寧霄，金紹明，劉彤彤，趙梅，曹進(jìn)

（中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

二維液相色譜通過(guò)兩個(gè)具有不同分離機(jī)制的色譜柱串聯(lián)組合，將目標(biāo)物從一維柱轉(zhuǎn)移到二維柱進(jìn)一步分析。由于二維液相色譜可以去除復(fù)雜樣品基質(zhì)中的干擾物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)多種組分同步檢測(cè)，提高檢測(cè)靈敏度，近年來(lái)已成為復(fù)雜樣品制備和檢測(cè)的主要方法[7]。現(xiàn)有二維分離系統(tǒng)檢測(cè)乳粉中脂溶性維生素的報(bào)道中，樣品預(yù)處理多參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用皂化、有機(jī)溶劑萃取等，方法精密度和回收率有待提高[8]。也有利用在線凈化與二維液相色譜聯(lián)用對(duì)相關(guān)組分進(jìn)行定量分析[9?11]，但儀器成本高，不利于推廣，且分析準(zhǔn)確度有待提高。在利用固相萃取柱對(duì)乳粉皂化液進(jìn)行處理的報(bào)道中[12?13]，VD的檢測(cè)需要經(jīng)正相硅膠柱凈化，方法操作復(fù)雜，且未實(shí)現(xiàn)3種維生素同步測(cè)定。

筆者采用正交試驗(yàn)對(duì)皂化條件進(jìn)行優(yōu)化，最大程度釋放目標(biāo)組分。采用固相萃取法取代GB 5009.82—2016[14]中的有機(jī)溶劑萃取法，并使用二維液相色譜法對(duì)樣品溶液進(jìn)行分析，省去正相制備步驟，簡(jiǎn)化樣品預(yù)處理流程，實(shí)現(xiàn)一次進(jìn)樣同時(shí)完成VA、VD和VE含量的測(cè)定，可以滿足實(shí)驗(yàn)室大批量樣品快速分析要求，也可用于乳粉中VA、VD和VE基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值及產(chǎn)品質(zhì)量控制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：U3000 型雙三元液相色譜(2DLC)系統(tǒng)，配有DAD檢測(cè)器，美國(guó)賽默飛世爾公司。

電子天平：XPE205 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

維生素專用固相萃取柱：TUP-E76-2060 型，規(guī)格為20 g/(60 mL)，天津誠(chéng)軸生物科技有限公司。

VA(視黃醇)對(duì)照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于98.7%，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為1.77%，k=2，美國(guó)西格瑪公司。

VD3對(duì)照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于99.8%，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為0.3%，k=2，德國(guó)DR.E公司。

（二）強(qiáng)化信息收集 掌握市場(chǎng)信息是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，強(qiáng)化生豬生產(chǎn)信息收集是把握市場(chǎng)、科學(xué)決策的保障。要迅速啟動(dòng)區(qū)畜牧局、基層站、業(yè)主微機(jī)網(wǎng)絡(luò)聯(lián)網(wǎng)管理，廣泛收集國(guó)內(nèi)外、重慶市內(nèi)外及周邊縣市生豬市場(chǎng)行情，及時(shí)發(fā)布和交流市場(chǎng)信息，實(shí)現(xiàn)網(wǎng)上資源共享，做到及時(shí)得到市場(chǎng)信息，如市場(chǎng)價(jià)格、供求關(guān)系、疫情動(dòng)態(tài)等。適時(shí)調(diào)整養(yǎng)殖數(shù)量、品種，把握市場(chǎng)主動(dòng)權(quán)，提高業(yè)主抗市場(chǎng)風(fēng)險(xiǎn)能力，防止盲目發(fā)展導(dǎo)致價(jià)格下降造成損失，挫傷業(yè)主養(yǎng)殖積極性。

VE(D-α-生育酚)對(duì)照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于98.2%，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為2.0%，k=2，德國(guó)DR.E公司。

抗壞血酸、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

無(wú)水乙醇、乙腈、甲醇、正己烷：色譜純，德國(guó)默克公司。

1.2 儀器工作條件

一維分析泵：2D-LC系統(tǒng)的右泵；一維分析柱：FOODKIT1 ADE-C18色 譜 柱(150 mm×3.0 mm，3 μm，美國(guó)賽默飛世爾公司)；一維分析流動(dòng)相：乙腈-甲醇-水體系，流量為0.5 mL/min，梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1；二維分析泵：2D-LC 系統(tǒng)的左泵；二維分析柱：FOCDKIT1 & 2ADE-C18色譜柱(100 mm×4.6 mm，2.6 μm，美國(guó)賽默飛世爾公司)；二維分析流動(dòng)相：乙腈-甲醇-水體系，流量為0.8 mL/min，梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：VA325 nm、VD264 nm、VE296 nm；進(jìn)樣體積：20 μL。閥門切換時(shí)間見(jiàn)表2。

