肖清玄，郭志華，羅佳敏，陳宇霞，張書萌，于子璇，陳伶利，李杰

〔摘要〕 目的 基于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（tansforming growth factor-β， TGF-β）/Smads信號(hào)通路探討?zhàn)B心通脈方對(duì)慢性心力衰竭（chronic heart failure， CHF）血瘀證大鼠心肌纖維化和炎癥損傷的影響。方法 通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法將45只SD雄性大鼠分為造模組（27只）、正常組（12只）和假手術(shù)組（6只），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后行冠脈結(jié)扎術(shù)造模，術(shù)后10 min行心電圖檢測(cè)，6周后檢測(cè)超聲心動(dòng)圖、血清N端前腦鈉肽（N-terminal pro-brain natriuretic peptide， NT-pro BNP）含量和血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)。成模后，運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法從造模組中取18只大鼠均分為中藥組、西醫(yī)組和模型組，中藥組予養(yǎng)心通脈方溶液12 g/kg灌胃，西藥組予以纈沙坦溶液0.8 g/kg灌胃，正常組、假手術(shù)組和模型組予等量蒸餾水，每日1次，持續(xù)4周。藥物干預(yù)結(jié)束后，超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心功能指標(biāo)，HE染色和Masson染色觀察大鼠心肌組織病理改變及纖維化程度，ELISA法檢測(cè)大鼠血清NT-pro BNP和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10， IL-10）含量，Western blot法檢測(cè)大鼠心肌組織TGF-β/Smads信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，造模組大鼠心電圖出現(xiàn)明顯的ST段上抬，大鼠血清NT-pro BNP含量顯著升高（P＜0.01），左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction， LVEF）水平顯著下降（P＜0.01），全血高切黏度、中切黏度、低切黏度顯著升高（P＜0.01）。藥物干預(yù)4周后，與正常組比較，模型組LVEF明顯降低（P＜0.01），血清NT-Pro BNP、TNF-α、IL-1β及IL-6水平上升（P＜0.01），IL-10水平明顯下降（P＜0.01），心肌組織ANGPT2、TGF-β1、Smad 2、Smad 3蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組、西藥組LVEF水平上升（P＜0.01），血清NT-pro BNP和TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低（P＜0.01），IL-10含量增多（P＜0.01），心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)減少（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論 冠脈結(jié)扎術(shù)可成功制備CHF血瘀證大鼠模型，養(yǎng)心通脈方可能通過(guò)抑制CHF血瘀證模型大鼠TGF-β/Smads信號(hào)通路，調(diào)控機(jī)體炎癥損傷和纖維化機(jī)制。

〔關(guān)鍵詞〕 TGF-β/Smads信號(hào)通路；慢性心力衰竭；血瘀證；養(yǎng)心通脈方；炎癥損傷；心肌纖維化

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.08.003

Exploring the mechanism of action for Yangxin Tongmai Formula in regulating rats with chronic heart failure of blood stasis pattern

based on TGF-β/Smads signaling pathway

XIAO Qingxuan， GUO Zhihua， LUO Jiamin， CHEN Yuxia， ZHANG Shumeng， YU Zixuan， CHEN Lingli， LI Jie*

Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of Yangxin Tongmai Formula （YXTMF） on myocardial fibrosis and inflammatory injury in rats with chronic heart failure （CHF） of blood stasis pattern based on the transforming growth factor-β （TGF-β）/Smads signaling pathway. Methods A total of 45 male SD rats were divided into modeling group （n=27）， normal group （n=12） and sham group （n=6） by random number table method. Coronary ligation modeling was performed after 1 week of adaptive feeding. Electrocardiography was performed 10 mins after surgery. Echocardiography， serum N-terminal pro-brain natriuretic peptide （NT-pro BNP） content， and hemorheological indicators were checked 6 weeks later. After modeling， 18 rats taken from the modeling group by random number table method were randomly subdivided into Chinese medicine group （with YXTMF solution gavage， 12 g/kg）， western medicine group （with valsartan solution gavage， 0.8 g/kg） and model group. The normal group， sham group， and model group were given equal amount of distilled water. All groups had been provided with corresponding drugs or distilled water once daily for 4 weeks. After 4 weeks of drug intervention， echocardiography was used to examine the cardiac function indicators; HE staining and Masson staining were used to observe the pathological changes and fibrosis degree of rat myocardial tissue; ELISA method was used to test the levels of serum NT-pro BNP， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， and interleukin-10 （IL-10） in rats; Western blot method was used to check the TGF-β/Smads signaling pathway-related protein expressions in rat myocardial tissue. Results Compared with normal group， rats in model group showed significant ST-segment elevation in electrocardiogram， significantly increased serum NT-pro BNP content （P<0.01）， significantly decreased left ventricular ejection fraction （LVEF） level （P<0.01）， and significantly increased whole blood viscosity at high， medium， and low shear rate （P<0.01）. After 4 weeks of drug intervention， compared with normal group， the rats in model group showed significantly decreased LVEF level （P<0.01）， increased serum NT-pro BNP， TNF-α， IL-1β， and IL-6 levels （P<0.01）， significantly decreased IL-10 level （P<0.01）， and significantly increased protein expressions of ANGPT2， TGF-β1， Smad2， and Smad3 in myocardial tissue （P<0.01）. Compared with model group， Chinese medicine and western medicine groups had increased LVEF level （P<0.01）， decreased levels of serum NT-pro BNP， TNF-α， IL-1β， and IL-6 （P<0.01）， increased IL-10 content （P<0.01）， and decreased protein expressions of TGF-β1， Smad2 and Smad3 in myocardial tissue （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion Coronary ligation can successfully prepare CHF rats of blood stasis pattern， and YXTMF may regulate the mechanism of inflammatory injury and fibrosis by inhibiting the TGF-β/Smads signaling pathway of model rats with CHF of blood stasis pattern.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 TGF-β/Smads signaling pathway; chronic heart failure; blood stasis pattern; Yangxin Tongmai Formula; inflammatory injury; myocardial fibrosis

慢性心力衰竭（chronic heart failure， CHF）是一種發(fā)病率高、病程漫長(zhǎng)、致死率高的疾病，臨床上難以治愈[1-2]。當(dāng)心臟發(fā)生結(jié)構(gòu)病變或功能障礙時(shí)，若病程進(jìn)展未得到及時(shí)有效防治，最終可演變成心力衰竭[3-4]。現(xiàn)代研究表明，CHF的發(fā)病機(jī)制主要與心肌纖維化引起的心室重構(gòu)、炎癥損傷及氧化應(yīng)激反應(yīng)、心肌能量代謝異常、腸道菌群失調(diào)等相關(guān)[5-7]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（tansforming growth factor-β， TGF-β）/Smads信號(hào)通路是目前研究較多的纖維化相關(guān)通路，TGF-β在以炎癥和纖維化為特征的各種疾病的診斷和治療中起關(guān)鍵作用[8]，TGF-β/Smads信號(hào)通路在心血管疾病中扮演著重要角色，對(duì)心血管疾病有著重大影響[9]。

CHF屬于中醫(yī)學(xué)“心痹”“心水”“心悸”“心脹”“喘證”等范疇[10]，后續(xù)病程主要表現(xiàn)為虛實(shí)夾雜之象，氣虛與血瘀貫穿疾病始終，血瘀是中心病理環(huán)節(jié)。臨床研究證實(shí)，血瘀證是CHF主要的證型之一[11]。故中醫(yī)治療CHF主要以補(bǔ)養(yǎng)心氣、和通血脈為原則，以補(bǔ)氣藥、活血藥為基礎(chǔ)，從根本上祛除病根。養(yǎng)心通脈方由袁肇凱教授在名醫(yī)秦伯未先生創(chuàng)制的治療胸痹有效名方[12]基礎(chǔ)上精簡(jiǎn)提煉而成，現(xiàn)方由人參、丹參、桂枝、枳實(shí)、澤瀉組成，能益氣活血化瘀，諸藥相伍共同發(fā)揮養(yǎng)心通脈的作用。臨床上將養(yǎng)心通脈方用于治療CHF取得了良好的治療效果，在西醫(yī)常規(guī)藥物治療的基礎(chǔ)上加用養(yǎng)心通脈方，患者的血清N端前腦鈉肽（N-terminal pro-brain natriuretic peptide， NT-pro BNP）含量更低，中醫(yī)證候療效積分更高，心功能恢復(fù)比僅用西藥治療理想，患者生活質(zhì)量明顯提高[13-14]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)心通脈方可緩解腸道機(jī)械屏障功能障礙、調(diào)節(jié)腸道菌群、防止炎性細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)、抑制心室重構(gòu)、改善心功能等[15-17]。故本課題基于TGF-β/Smads信號(hào)通路探究養(yǎng)心通脈方調(diào)控CHF血瘀證的作用機(jī)制，以期為臨床CHF的中醫(yī)藥防治與規(guī)范用藥提供充足的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和有力支撐。

