范兆涵,曹文君,高景宏,石金銘,盧耀恩,葉明,譚中科

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 a.互聯(lián)網(wǎng)醫(yī)療系統(tǒng)與應(yīng)用國家工程實(shí)驗(yàn)室;b.新生兒重癥監(jiān)護(hù)室,河南 鄭州 450052)

自閉癥譜系障礙(autism spectrum disorder,ASD)是一組異質(zhì)性的神經(jīng)發(fā)育障礙,表現(xiàn)為社會(huì)交往障礙、溝通障礙以及限制性、重復(fù)性、刻板性的行為[1]。目前全球總體發(fā)病率約為1%,且以男性為主[2]。既往文獻(xiàn)中對(duì)ASD的病因進(jìn)行廣泛的研究,但具體機(jī)制仍不十分清楚[3]。在治療方面,目前研究主要是針對(duì)如自殘、攻擊性、重復(fù)和刻板行為、注意力不集中等體征的對(duì)癥治療,尚無治療ASD的有效藥物[3-4]。

銅是一種生命中必不可少的金屬微量元素[5],在細(xì)胞中,銅通過穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制維持正常水平,防止過量引起細(xì)胞毒性損傷[6-7]。關(guān)于銅離子對(duì)細(xì)胞的影響,最近Tsvetkov等[7]提出一種新的細(xì)胞死亡方式-銅死亡,其機(jī)制主要是銅離子直接與三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)途徑中的脂質(zhì)?；M分結(jié)合,導(dǎo)致脂質(zhì)酰化蛋白異常聚集和鐵硫簇蛋白丟失,導(dǎo)致蛋白毒性應(yīng)激,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

銅對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的影響十分重要,銅含量失調(diào)可導(dǎo)致認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)發(fā)育異常,例如ASD[8]。ASD患者體內(nèi)可觀察到異常的代謝產(chǎn)物,TCA循環(huán)異常可能是影響綜合征和散發(fā)性神經(jīng)發(fā)育障礙的常見途徑[9]。因此,通過藥物抑制神經(jīng)元銅死亡的發(fā)生可能為ASD的治療提供新的思路。同時(shí),銅也是免疫系統(tǒng)所必需的關(guān)鍵微量元素,免疫系統(tǒng)需要銅來執(zhí)行多種功能,包括調(diào)節(jié)先天性免疫細(xì)胞的激活,影響組織中免疫細(xì)胞的分布等[10-11],因此銅對(duì)免疫反應(yīng)的影響也不容忽視。

炎癥、細(xì)胞因子在內(nèi)的免疫系統(tǒng)、免疫功能的失調(diào),是ASD發(fā)生不可或缺的因素[12]。其中,免疫分為固有免疫和適應(yīng)性免疫,固有免疫細(xì)胞,例如單核細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞均參與ASD的發(fā)生[13-14]。適應(yīng)性免疫中,T細(xì)胞等也參與ASD的發(fā)生[15]。除免疫細(xì)胞外,白細(xì)胞介素(interleukin-6,IL-6)等細(xì)胞因子失調(diào)也是ASD發(fā)生的危險(xiǎn)因素[12]。盡管對(duì)免疫方面研究較多,但ASD免疫細(xì)胞、免疫功能之間相關(guān)程度,以及在ASD進(jìn)展中的作用,仍有待完善。

精準(zhǔn)醫(yī)療以個(gè)體化醫(yī)療為基礎(chǔ),分為精準(zhǔn)預(yù)防和精準(zhǔn)治療,可以根據(jù)個(gè)體特點(diǎn)制定預(yù)防性的干預(yù)措施預(yù)防疾病發(fā)生,或根據(jù)個(gè)體患者特點(diǎn)制定最佳的治療方式[16]。精準(zhǔn)醫(yī)療是隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)與大數(shù)據(jù)科學(xué)的交叉應(yīng)用而迅速發(fā)展的新型醫(yī)療模式。

目前,越來越多的人使用高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)定基因組、蛋白質(zhì)組學(xué)等,通過大型數(shù)據(jù)集分析了解許多疾病的發(fā)病機(jī)制[17]、識(shí)別疾病的潛在新生物學(xué)標(biāo)志物、協(xié)助診斷和治療[18-19]。列線圖是一種將回歸分析、生存分析等統(tǒng)計(jì)模型結(jié)果可視化的工具,通過水平線、刻度線、標(biāo)度等元素使預(yù)測(cè)模型中預(yù)測(cè)因子與結(jié)局的關(guān)系圖形化,直觀地表達(dá)每個(gè)預(yù)測(cè)因子預(yù)測(cè)結(jié)局的作用大小,便于臨床使用者對(duì)模型的理解,同時(shí)根據(jù)自變量取值簡(jiǎn)便快速估計(jì)臨床結(jié)局發(fā)生概率[20]。目前被廣泛應(yīng)用于各個(gè)系統(tǒng)疾病診療及預(yù)后預(yù)測(cè),為臨床決策提供理論依據(jù)[20-22]。

