劉坦,趙星鵬,劉輝

(鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科;b.超聲科 河南 洛陽(yáng) 471009)

缺血性腦卒中是因缺血缺氧導(dǎo)致的腦組織病變壞死,進(jìn)而引起神經(jīng)功能缺損的一種疾病,其致死致殘率極高,預(yù)后不良[1-2]。根據(jù)TOAST分型,缺血性腦卒中可分為大動(dòng)脈粥樣硬化型(large artery-atherosclerosis,LAA)、心源性栓塞型、小動(dòng)脈閉塞型、其他原因型和原因不明型。其中,LAA型缺血性腦卒中較為常見(jiàn),發(fā)病原因多為頸動(dòng)脈粥樣硬化所致[2]。目前,LAA型缺血性腦卒中的診斷主要依靠超聲檢查、血管造影及磁共振血管成像,而檢測(cè)其發(fā)病及進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)相對(duì)缺乏。在腦卒中miRNA表達(dá)譜的研究中發(fā)現(xiàn),miRNA可能是診斷缺血性腦卒中的有效生物標(biāo)志物,并且,研究證明腦損傷后血漿中miRNA表達(dá)會(huì)有明顯變化,且在卒中進(jìn)展過(guò)程中miRNA表達(dá)也發(fā)生暫時(shí)性變化[3-7]。頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度(carotid intima-media thickness,IMT)是超聲檢查中最直觀檢測(cè)到的與動(dòng)脈粥樣硬化性病變相關(guān)的指標(biāo),被認(rèn)為是早期動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)與腦卒中風(fēng)險(xiǎn)的亞臨床標(biāo)志物[8-10]。有數(shù)據(jù)證明miR-29c可以介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)[11-14],miR-370通過(guò)靶向SIRT6、MPK1和調(diào)節(jié)Nrf2/ARE信號(hào)通路來(lái)加速腦缺血再灌注損傷的形成[15-16],但miR-29c及miR-370表達(dá)水平變化與LAA型缺血性腦卒中發(fā)生、進(jìn)展之間的關(guān)系尚缺乏有力的數(shù)據(jù)支撐,且三者之間是否存在相關(guān)性及相互作用進(jìn)而促進(jìn)了LAA型缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展仍有待進(jìn)一步闡明。

基于此,本研究選取69例LAA型缺血性腦卒中患者和54例健康對(duì)照者,分析兩組人群血漿miR-29c和miR-370表達(dá)水平的差異及與IMT值之間的相關(guān)性,同時(shí)結(jié)合已證實(shí)的與缺血性腦卒中密切相關(guān)的氧化應(yīng)激和炎癥指標(biāo),如缺血修飾白蛋白(ischemia modified albumin,IMA)、超敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP),旨在探討將其作為L(zhǎng)AA型缺血性腦卒中生物標(biāo)志物的應(yīng)用價(jià)值,以期對(duì)LAA型缺血性腦卒中進(jìn)行早期發(fā)現(xiàn)、干預(yù)和預(yù)防。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2020年10月至2022年3月在鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院進(jìn)行就診的經(jīng)頭顱CT或MRI診斷為L(zhǎng)AA型缺血性腦卒中的69例患者作為觀察組,其中男40例,女29例;年齡34～86歲,平均(64.90±12.67)歲;并選取同期在醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的54名體檢者作為健康對(duì)照組,其中男27例,女27例,年齡41～72歲,平均(63.04±5.92)歲。兩組在年齡和性別上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。該研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。(1)納入標(biāo)準(zhǔn):①病史采集和體格檢查符合第4屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn),影像學(xué)檢查CT或MRI發(fā)現(xiàn)梗死灶,支持LAA型缺血性腦卒中的診斷;②入院24 h內(nèi)進(jìn)行完善的實(shí)驗(yàn)室檢查、相關(guān)資料完整;③進(jìn)行頸部多普勒超聲檢查;④患者對(duì)本研究知情,簽署知情同意書(shū)。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①其他類型的缺血性腦卒中、出血性卒中、自身免疫性腦炎等腦血管疾病,其他原因?qū)е碌纳窠?jīng)功能缺損、腫瘤或診斷不明確者;②臨床資料、實(shí)驗(yàn)室資料或頸部超聲資料不完整者。

1.2 樣本收集

觀察組和對(duì)照組均抽取空腹靜脈血2 mL(EDTA-K2抗凝),3 000 r·min-1離心10 min分離血漿,置-70 ℃冰箱待用(觀察組留取入院后治療前第1次血樣)。

1.3 方法與試劑

1.3.1miR-29c和miR-370表達(dá)水平檢測(cè)

