段嘉豪，李兆勇，陳龍，劉恩旭，李碩夫，楊雷，楊少鋒

〔摘要〕 目的 探究脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stem cell， ADSC）修復(fù)氧化損傷髓核細(xì)胞（nucleus pulposus cell， NPC）的作用機(jī)制。方法 實驗分為NPC組、ADSC組、NPC+ADSC組、H2O2+NPC+ADSC組、H2O2+NPC組5組。采用H2O2構(gòu)建NPC氧化損傷模型；SA-β-Gal染色分析NPC衰老程度；流式細(xì)胞儀檢測NPC氧化損傷水平；Western blot檢測ADSC中Collagen Ⅱ、Aggrecan蛋白表達(dá)水平，以及NPC中Collagen Ⅱ、p53、p21、TGF-β1、Smad2、p-Smad2蛋白表達(dá)水平；qPCR檢測ADSC中Collagen Ⅱ、Aggrecan mRNA表達(dá)水平，以及NPC中Collagen Ⅱ、p53、p21、TGF-β1、Smad2 mRNA表達(dá)。結(jié)果 與H2O2+NPC組相比較，H2O2+NPC+ADSC組的NPC衰老數(shù)量減少（P<0.05），NPC氧化損傷減輕（P<0.05），p53、p21蛋白和基因表達(dá)下降（P<0.05），Collagen Ⅱ、TGF-β1、p-Smad2蛋白和基因表達(dá)升高（P<0.05）。與ADSC組相比，NPC+ADSC組Collagen Ⅱ、Aggrecan基因和蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。結(jié)論 ADSC與NPC共培養(yǎng)不僅可以促進(jìn)ADSC類髓核化，而且ADSC可修復(fù)氧化損傷的NPC，抑制其衰老，該過程可能與調(diào)控TGF-β1/Smad2信號通路有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；髓核細(xì)胞；氧化損傷；細(xì)胞衰老；TGF-β1/Smad2信號通路

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.08.010

Mechanism of adipose-derived mesenchymal stem cells repairing

oxidatively damaged nucleus pulposus cells

DUAN Jiahao， LI Zhaoyong， CHEN Long， LIU Enxu， LI Shuofu， YANG Lei， YANG Shaofeng*

The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the mechanism of adipose-derived mesenchymal stem cell （ADSC） repairing oxidatively damaged nucleus pulposus cell （NPC）. Methods Five groups were divided as NPC group， ADSC group， NPC+ADSC group， H2O2+NPC+ADSC group， and H2O2+NPC group. Hydrogen peroxide （H2O2） was used to construct the oxidative damage model of NPC; SA-β-Gal staining was performed to analyze the degree of senescence in NPC; flow cytometer was used to determine the level of oxidative damage in NPC; Western blot was used to check the protein expressions of Collagen Ⅱ and Aggrecan in ADSC， and the protein expressions of Collagen Ⅱ， p53， p21， TGF-β1， Smad2， and p-Smad2 in NPC; qPCR was carried out to determine the mRNA expressions of Collagen Ⅱ and Aggrecan in ADSC， and the mRNA expressions of Collagen Ⅱ， p53， p21， TGF-β1， and Smad2 in NPC. Results Compared with H2O2+NPC group， H2O2+NPC+ADSC group showed a reduced number of senescent NPC （P<0.05）， attenuated oxidative damage to NPC （P<0.05）， decreased protein and mRNA expressions of p53 and p21 （P<0.05）， and elevated protein and mRNA expressions of Collagen II， TGF-β1， and p-Smad2 （P<0.05）. Compared with ADSC group， the protein and mRNA expressions of Collagen Ⅱ and Aggrecan were elevated in NPC+ADSC group （P<0.05）. Conclusion Co-culture of ADSC and NPC can promote ADSC-like myelination， and ADSC can repair oxidatively damaged NPC and inhibit their senescence， which may be related to the regulation of TGF-β1/Smad2 pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 adipose-derived mesenchymal stem cells; nucleus pulposus cells; oxidative damage; cell senescence; TGF-β1/Smad2