1 材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從湖南安生美藥物研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)入45只SD雄性大鼠，許可證號(hào)為SYXK（湘）2019-0004，動(dòng)物合格證號(hào)為430727221100257174，體質(zhì)量（200±10） g，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，整體實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)，倫理編號(hào)為L(zhǎng)LBH-202110250001。

1.2? 藥物

養(yǎng)心通脈方（人參10 g，丹參10 g，桂枝10 g，枳實(shí)10 g，澤瀉10 g）中藥超微配方顆粒，批號(hào)分別210412、210747、210551、210355、210312，購(gòu)于湖南春光九匯現(xiàn)代中藥有限公司；纈沙坦膠囊（批號(hào)：H20103521，規(guī)格：80 mg/粒，湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司）；異氟烷麻醉劑（寵物用）（批號(hào)：R510-22，深圳瑞沃德生命科技有限公司）；烏拉坦（批號(hào)：U299635-100，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；生理鹽水（批號(hào)：H10983065，四川科倫股份有限公司）。

1.3? 主要試劑

Masson三色染色試劑盒、HE染色試劑盒[批號(hào)：abs9217、abs9347，愛(ài)必信（上海）生物科技有限公司]；大鼠NT-pro BNP、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10， IL-10）ELISA試劑盒（批號(hào)：ML-E-202205703、ML-E-202205123、ML-E-202206708、ML-E-20225761、ML-E-202205836，上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)：E-BC-K318-M，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；TGF-β1抗體（批號(hào)：AF03634，湖南艾方生物科技有限公司）；ANGPT2抗體（批號(hào)：A11306，武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司）；Smad2、Smad3、GAPDH抗體（批號(hào)：67343-1-Ig、66516-1-Ig、60004-1-Ig，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；蛋白預(yù)制膠（4％～20％）（批號(hào)：F11420Gel，長(zhǎng)沙安吉行生物科技有限公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)：GE2301，美國(guó)皆為爾公司）。

1.4? 主要儀器

R407型小動(dòng)物呼吸機(jī)（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；H1650R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司）；GOWEF680型小動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)（長(zhǎng)沙臨科儀器設(shè)備有限公司）；6LAB型小動(dòng)物超聲儀（北京益仁恒業(yè)科技有限公司）；SA-66OO型血流變測(cè)試儀（北京賽科希德科技發(fā)展有限公司）；RT-6100型多功能酶標(biāo)分析儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；BA410E型研究用三目生物顯微鏡（廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；KD-BM Ⅱ型包埋機(jī)（浙江科迪儀器設(shè)備有限公司）；M199型切片刀（上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）；HM325型石蠟切片機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；YD-A型攤片機(jī)（浙江益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）；DYY-6C型電泳儀電源、DYCZ-24DN型雙垂直電泳儀、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)印電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1? 模型制備與驗(yàn)證

45只成年SD雄性大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法選取27只用于制備CHF血瘀證大鼠模型，其余大鼠分為正常組（12只）和假手術(shù)組（6只）。

采用冠脈結(jié)扎術(shù)[18]進(jìn)行造模：大鼠麻醉后固定于鼠板，常規(guī)消毒備皮。行氣管插管，以小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，呼吸頻率為（70±10）次/min，術(shù)中密切關(guān)注大鼠狀態(tài)，調(diào)節(jié)潮氣量。沿左鎖骨中線在皮膚上做4～5 cm的豎行切口，按肌肉紋理逐層鈍性分離，從第3～4肋間破開(kāi)胸腔，剝離心包膜（注意勿損傷胸腺），找到冠狀動(dòng)脈左前降支，垂直血管走行方向于左心耳下1～2 mm處進(jìn)針并迅速結(jié)扎，肉眼觀察可見(jiàn)結(jié)扎部位下的心肌變白。檢查心臟無(wú)滲血滲液、無(wú)心律失常后關(guān)閉胸腔，逐層縫合。假手術(shù)組大鼠只打開(kāi)胸腔，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。

6周后隨機(jī)抽取正常組、造模組大鼠各6只，檢測(cè)其心電圖、血清NT-pro BNP含量、超聲心動(dòng)圖及血液流變學(xué)指標(biāo)用于模型驗(yàn)證。