表1 梯度洗脫程序

表2 閥門切換時(shí)間

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 樣品處理

精密稱取嬰兒配方乳粉5 g 于250 mL 錐形瓶中，加入20 mL 溫水(50 ℃)溶解后，加入抗壞血酸1.0 g、BHT 0.1 g、無(wú)水乙醇50 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的KOH 溶液15 mL，于65 ℃水浴震蕩皂化50 min，將皂化液冷卻后用水-乙醇(體積比1∶1)混合液轉(zhuǎn)移定容至100 mL，搖勻，在8 000 r/min 下離心5 min，取20 mL 上清液轉(zhuǎn)移至維生素專用固相萃取柱，用100 mL 正己烷(含BHT 質(zhì)量濃度為50 mg/L)以約5 mL/min 的流量洗脫，洗脫液收集至旋蒸瓶中，于40 ℃旋蒸儀旋蒸至約2 mL 時(shí)轉(zhuǎn)移至離心管中，用氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入2 mL 甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，上機(jī)分析。

1.3.2 樣品測(cè)定

試樣液經(jīng)二維液相色譜儀分析，測(cè)得峰面積，采用外標(biāo)法通過(guò)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品凈化方法優(yōu)化

為了減少這三種類脂溶性維生素在運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中的流失，嬰兒配方乳粉制備工藝中需要通過(guò)乙酸酯化并微膠囊化處理，樣品需經(jīng)過(guò)皂化處理，才能將樣品中的VA、VD、VE溶解出來(lái)。GB 5009.82—2016采用有機(jī)溶劑萃取法凈化皂化液，該方法易出現(xiàn)兩相界面乳化現(xiàn)象，導(dǎo)致目標(biāo)組分從皂化液向萃取液轉(zhuǎn)移過(guò)程中損失，且光敏性強(qiáng)的目標(biāo)組分在萃取液濃縮過(guò)程中極易見(jiàn)光分解，從而導(dǎo)致回收率較低。采用固相萃取柱凈化皂化液，可以減少?gòu)?fù)雜操作引入的待測(cè)組分損失?？紤]到乳粉中VD含量低，為實(shí)現(xiàn)與VA、VE的同步檢測(cè)，需利用大容量的固相萃取柱富集。經(jīng)過(guò)對(duì)比試驗(yàn)，最終選擇規(guī)格為20 g/(60 mL)的TUP-E76-2060維生素專用固相萃取柱。

2.2 皂化時(shí)間和溫度的選擇

為全面考察2個(gè)影響因素，以皂化時(shí)間(A)和皂化溫度(B)2 個(gè)因素，每個(gè)因素3 水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，考察最佳提取條件，試驗(yàn)水平見(jiàn)表3。分別選擇皂化時(shí)間為40、50、60 min，皂化溫度為50、65、80 ℃，考察3 種維生素的平均回收率(平行測(cè)定3次，求平均值)。正交試驗(yàn)方案及試驗(yàn)對(duì)應(yīng)維生素的回收率見(jiàn)表4，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 正交因素-水平表

表4 正交試驗(yàn)方案及試驗(yàn)對(duì)應(yīng)維生素的回收率

表5 正交試驗(yàn)回收率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

由表4 可知，當(dāng)皂化溫度為50 ℃時(shí)，樣品皂化不完全導(dǎo)致各種維生素回收率相對(duì)較低；當(dāng)皂化溫度升高至65 ℃時(shí)，維生素回收率明顯上升；繼續(xù)提高皂化溫度至80 ℃，VD回收率明顯下降。原因可能是VA和VE均耐高溫，表面包被被破壞，其構(gòu)型從酯型更加充分地轉(zhuǎn)化為游離醇型，致使萃取效率更高。而VD隨溫度升高發(fā)生少量氧化損失，導(dǎo)致回收率下降。綜合以上情況，確定皂化溫度為65 ℃。固定皂化溫度為65 ℃，當(dāng)皂化時(shí)間從40 min 延長(zhǎng)至50 min時(shí)，3種維生素回收率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；繼續(xù)延長(zhǎng)皂化時(shí)間VA和VE回收率變化不明顯，提取率前者略有提高，后者略有下降，VD情況相反，在80 ℃下皂化時(shí)回收率明顯降低。