下腰痛（low back pain， LBP）是臨床常見病、多發(fā)病。流行病學(xué)調(diào)查顯示，80%的人一生中至少會出現(xiàn)一次下腰痛，造成了巨大的社會問題和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。椎間盤退變（intervertebral discs degeneration， IDD）是公認(rèn)導(dǎo)致下腰痛的主要原因[2]，其典型表現(xiàn)為髓核細(xì)胞（nucleus pulposus cell， NPC）衰老和死亡增加、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）降解、蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白合成減少，炎癥因子浸潤、酸性環(huán)境增強(qiáng)等微環(huán)境惡化[3]。因此，如何防治IDD具有重要的現(xiàn)實意義。

目前，用于治療IDD所引起腰背痛的經(jīng)典方法是手術(shù)切除椎間盤以減輕疼痛[4]，但手術(shù)并不能修復(fù)或減緩潛在的退行性病變。相比于單純的機(jī)械性切除椎間盤，生物修復(fù)椎間盤具有恢復(fù)退變椎間盤生物功能、緩解病變、降低并發(fā)癥等優(yōu)點[5-7]。因此，細(xì)胞治療是一種有潛力的修復(fù)IDD的治療方法。

相較于其他干細(xì)胞，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose mesenchymal stem cell， ADSC）因其來源豐富、易獲取、無免疫排斥等優(yōu)點成為修復(fù)退變椎間盤的理想候選細(xì)胞[8]，可分泌生物活性因子以調(diào)節(jié)炎癥，且具有分化為NPC的潛力[9]。TGF-β/Smad通路是IDD的經(jīng)典信號通路，TGF-β1信號傳導(dǎo)在IDD中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[10]。本研究通過建立NPC氧化損傷模型，使用Transwell小室與ADSC共培養(yǎng)，探究ADSC類髓核化表現(xiàn)以及對NPC氧化損傷修復(fù)機(jī)制，旨為相關(guān)實驗研究及臨床應(yīng)用提供一定的參考價值。

1 材料和方法

1.1? 試劑和儀器

普諾賽人椎間盤髓核細(xì)胞完全培養(yǎng)基、PBS緩沖液（武漢普諾賽生命科技有限公司：批號：CM-H097、PB180327）；成人ADSC完全培養(yǎng)基（海星生物科技有限公司，批號：ADHX-C101）；0.25%胰酶消化液（北京索萊寶科技有限公司，批號：SL6020-100 mL）；細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（貝蘭伯，批號：CCD06-060A、CCB06-205）；Costar Transwell小室（MERCK，批號：3412）；30%過氧化氫（上海國藥集團(tuán)，批號：10011208）；MTT試劑盒、β-半乳糖苷酶染色試劑盒、ROS檢測試劑盒（碧云天，批號：C0602、C0009S、S0033）；TGF-β1抗體、Collagen Ⅱ 抗體、過氧化酶山羊抗兔IgG二抗、β-actin抗體（Proteintech公司，批號：21898-1-AP、28459-1-AP、SA00001-2、66009-1-Ig）；Aggrecan抗體、p-Smad2抗體、Smad2抗體（Abcam公司，批號：ab36861、ab188334、ab40855）；p53抗體、p21抗體（CTS公司。批號：#2527、#2947）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號：Q711-02）；超凈工作臺、生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號：SW-CJ-1FD、BSC-1300 II A2）；倒置生物顯微鏡（德國徠卡，型號：DMI 1）；二氧化碳培養(yǎng)箱（新加坡ESCO，型號：CCL-170B-8）；冷凍離心機(jī)（美國CENTURION，型號：K2015R）；熒光定量RCP儀（美國Thermo Fisher，型號：PIKOREAL96）；多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan，型號：Spark 20M）；電泳儀、凝膠成像儀（美國Bio-Rad，型號：PowerPac Basic、ChemiDocXRS+）。