取出-70 ℃血漿室溫復(fù)融后,使用血清/血漿miRNA提取分離試劑盒分離并提取外周血漿中的miRNA,按照miRcute增強(qiáng)型miRNAcDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,使用miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),相關(guān)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(所用試劑盒均來(lái)自天根生化科技有限公司)。選擇U6為內(nèi)參,正向引物為5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’,反向引物為5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’;miR-29c正向引物為5’-GTAGCACCATTTGAAATCAG-3’,反向引物為5’-TTGGCACTAGCACATT-3’;miR-370正向引物為5’-TAGCCTGCTGGGGTGGAA-3’,反向引物為5’-TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT-3’。參照試劑說(shuō)明書(shū)、經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后,設(shè)定反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性15 min,94 ℃ 20 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 34 s共5個(gè)循環(huán)富集低豐度miRNA,94 ℃變性20 s、60 ℃退火延伸34 s,共40個(gè)循環(huán)。于61 ℃時(shí)采集熒光,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司生產(chǎn),型號(hào)stepone plus)檢測(cè)其表達(dá)量。通過(guò)2-△△ct方法計(jì)算miR-29c和miR-370的相對(duì)表達(dá)量(每個(gè)樣本測(cè)定2次,取平均值)。

1.3.2IMT檢查

采用飛利浦Q5彩色多普勒超聲檢查儀,探頭頻率4～12 MHz,由醫(yī)院資深超聲科醫(yī)生(副主任醫(yī)師及以上者)進(jìn)行檢查,嚴(yán)格按照中國(guó)血管超聲操作規(guī)范進(jìn)行,測(cè)量雙側(cè)頸總動(dòng)脈IMT值,取平均值進(jìn)行分析(每側(cè)測(cè)量2次)。IMT≥1.0 mm定義為增厚[17]。

1.3.3IMA和hs-CRP檢測(cè)

所用儀器為日立7600-110全自動(dòng)生化分析儀,分別采用白蛋白-鈷結(jié)合法和膠乳免疫比濁法,嚴(yán)格按照儀器及試劑說(shuō)明進(jìn)行操作。檢測(cè)所用試劑均購(gòu)自寧波瑞源生物科技有限公司(只對(duì)健康對(duì)照組進(jìn)行檢測(cè),觀察組從病例中調(diào)取相應(yīng)結(jié)果)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-29c和miR-370相對(duì)表達(dá)量及IMT值

觀察組miR-29c的相對(duì)表達(dá)量低于健康對(duì)照組,miR-370的相對(duì)表達(dá)量高于健康對(duì)照組,IMT值高于健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組miR-29c、miR-370相對(duì)表達(dá)量和IMT值比較[M(P25,P75)]

2.2 miR-29c和miR-370相對(duì)表達(dá)量、氧化應(yīng)激和炎癥指標(biāo)與IMT值間的相關(guān)性分析

通過(guò)Pearson相關(guān)性分析得到,隨著頸總動(dòng)脈IMT的增厚,外周血漿miR-29c相對(duì)表達(dá)量呈逐漸下降趨勢(shì),miR-370相對(duì)表達(dá)量呈逐漸上升趨勢(shì),miR-29c相對(duì)表達(dá)量與IMT呈低度負(fù)相關(guān)(r=-0.229,P<0.05),miR-370相對(duì)表達(dá)量與IMT呈中度正相關(guān)(r=0.492,P<0.05)。同時(shí),IMT與IMA、IMT與hs-CRP及IMA與hs-CRP之間也存在正相關(guān)(r=0.459、0.260、0.322,P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 miR-29c和miR-370相對(duì)表達(dá)量、氧化應(yīng)激和炎癥指標(biāo)與IMT值間的相關(guān)性分析(r)

2.3 miR-29c、miR-370和IMT值對(duì)LAA型缺血性腦卒中的診斷效能

分別對(duì)miR-29c、miR-370和IMT值進(jìn)行ROC曲線分析得到:miR-29c、miR-370和IMT單獨(dú)預(yù)測(cè)LAA型缺血性腦卒中發(fā)生的AUC分別為0.722、0.978、0.903,其中miR-370的預(yù)測(cè)價(jià)值最優(yōu),將3個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)分析,較其單獨(dú)預(yù)測(cè)的靈敏度及特異度均有所增加,AUC達(dá)到最大。見(jiàn)表3、圖1。