由表5中3種維生素回收率的R值可以看出，皂化溫度的影響大于皂化時(shí)間。經(jīng)過(guò)運(yùn)算可得出每個(gè)因素各水平之和K1、K2、K3，綜合各因素K值和直觀分析，在取樣量5 g時(shí)，A2B2為VD和VE最佳提取條件，雖然理論上VA提取效果最佳的皂化條件為A2B3，但改善效果不明顯，反而大幅影響了VD的回收率，因此最佳提取條件確定為A2B2。

表6 為正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果，進(jìn)一步反映了皂化時(shí)間(A)、皂化溫度(B)兩個(gè)因素對(duì)目標(biāo)物回收率影響的程度(P<0.05)。由表6可知，皂化時(shí)間和皂化溫度是該實(shí)驗(yàn)的顯著性因素，故確定其提取回收率最大的皂化條件：溫度65 ℃，時(shí)間50 min。

表6 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.3 乙醇溶液添加量的選擇

由于三種維生素脂溶性較強(qiáng)，因此加入乙醇以增加溶解度，當(dāng)乙醇含量較低時(shí)，目標(biāo)物溶解度較小，極易形成乳濁液，而乙醇含量過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)組分在固相萃取小柱中不能完全保留，乙醇使用量對(duì)目標(biāo)物回收率的影響如圖1所示。

圖1 乙醇不同使用體積對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物回收率

2.4 洗脫液使用量的選擇

實(shí)驗(yàn)使用正己烷作為洗脫液。當(dāng)皂化液上樣量為20 mL 時(shí)，分別選擇使用正己烷50、80、90、100 mL，考察正己烷的使用量對(duì)待測(cè)組分的洗脫效果，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可知，使用100 mL 正己烷可將3種維生素完全洗脫下來(lái)。

圖2 洗脫液不同用量對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物回收率

2.5 線性范圍、檢出限和定量限

配制三種維生素目標(biāo)物的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.2儀器工作條件測(cè)定，以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x軸、色譜峰面積為縱坐標(biāo)y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

以加標(biāo)樣品色譜峰響應(yīng)值為3倍信噪比的添加濃度為方法檢出限，以10倍信噪比的添加濃度為方法定量限。

三種維生素在嬰兒配方乳粉中的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見(jiàn)表7。

表7 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

由表7 可見(jiàn)，VA質(zhì)量濃度在0.005～5 μg/mL 范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.999 6，VD質(zhì)量濃度在0.01～10 μg/mL 范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.999 8，VE質(zhì)量濃度在0.5～500 μg/mL 范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.999 9，表明各目標(biāo)物色譜峰面積與對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

采用已知目標(biāo)組分含量的實(shí)際樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。在樣品中添加適量待測(cè)組分標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加水平分別為定量限的1、5、10 倍。每個(gè)添加水平進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8，空白樣品、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及加標(biāo)樣品溶液色譜圖見(jiàn)圖3。由表8可知，3 種維生素的平均加標(biāo)回收率為75.7%～104.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.7%，證明此樣品預(yù)處理方法及二維液相色譜方法具有較好的回收率和重現(xiàn)性，滿足GB/T 27417—2017附錄A檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求[15]，適用于嬰兒配方乳粉中3 種脂溶性維生素的同時(shí)測(cè)定。

圖3 空白樣品、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及加標(biāo)樣品溶液色譜圖

表8 嬰兒配方乳粉中3種維生素的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.7 方法比對(duì)試驗(yàn)

采用已知濃度的乳粉中VA、VD和VE基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為樣品，加入與其濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液，分別用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法和該方法進(jìn)行測(cè)定，兩種方法檢出限、定量限、回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表9。結(jié)果表明，與現(xiàn)行國(guó)標(biāo)方法比較，該方法的準(zhǔn)確度及精密度均有改善，分析靈敏度均有不同程度的提升，其中VA的定量限提高了30倍，VD的回收率提升了1.6倍。

表9 比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

建立了嬰兒配方乳粉中VA、VD和VE含量同步分析的二維液相色譜方法，該方法利用固相萃取方式，省去了有機(jī)溶劑液液萃取的繁雜步驟，實(shí)現(xiàn)了三種脂溶性維生素的同步檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確穩(wěn)健，靈敏度高，可滿足實(shí)驗(yàn)室大量、快速分析的需求。