1.2? 細(xì)胞來源

成人ADSC（海星生物科技有限公司，批號：20210113S1）；人椎間盤NPC（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：CP-H097）。

1.3? 細(xì)胞培養(yǎng)及NPC氧化損傷模型

細(xì)胞融合至80%～90%用胰酶消化傳至下1代，按1∶2進(jìn)行傳代，3～5 d換液1次，第3代開始進(jìn)行實驗操作。分別使用不同濃度（0、100、200、300、400、500 μmol·L-1）的H2O2造模，24 h后MTT法評價其對NPC抑制率，確定細(xì)胞毒性，計算半抑制濃度，選出H2O2構(gòu)建NPC氧化損傷模型的最佳濃度。

1.4? Transwell小室ADSC/NPC共培養(yǎng)體系的構(gòu)建及實驗分組

采用孔徑0.4 μm的Transwell小室6孔板建立細(xì)胞共培養(yǎng)體系，胰酶消化后將第3代ADSC置于上層的Transwell小室內(nèi)，加入ADSC培養(yǎng)基，待ADSC貼壁后，下層接種第3代NPC。細(xì)胞接種密度2×105，接種比例為1∶1[11]。將實驗分為5組，分別為NPC組、ADSC組、NPC+ADSC組、H2O2+NPC+ADSC組、H2O2+NPC組。其中NPC+ADSC組、H2O2+NPC+ADSC組接種于Transwell小室，NPC組、ADSC組、H2O2+NPC組接種于普通6孔板。

1.5? 觀察指標(biāo)

1.5.1? 活性氧（reactive oxygen species， ROS）檢測? 按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L，細(xì)胞消化收集后，懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。上流式儀檢測，用FITC通道收集信號。

1.5.2? SA-β-Gal染色分析? 吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次，加入500 μL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。吸除細(xì)胞固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次3分鐘。吸除PBS，每孔加入500 μL染色工作液。37 ℃孵育過夜，保鮮膜封住24孔板防止蒸發(fā)，普通光學(xué)顯微鏡下觀察，各組隨機(jī)采取3個視野進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.5.3? Western blot檢測ADSC中Collagen Ⅱ、Aggrecan及NPC中Collagen Ⅱ、p53、p21、TGF-β1、Smad2、p-Smad2蛋白表達(dá)? 收集細(xì)胞，加入100 μL RIPA裂解液，冰上裂解液15 min，12 000 r/min離心15 min，離心半徑9 cm，取上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，測定蛋白總含量。SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗Collagen Ⅱ（1∶500）；Aggrecan、P53（1∶1 000）；P21（1∶1 000）；TGF-β1（1：2 000）；Smad2（1∶4 000）；p-Smad2（1∶2 000），4 ℃孵育一抗過夜，次日取出膜，于室溫?fù)u床用PBST洗滌3次，加入二抗于室溫?fù)u床孵育1 h，再次洗膜 3 次，使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光、攝像。

1.5.4? qPCR檢測ADSC中Collagen Ⅱ、Aggrecan及NPC中Collagen Ⅱ、p53、p21、TGF-β1、Smad2 mRNA表達(dá)? 收集ADSC和NPC，通過Trizol法提取總RNA，以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA加入擴(kuò)增反應(yīng)體系，在NCBI上搜索目的基因的序列，運(yùn)用Primer 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計，引物由金斯瑞生物科技股份有限公司合成，以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算，相關(guān)引物序列信息見表1。

1.6? 統(tǒng)計學(xué)方法

本實驗采用GraphPad Prism 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計，所有實驗至少重復(fù)3次，采用“ｘ±s”表示，兩組比較采用Student's t檢驗，多組比較采用Turkey's t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 人源ADSC和NPC細(xì)胞形態(tài)學(xué)及鑒定