2.2? 分組與給藥

冠脈結(jié)扎術(shù)后，運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法從造模組中取18只隨機(jī)分為中藥組、西醫(yī)組和模型組，各6只。通過(guò)人與動(dòng)物等效劑量換算確定各組給藥劑量，中藥組予養(yǎng)心通脈方溶液12 g/kg灌胃[19]（中藥超微顆粒溶解于無(wú)菌生理鹽水），西藥組予纈沙坦溶液0.8 g/kg灌胃（除去膠囊外殼，粉劑溶于無(wú)菌生理鹽水），其他3組大鼠予等量蒸餾水。每日1次，灌胃周期均為4周。

2.3? 樣本收集

2.3.1? 模型驗(yàn)證? 隨機(jī)取造模組、正常組大鼠各6只，冠脈結(jié)扎術(shù)后10 min采集造模組心電圖數(shù)據(jù)，隔日同時(shí)段采集正常組心電圖；造模6周后于呼吸麻醉狀態(tài)下行超聲心動(dòng)圖檢查；腹主動(dòng)脈取血，其中肝素鈉采血管用于血流變檢測(cè)，普通采血管室溫下放置，自然凝固析出分層后離心，取上清液于-80 ℃冰箱中保存。

2.3.2? 取材? 藥物干預(yù)4周結(jié)束后隔日取材。呼吸麻醉后行超聲心動(dòng)圖檢查；用腹主動(dòng)脈采血法進(jìn)行采血，離心后取上清液于-80 ℃冰箱中凍存，用于后續(xù)檢測(cè)；腹主動(dòng)脈取血后打開(kāi)大鼠胸腔，剪取完整心臟，用生理鹽水沖洗出心臟內(nèi)的殘留血液，將各組大鼠心臟浸泡于4％多聚甲醛溶液中保存，用于病理組織學(xué)觀察；并剪取大鼠的左心室與心尖部位組織，放入凍存管中，存放于-80 ℃冰箱備用。

2.4? 檢測(cè)方法

2.4.1? 心電圖? 冠脈結(jié)扎術(shù)后10 min，大鼠仍處于麻醉狀態(tài)，固定后按照“右上—左上—左下—右下—左胸部”的次序連接各導(dǎo)聯(lián)，以PP連線為基線，當(dāng)波形平穩(wěn)后，記錄肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖，關(guān)注心電圖ST段情況及其波形變化。

2.4.2? 超聲心動(dòng)圖? 使用寵物用異氟烷，借助小動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)進(jìn)行呼吸麻醉，將大鼠固定后，脫除心臟周邊毛發(fā)，維持麻醉且狀態(tài)平穩(wěn)時(shí)行超聲心動(dòng)圖檢查，使用M型超聲探頭，取左室長(zhǎng)軸切面，測(cè)量大鼠左心室舒張期內(nèi)徑（left ventricular internal dimension diastole， LVIDd）、左心室收縮期內(nèi)徑（left ventri？鄄

cular internal dimension systole， LVIDs）、左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction， LVEF）和左心室短軸收縮率（left ventricular fraction shortening， LVFS）。

2.4.3? ELISA法檢測(cè)血清NT-pro BNP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量? 于-80 ℃冰箱取出凍存血清樣本，融化后用于檢測(cè)血清NT-pro BNP和TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量，實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書執(zhí)行。

2.4.4? 血液流變學(xué)檢測(cè)? 肝素鈉采血管收集血液樣本，防止血液凝固，使用SA-66OO全自動(dòng)血流變測(cè)試儀檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在血液樣本采集后4 h內(nèi)完成。

2.4.5? 心肌組織病理組織學(xué)觀察? 心臟于4％多聚甲醛中固定，石蠟包埋、切片、HE染色后顯微鏡下觀察心肌組織結(jié)構(gòu)變化；Masson染色后觀察心肌組織纖維化病變情況，并通過(guò)Image J軟件進(jìn)行心肌組織纖維化率分析。

