羊肉的檢測結果見表6，其中3批羊肉、1批羊排和1批牛肉檢出克倫特羅，與按標準方法[15]處理相比，結果誤差均在10%之內，滿足檢測需求。

圖3 羊排樣品總離子色譜圖

表6 牛羊肉中瘦肉精含量檢測結果比較 μg/kg

3 結語

對牛羊肉中3 種瘦肉精進行提取凈化，采用超高效液相色譜-串聯質譜法對牛羊肉樣品中瘦肉精殘留量進行同時測定。該方法實驗步驟簡單，分離效果好，靈敏度高，具有良好的準確度和精密度，可以更加簡便、快捷、準確的測定牛羊肉樣品中的瘦肉精，為食品監(jiān)管和檢測提供新的方法。