為避免提取原代時細(xì)胞污染，同時為提高細(xì)胞純度和活性，已購買人源ADSC和NPC，其中ADSC形態(tài)呈紡錘形，NPC形態(tài)呈長梭形，詳見圖1。

2.2? NPC造模濃度及氧化損傷水平

H2O2對NPC的IC50=122 μmol/L，選擇100 μmol/L為造模濃度，在造模24 h后對各組的ROS水平進(jìn)行檢測，與H2O2+NPC組相比，H2O2+NPC+ADSC組熒光強(qiáng)度降低（P<0.05）。詳見圖2。

2.3? NPC衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶染色分析

與H2O2+NPC組相比，H2O2+NPC+ADSC組中NPC的衰老數(shù)量減少（P<0.05）。詳見圖3。

2.4? Western blot檢測各組ADSC中Aggrecan和Collagen Ⅱ蛋白表達(dá)差異

與ADSC組相比，NPC+ADSC組中ADSC的Aggrecan和Collagen Ⅱ蛋白含量明顯升高（P<0.05）。詳見圖4。

2.5? Western blot檢測各組NPC中Collagen Ⅱ、p21、p53、TGF-β1、Smad2、p-Smad2蛋白表達(dá)差異

與H2O2+NPC組相比，H2O2+NPC+ADSC組Collagen Ⅱ蛋白表達(dá)水平增加（P<0.05），p53、p21蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05），TGF-β1、p-Samd2蛋白表達(dá)水平增加（P<0.05）。詳見圖5。

2.6? qPCR檢測ADSC細(xì)胞中Aggrecan、 Collagen Ⅱ mRNA及NPC細(xì)胞中Collagen Ⅱ、p21、p53、TGF-β1、Smad2 mRNA表達(dá)水平

與ADSC組相比，NPC+ADSC組中ADSC的Aggrecan和Collagen Ⅱ mRNA表達(dá)量升高（P<0.05）；與H2O2+NPC組相比，H2O2+NPC+ADSC組NPC中的Collagen Ⅱ mRNA表達(dá)量增加（P<0.05），p53、p21 mRNA表達(dá)量減少（P<0.05），TGF-β1、Smad2 mRNA表達(dá)量增加（P<0.05）。詳見圖6。

3 討論

IDD是一個復(fù)雜的細(xì)胞介導(dǎo)的過程[12]，炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、異常機(jī)械負(fù)荷、端?？s短、DNA損傷和營養(yǎng)不良等因素都會導(dǎo)致椎間盤細(xì)胞衰老和死亡，最終導(dǎo)致IDD[13]。其中氧化應(yīng)激是由于椎間盤細(xì)胞內(nèi)線粒體和過氧化物酶體代謝異常，過量的ROS產(chǎn)生從而引發(fā)NPC衰老和凋亡[14]，而ECM降解會增加NPC內(nèi)的ROS，TGF-β1/Smad通路被抑制，同時加劇氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老，上調(diào)NPC中p53和p21的表達(dá)[15]，從而惡性循環(huán)，加速IDD。

TGF-β1是NPC內(nèi)重要的生長因子，TGF-β1不僅可促進(jìn)ADSC類髓核化[16]，而且還可抑制NPC纖維化[17]，其可與細(xì)胞膜上受體結(jié)合，使Smad2、Smad3磷酸化與Smad4結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控靶基因的表達(dá)[18]。YANG等[19]通過檢測正常和退變?nèi)俗甸g盤組織中TGF-β1含量，發(fā)現(xiàn)在正常椎間盤組織中TGF-β1是顯著高于退變組織中的TGF-β1。KRETOVA等[20]實驗表明TGF-β通過NF1/Smad4復(fù)合物途徑，抑制氧化應(yīng)激損傷、DNA損傷和炎癥反應(yīng)。DNA末端的不完全復(fù)制是細(xì)胞衰老首要原因，從而激活p53-p21通路誘發(fā)復(fù)制性衰老[21]。KIM等[22]通過手術(shù)獲得不同程度退變的髓核標(biāo)本發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長和椎間盤退變的進(jìn)展，p53-p21通路被激活，SA-β-Gal表達(dá)加強(qiáng)，端粒縮短，端粒酶活性降低，衰老特征越發(fā)明顯。p53、p21是NPC內(nèi)衰老標(biāo)志物，當(dāng)NPC氧化應(yīng)激后，TGF-β1/Smad通路受到抑制，而另一分支p53-p21通路激活[23]，兩者在不同程度上加速Aggrecan和Collagen Ⅱ降解，導(dǎo)致NPC衰老。