2.4.6? Western blot法檢測(cè)心肌組織TGF-β/Smads通路相關(guān)蛋白表達(dá)? 稱量（75±5） mg心肌組織，加入10×蛋白裂解液、0.1×蛋白酶抑制劑和0.1×磷酸蛋白酶抑制劑，冰上裂解25 min；充分溶解后，離心，取上清液，測(cè)定各蛋白濃度。配制上樣液，95 ℃煮10 min，冷卻后置于-20 ℃條件下保存；上樣量為10 μL，160 V電泳60 min，25 min快速轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉90 min；TBST稀釋一抗[TGF-β1（1∶2 000）、ANGPT2（1∶1 500）、Smad2（1∶6 000）、Smad3（1∶5 000）、GAPDH（1∶8 000）]孵育120 min。TBST洗膜4次，每次8 min；TBST稀釋二抗[Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（1∶10 000）、Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（1∶8 000）孵育90 min；重復(fù)洗膜操作；使用ECL高效化學(xué)發(fā)光顯影液，于凝膠成像系統(tǒng)中成像并保存；使用Image Lab、Image J軟件進(jìn)行后續(xù)分析，計(jì)算各指標(biāo)相對(duì)表達(dá)量（指標(biāo)相對(duì)表達(dá)量=指標(biāo)灰度值/GAPDH灰度值）。

2.5? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以“ｘ±s”表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0軟件，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPad Prism 8.0軟件繪制圖表。

3 結(jié)果

3.1? CHF血瘀證大鼠成模情況

3.1.1? 心電圖? 大鼠行冠脈結(jié)扎術(shù)后10 min行心電圖檢查發(fā)現(xiàn)，造模組大鼠ST段明顯抬高，心率加快，為350～450次/min。詳見(jiàn)圖1。

3.1.2? 超聲心動(dòng)圖? 冠脈結(jié)扎術(shù)后6周，與正常組比較，造模組大鼠LVIDd、LVIDs水平明顯上升（P＜0.01），LVEF、LVFS水平顯著下降（P＜0.01）。詳見(jiàn)表1。

3.1.3? 血清NT-pro BNP含量和血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)? 冠脈結(jié)扎術(shù)后6周，與正常組比較，造模組血清NT-pro BNP含量明顯增多（P＜0.01），全血高切黏度、中切黏度、低切黏度顯著升高（P＜0.01）。詳見(jiàn)表2。

3.2? 各組大鼠病理組織學(xué)觀察結(jié)果

3.2.1? HE染色結(jié)果? 正常組、假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，未見(jiàn)病理性改變；與正常組比較，模型組心肌細(xì)胞形態(tài)大小不等，排列紊亂，各結(jié)構(gòu)之間界限模糊，心肌細(xì)胞間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，伴有大量纖維結(jié)締組織增生；與模型組比較，中藥組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)，細(xì)胞間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，西藥組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)良好，但細(xì)胞間質(zhì)仍有部分纖維結(jié)締組織增生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。詳見(jiàn)圖2。

3.2.2? Masson染色結(jié)果? 正常組、假手術(shù)組大鼠心肌組織中無(wú)纖維化改變；與正常組比較，模型組大鼠心肌組織中大量膠原蛋白沉積，心肌纖維化率升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組大鼠心肌組織中膠原蛋白沉積明顯減少，心肌纖維化率降低（P＜0.01），西藥組大鼠心肌纖維化率降低（P＜0.01）。詳見(jiàn)圖2、表3。

3.3? 各組大鼠超聲心動(dòng)圖情況

與正常組比較，模型組大鼠LVIDd、LVIDs水平顯著上升（P＜0.01），LVEF、LVFS水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，中藥組、西藥組LVIDd和LVIDs水平均下降（P＜0.05或P＜0.01），LVEF、LVFS水平明顯上升（P＜0.01）。詳見(jiàn)表4。

3.4? 各組大鼠血清NT-pro BNP和相關(guān)炎癥因子比較

與正常組比較，模型組大鼠血清NT-pro BNP含量明顯增多（P＜0.01），TNF-α、IL-1β及IL-6水平顯著上升（P＜0.01），IL-10水平明顯下降（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組和西藥組NT-pro BNP含量減少（P＜0.01），血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平下降（P＜0.01），IL-10水平明顯上升（P＜0.01）。詳見(jiàn)表5。

3.5? 各組大鼠心肌組織TGF-β/Smads通路相關(guān)蛋白比較

與正常組比較，模型組大鼠心肌組織ANGPT2、TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)均升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組、西藥組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)下降（P＜0.05或P＜0.01）。詳見(jiàn)圖3—4。