本文利用生物信息學(xué)方法對(duì)ASD進(jìn)行研究,篩選銅死亡相關(guān)基因、計(jì)算免疫浸潤情況、構(gòu)建免疫相關(guān)預(yù)測(cè)模型、預(yù)測(cè)可能有效的藥物分子。本研究將為ASD銅死亡機(jī)制提供新的見解、潛在的生物學(xué)標(biāo)志物及可能的治療藥物,并根據(jù)每個(gè)患者的個(gè)體化特征預(yù)測(cè)疾病發(fā)生概率,促進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 原始數(shù)據(jù)采集

從NCBI基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(GEO;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)搜索2012—2022年ASD相關(guān)測(cè)序數(shù)據(jù)集,其中符合要求的為GSE18123、GSE29691。其中,GSE18123包含115個(gè)非ASD樣本,170個(gè)ASD樣本;GSE29691包含13個(gè)非ASD樣本和2個(gè)ASD樣本。GSE18123分別使用GPL6244,(HuGene-1_0-st)Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array[transcript (gene) version]和GPL570,(HG-U133_Plus_2)Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 2個(gè)進(jìn)行平臺(tái)檢測(cè)。GSE29691使用GPL570,(HG-U133_Plus_2)Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平臺(tái)檢測(cè)。兩個(gè)數(shù)據(jù)集均為基因表達(dá)陣列。本研究使用R 4.2.2版本及其對(duì)應(yīng)安裝包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2 銅死亡相關(guān)基因的數(shù)據(jù)處理和鑒定

對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集使用affy進(jìn)行預(yù)處理,包括背景校準(zhǔn)、歸一化、log2變換[23]。當(dāng)多個(gè)探針對(duì)應(yīng)于一個(gè)共同的基因時(shí),取其平均值作為其表達(dá)值,并使用SVA軟件包去除數(shù)據(jù)集合之間的批次效應(yīng)。對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行合并后與銅死亡相關(guān)基因取交集。其中,銅死亡相關(guān)基因包括SLC31A1、PDHB、PDHA1、LIPT1、ATP7A、ATP7B、DBT、DLAT、DLD、DLST、FDX1、LIAS,來源于發(fā)現(xiàn)銅死亡的Tsvetkov團(tuán)隊(duì)報(bào)道[7]。

1.3 免疫細(xì)胞浸潤分析

本研究使用“GSVA”軟件包進(jìn)行ssGSEA算法計(jì)算免疫評(píng)分,估算樣本的免疫浸潤程度;使用“pheatmap”軟件包繪制熱圖;“corrplot”軟件包對(duì)其進(jìn)行免疫細(xì)胞、免疫功能之間的相關(guān)性分析,并繪制熱圖;“ggpubr”軟件包采取秩和檢驗(yàn)比較ASD組和非ASD組免疫細(xì)胞及免疫功能的差異性,并繪制箱圖。

1.4 構(gòu)建預(yù)測(cè)模型

使用“psych”軟件包分析銅死亡相關(guān)基因與免疫浸潤的相關(guān)性分析,并繪制相關(guān)性熱圖,根據(jù)結(jié)果篩選出與免疫最為相關(guān)的基因。使用“rms”R語言軟件包,構(gòu)建nomogram風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)圖。使用C指數(shù)、ROC曲線、校準(zhǔn)曲線等對(duì)預(yù)測(cè)模型進(jìn)行檢驗(yàn),了解銅死亡相關(guān)基因?qū)膊“l(fā)生的意義。

1.5 銅死亡免疫相關(guān)基因進(jìn)行KEGG、GO分析及潛在治療藥物預(yù)測(cè)

Enrichr網(wǎng)站(https://maayanlab.cloud/Enrichr/)是一個(gè)基于網(wǎng)頁端的綜合性基因集富集分析工具。本研究使用Enrichr網(wǎng)站對(duì)銅死亡免疫相關(guān)基因進(jìn)行KEEG分析,分析其可能的代謝通路;從生物學(xué)過程(biological Process,BP)、細(xì)胞成分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3個(gè)方面進(jìn)行GO分析;對(duì)ASD銅死亡基因相關(guān)的小分子藥物進(jìn)行預(yù)測(cè)。以P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 篩選銅死亡相關(guān)基因