Aggrecan和Collagen Ⅱ是髓核組織中的主要成分，共同維持椎間盤機(jī)械強(qiáng)度和彈性[24]，隨著年齡的增長，Aggrecan和Collagen Ⅱ含量減少，ECM降解，椎間盤內(nèi)微環(huán)境惡化，加劇了IDD發(fā)展[25]。RAGETLY等[26]發(fā)現(xiàn)通過Collagen Ⅱ誘導(dǎo)可改善間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附和軟骨生成能力。LU等[27]發(fā)現(xiàn)Collagen Ⅱ通過調(diào)節(jié)Rho A/Rock信號通路可使ADSC向軟骨細(xì)胞分化。

中醫(yī)學(xué)將IDD歸屬于“腰痛”或“痹病”范疇。早在《素問·脈要精微論》中就有對其論述：“腰者，腎之府，轉(zhuǎn)搖不能，腎將憊矣?！比酥林心?，元氣漸衰、五臟不榮是腰痛病的主要病因病機(jī)，而外傷、勞損形成血瘀實邪為常見誘因，腎臟虛損，經(jīng)脈困阻，氣血運(yùn)行不暢，而造成筋骨失養(yǎng)，故腎虛血瘀是IDD的基本病機(jī)。再生醫(yī)學(xué)中干細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)能使其向特定的細(xì)胞增殖、分化，從精的繁衍生命、化血化氣、濡養(yǎng)臟腑等功能角度來看，干細(xì)胞的特性與中醫(yī)中腎精的功能十分貼合[28]；也有學(xué)者認(rèn)為，干細(xì)胞并非是單純腎精，而是以腎精為主，臟腑經(jīng)絡(luò)、氣血髓等共同構(gòu)成的多層次結(jié)構(gòu)[29]。因此，在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下可推測ADSC治療氧化損傷NPC可能起到了補(bǔ)腎益精、活血化瘀的功效。

本文從NPC氧化應(yīng)激后衰老的角度闡述與ADSC共培養(yǎng)機(jī)制，旨在ADSC治療IDD提供實驗依據(jù)，但本文存在一定局限性，對于造模濃度未做時間梯度；Smad家族相關(guān)蛋白未全部檢測；關(guān)于NPC衰老表型的發(fā)展，如細(xì)胞周期、炎癥因子、趨化因子等[30]仍有待闡明。目前，臨床上干細(xì)胞注射療法治療IDD還處于開發(fā)階段，其具有巨大的發(fā)展?jié)摿31]，但由于退變椎間盤內(nèi)炎癥、低氧、低PH值微環(huán)境影響干細(xì)胞移植功能[32]。下一步團(tuán)隊將利用補(bǔ)腎活血的中藥或復(fù)方含藥血清對ADSC進(jìn)行干預(yù)，觀察是否能進(jìn)一步促進(jìn)ADSC類髓核化，修復(fù)氧化損傷后的NPC；或是利用水凝膠包裹ADSC進(jìn)行椎間盤內(nèi)注射的在體實驗，觀察體內(nèi)效果，以期能更好的治療IDD。

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（本文編輯? 蘇? 維）