圖1 ROC曲線分析miR-29c、miR-370和IMT對(duì)LAA型缺血性腦卒中的診斷效能

表3 miR-29c、miR-370和IMT預(yù)測(cè)LAA型缺血性腦卒中的ROC曲線結(jié)果

3 討論

缺血性腦卒中作為全球重大公共衛(wèi)生問(wèn)題,是導(dǎo)致人類死亡和殘疾的重要原因之一,對(duì)患者健康安全及生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[18],LAA型缺血性腦卒中為臨床急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)最常見(jiàn)的類型,動(dòng)脈粥樣硬化是其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要一環(huán)[19],而IMT增厚和頸動(dòng)脈斑塊形成被認(rèn)為是早期AS的亞臨床標(biāo)志物,與缺血性腦卒中的發(fā)生密切相關(guān),并且可以預(yù)測(cè)AIS的發(fā)生[8-10]。及早診斷并進(jìn)行病情程度評(píng)估對(duì)于臨床治療及預(yù)后具有重要意義[20-21],目前主要通過(guò)影像學(xué)檢查對(duì)神經(jīng)功能缺損進(jìn)行有效評(píng)估,但對(duì)于短暫性腦缺血發(fā)作等也存在一定局限性,也尚未發(fā)現(xiàn)評(píng)估LAA型缺血性腦卒中的特異性血清生物標(biāo)志物[22]。

以往研究已證明miR-29c通過(guò)調(diào)節(jié)編碼細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(如A型膠原和3A型膠原)的miRNA靶點(diǎn)來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化[23],也可以通過(guò)調(diào)節(jié)凝血因子纖維蛋白原等途徑影響動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成,是早期發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化的潛在生物標(biāo)志物[24]。也有研究報(bào)道,急性腦梗死患者腦脊液中miR-29c-3p表達(dá)異常下降[25];血清miR-33a、miR-29c、miR-126單項(xiàng)檢測(cè)診斷腦動(dòng)脈粥樣硬化均具有較好的靈敏度和特異度[22]。這些都已證明miR-29c通過(guò)多種途徑參與了LAA型缺血性腦卒中的發(fā)生過(guò)程,可以作為其潛在的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示,miR-29c在LAA型缺血性腦卒中患者的相對(duì)表達(dá)水平低于健康人群,這與張玲等[25]的研究相一致。

miR-370在脂質(zhì)代謝中起著關(guān)鍵作用,且在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血中的水平較非冠脈硬化患者顯著增加[26],miR-370的過(guò)度表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞的遷移與侵襲,從而參與了動(dòng)脈粥樣硬化的重要過(guò)程[27],并且Tian等[28]的研究表明miR-370能夠抑制由氧化的低密度脂蛋白引發(fā)的血管炎癥和氧化應(yīng)激。以上研究都表明了miR-370可能通過(guò)多種途徑參與LAA型缺血性腦卒中的發(fā)生。本研究結(jié)果也證實(shí)了外周血漿miR-370在發(fā)生LAA型缺血性腦卒中后,相對(duì)表達(dá)量顯著增加,這也與上述結(jié)果相一致。

另外,對(duì)miR-29c和miR-370與IMT的相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn),二者與IMT都存在關(guān)聯(lián),miR-29c相對(duì)表達(dá)量與IMT呈負(fù)相關(guān),miR-370相對(duì)表達(dá)量與IMT呈正相關(guān),同時(shí),其他氧化應(yīng)激及炎癥相關(guān)指標(biāo)IMA和hs-CRP與IMT之間也存在正相關(guān),這些也從一定程度印證了他們之間可能存在一定協(xié)同作用,共同參與了LAA型缺血性腦卒中的發(fā)生。ROC曲線分析也顯示,miR-29c、miR-370和IMT可以作為L(zhǎng)AA型缺血性腦卒中發(fā)生的預(yù)測(cè)因子,單獨(dú)預(yù)測(cè)時(shí),以miR-370表現(xiàn)最優(yōu)(靈敏度0.986、特異度0.926、AUC 0.978),三者聯(lián)合檢測(cè)時(shí),診斷效能達(dá)到最大(AUC 0.995)。這也證實(shí)了外周血漿miR-29c、miR-370聯(lián)合IMT檢測(cè)更有助于提升LAA型缺血性腦卒中的臨床診斷效能。

但是本研究也有一定不足,首先是樣本數(shù)據(jù)量偏小,不可避免地會(huì)有數(shù)據(jù)偏差存在,需要多中心大數(shù)據(jù)的進(jìn)一步驗(yàn)證。其次超聲檢查是由資深超聲科醫(yī)生完成的,但未固定人員,存在一定程度人員測(cè)量誤差;頸總動(dòng)脈IMT測(cè)量采用的是左、右頸總動(dòng)脈分別測(cè)量后取平均值來(lái)計(jì)算,但若患者只有單側(cè)頸總動(dòng)脈IMT增厚,則也可能會(huì)導(dǎo)致平均IMT正常從而造成結(jié)果偏差。

4 結(jié)論

外周血漿miR-29c、miR-370水平及頸總動(dòng)脈IMT值與LAA型缺血性腦卒的發(fā)生密切相關(guān),三者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)提高LAA型缺血性腦卒中的臨床診斷效能具有重要意義。