將GSE18123、GSE29691兩個(gè)集合數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后合并,和銅死亡相關(guān)基因取交集。發(fā)現(xiàn)12個(gè)ASD銅死亡相關(guān)基因:SLC31A1、PDHB、PDHA1、LIPT1、ATP7A、ATP7B、DBT、DLAT、DLD、DLST、FDX1、LIAS。

2.2 免疫細(xì)胞浸潤分析

2.2.1免疫浸潤情況

本研究首先采用ssGSEA算法計(jì)算免疫評(píng)分。圖1A為ASD與非ASD免疫浸潤的熱圖。

A為免疫浸潤的熱圖;B為免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性分析熱圖;C為免疫功能之間的相關(guān)性分析熱圖;D為ASD與非ASD免疫細(xì)胞浸潤差異性分析的箱型圖;E為ASD與非ASD免疫功能浸潤差異性分析的箱形圖;*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.001。

2.2.2免疫功能、免疫細(xì)胞間相關(guān)性分析

本研究分析ASD中浸潤的免疫細(xì)胞、免疫功能的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)不同免疫細(xì)胞、免疫功能之間存在協(xié)同或競(jìng)爭(zhēng)作用(圖1B、C)。其中,CD8+T細(xì)胞和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞協(xié)同作用較強(qiáng)(r=0.69),而Treg細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)(r=-0.71)。在免疫功能方面,副炎癥和Ⅰ型干擾素反應(yīng)具有較強(qiáng)的協(xié)同作用(r=0.83)。

2.2.3ASD與非ASD組免疫評(píng)分差異性分析

ASD和非ASD組免疫細(xì)胞和免疫功能的評(píng)分差異分析如圖1D、E所示。部分免疫細(xì)胞不同組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,免疫細(xì)胞浸潤差異的柱狀圖顯示在ASD組中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、Treg細(xì)胞其浸潤程度較高,B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞、T濾泡輔助細(xì)胞、Th2細(xì)胞浸潤程度較低。在免疫功能方面,與非ASD組相比,ASD組趨化因子受體、免疫檢查點(diǎn)、人類白細(xì)胞抗原等免疫功能減弱。

2.3 構(gòu)建預(yù)測(cè)模型

對(duì)ASD銅死亡相關(guān)基因與免疫浸潤的相關(guān)性分析(圖2A),選出與免疫相關(guān)的基因SLC31A1、PDHB、PDHA1、LIPT1、ATP7A、ATP7B、DBT、DLAT、DLD、DLST、FDX1、LIAS。使用上述基因構(gòu)建列線圖(圖2B)。計(jì)算模型C指數(shù)為0.65,計(jì)算模型ROC曲線下面積為0.65(圖2C),提示模型對(duì)ASD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)具有不錯(cuò)的預(yù)測(cè)能力。繪制校準(zhǔn)曲線(圖2D),顯示模型的結(jié)果與實(shí)際結(jié)果的一致性較好。

A為ASD銅死亡基因免疫浸潤的相關(guān)性分析熱圖;B為ASD的列線圖,選取免疫相關(guān)基因SLC31A1、PDHB、PDHA1、LIPT1、ATP7A、ATP7B、DBT、DLAT、DLD、DLST、FDX1、LIAS構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型;C為預(yù)測(cè)模型的ROC曲線,該模型的ROC曲線下面積為0.652;D為列線圖的校準(zhǔn)曲線。

2.4 銅死亡免疫相關(guān)基因的KEGG、GO分析及藥物預(yù)測(cè)

這些基因主要參與丙酮酸乙酰輔酶A生物合成過程、乙酰輔酶A生物合成過程、丙酮酸代謝過程等生物過程(圖3A);主要細(xì)胞成分位于線粒體基質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器腔等部位(圖3B);主要分子功能涉及過渡金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性、氧化還原酶活性等(圖3C)。KEEG信號(hào)通路分析表明,這些基因主要參與TCA循環(huán)、丙酮酸代謝等信號(hào)通路(圖3D)。利用基于DSigDB數(shù)據(jù)庫的Enrichr平臺(tái)對(duì)ASD銅死亡12個(gè)基因相關(guān)的小分子藥物進(jìn)行預(yù)測(cè),最終提取出前10個(gè)潛在化合物(圖3E)。結(jié)果顯示,維A酸是與大多數(shù)基因相互作用的藥物分子。

A為ASD銅死亡相關(guān)基因的BP分析;B為ASD銅死亡相關(guān)基因的CC分析;C為ASD銅死亡基因的MF分析;D為ASD銅死亡基因的KEEG分析;E為ASD銅死亡基因相關(guān)的藥物預(yù)測(cè)。

3 討論

精準(zhǔn)醫(yī)療相較于傳統(tǒng)治療和預(yù)防策略,可以根據(jù)每個(gè)患者的特點(diǎn)制定最適合、有效的治療和預(yù)防策略,而基因組學(xué)和生物信息學(xué)的最新進(jìn)展有助于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)更好實(shí)現(xiàn)[24]。本文利用生物信息學(xué)方法對(duì)ASD銅死亡進(jìn)行研究,構(gòu)建ASD免疫相關(guān)預(yù)測(cè)模型,預(yù)測(cè)個(gè)體發(fā)生ASD概率,促進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。同時(shí)確定銅死亡相關(guān)基因組KEEG通路、GO通路、藥物等,為ASD銅死亡機(jī)制提供新的思路。

ASD是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙疾病,迄今為止,無藥物可以根治ASD,但目前針對(duì)各個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)遞質(zhì),如催產(chǎn)素、膽堿能和谷氨酸能等的藥物研究正在持續(xù)進(jìn)展中[4]。

本研究發(fā)現(xiàn),銅死亡基因與免疫相關(guān)性較好,且銅死亡基因?qū)SD的診斷具有一定的積極意義,因此,本研究認(rèn)為銅死亡在ASD中可能具有一定的潛在作用。以往的研究發(fā)現(xiàn),銅離子對(duì)于維持正常的神經(jīng)元功能至關(guān)重要[12,25],這也提示了抑制銅死亡聯(lián)合免疫治療或可能是ASD患者治療的新思路。

在GSE18123和GSE29691兩個(gè)數(shù)據(jù)集中共選取172個(gè)ASD樣本和128個(gè)非ASD樣本,在樣本中篩選出12個(gè)與銅死亡免疫相關(guān)的基因,包括SLC31A1、PDHB、PDHA1、FDX1、DLST、DLAT、LIPT1、LIAS、DLD、ATP7A、ATP7B、DBT。其中,SLC31A1可以編碼細(xì)胞膜中高親和力的銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,影響膳食銅攝取[26]。PDHB是一種雙功能磷酸蛋白,與病原體附著在宿主細(xì)胞表面一起在代謝途徑中起著至關(guān)重要的作用[27]。PDHA1是丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的關(guān)鍵成分,參與線粒體氧化磷酸化和TCA循環(huán)等過程,在葡萄糖代謝中必不可少[28]。FDX1是銅死亡的關(guān)節(jié)調(diào)控因子,蛋白質(zhì)脂?；纳嫌握{(diào)節(jié)因子,影響線粒體代謝功能[29]。DLST、DLAT是編碼線粒體蛋白質(zhì)脂酰化的2個(gè)重要基因,LIPT1、LIAS和DLD是編碼線粒體硫辛酸途徑的3個(gè)重要基因[7]。ATP7A、ATP7B分別為銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP酶銅轉(zhuǎn)運(yùn)α和ATP酶銅轉(zhuǎn)運(yùn)β,對(duì)于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能至關(guān)重要,發(fā)生突變后可導(dǎo)致神經(jīng)遺傳疾病[30]。DBT調(diào)節(jié)支鏈氨基酸的降解,是線粒體多酶支鏈α-酮酸脫氫酶復(fù)合體的轉(zhuǎn)?；附M分[31]。

KEEG信號(hào)通路分析顯示,這些基因主要參與了TCA循環(huán)、丙酮酸代謝等信號(hào)通路等,TCA循環(huán)及其酶組分在基底細(xì)胞代謝中起至關(guān)重要的作用。根據(jù)基因構(gòu)建列線圖并預(yù)測(cè)小分子治療藥物,結(jié)果顯示維A酸是與大多數(shù)基因相互作用、可能有效的藥物分子。

4 結(jié)論

本研究確定了參與ASD免疫過程的銅死亡相關(guān)基因,制定ASD銅死亡免疫相關(guān)診斷預(yù)測(cè)模型、藥物預(yù)測(cè),根據(jù)不同患者的特點(diǎn)預(yù)測(cè)患病風(fēng)險(xiǎn)及可能有效藥物,促進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展。同時(shí),為銅死亡在ASD免疫方面的基礎(chǔ)研究提供一定的思路和線索,可能有助于基于銅死亡發(fā)病機(jī)制的ASD免疫療法的研究。