4 討論

CHF是一類以呼吸困難、運(yùn)動(dòng)耐力明顯下降為主要癥狀的難治性心血管疾病，炎癥損傷機(jī)制是其最主要的發(fā)病機(jī)制之一，炎癥損傷往往會(huì)導(dǎo)致心血管系統(tǒng)的功能障礙，嚴(yán)重者甚至?xí)l(fā)器質(zhì)性損害，全身性炎癥在CHF中很常見(jiàn)[20]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為CHF發(fā)病伊始多因心氣虛、心陽(yáng)虛，隨著病程發(fā)展，在此基礎(chǔ)上，瘀血、痰飲、水濕等病理產(chǎn)物在體內(nèi)堆積，阻滯心脈，加重CHF病情，形成惡性循環(huán)。養(yǎng)心通脈方可扶養(yǎng)心氣、和通血脈，方中人參、丹參常用于心血管疾病中藥處方，魏佳明等[21]發(fā)現(xiàn)，丹參、人參等藥物使用頻次居于中醫(yī)治療CHF用藥頻次前列，且CHF治療中使用頻次較高的藥物大多都具有益氣活血化瘀的功效。

炎癥因子可通過(guò)多種途徑參與CHF的病變過(guò)程[22]，炎癥反應(yīng)系統(tǒng)的激活促使心肌纖維化加快，造成不可逆的心室重塑。炎癥因子TNF-α是反映CHF病情嚴(yán)重程度的一個(gè)典型指標(biāo)，CHF患者血漿中TNF-α含量明顯增多[23]；IL-1β可進(jìn)入全身血液循環(huán)，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，還可引起心肌纖維化，導(dǎo)致心室重構(gòu)；IL-6是早期反映CHF的一個(gè)極為敏感的指標(biāo)，與CHF的預(yù)后密切相關(guān)，其含量與血清NT-pro BNP含量呈正相關(guān)，與LVEF呈負(fù)相關(guān)[24]；TNF-α、IL-1β、IL-6在CHF病程中均發(fā)揮促炎作用，IL-10為抗炎因子，其血清含量水平與CHF病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，CHF血瘀證大鼠經(jīng)養(yǎng)心通脈方干預(yù)4周后，血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著降低，IL-10生成明顯增多，證明養(yǎng)心通脈方能改善CHF血瘀證大鼠炎癥損傷。

TGF-β存在于人體各種組織細(xì)胞中，是典型的促心肌纖維化因子[26]，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，密切參與人體胚胎發(fā)育、生殖細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)[27]。TGF-β下游信號(hào)蛋白分子主要為Smads蛋白，Smads家族可介導(dǎo)TGF-β的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中以Smad2、Smad3為最主要的正反饋轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白分子，在TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化中起重要作用[28-29]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)，在組織受傷后被激活，促使炎癥因子IL-1和TNF-α等釋放，活化后的炎癥因子又可加速TGF-β1的分泌，還可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌，促使纖維結(jié)締組織增生[30]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)得到控制后，TGF-β1含量下降，其對(duì)炎癥因子的生物學(xué)活性減弱，此時(shí)TGF-β/Smads信號(hào)通路中發(fā)揮傳導(dǎo)作用的下游分子以Smad6、Smad7為主，而這兩者屬于抑制性Smads，TNF-α等炎癥細(xì)胞因子隨之減少，此時(shí)TGF-β1則表現(xiàn)為抗炎作用[31]。除影響炎癥反應(yīng)和心肌纖維化外，TGF-β還可與Ang Ⅱ形成工作網(wǎng)影響心室重構(gòu)，當(dāng)心肌損傷或心臟負(fù)荷過(guò)重時(shí)，TGF-β/Smads通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是心室重構(gòu)的重要機(jī)制之一[32]。TGF-β1過(guò)量表達(dá)會(huì)引起心肌肥厚和心肌纖維化，TGF-β1參與心室重構(gòu)發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程[33]。Ang Ⅱ在增加TGF-β1基因表達(dá)的同時(shí)，還會(huì)抑制TGF-β1降解，使得TGF-β1含量更高[34]，誘發(fā)心室肥厚[35]；心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞TGF-β1表達(dá)上調(diào)，Smad2、Smad3表達(dá)下調(diào)[36]，抑制TGF-β/Smads通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或可成為減輕心室重構(gòu)、防止心力衰竭疾病發(fā)生發(fā)展的有效切入點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，CHF血瘀證大鼠心肌組織中TGF-β/Smads信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)明顯上調(diào)；經(jīng)過(guò)養(yǎng)心通脈方干預(yù)后，其TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白水平下降，證明養(yǎng)心通脈方能調(diào)控TGF-β/Smads信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，有效緩解心肌纖維化，降低心室重構(gòu)，改善炎癥損傷，促使CHF血瘀證大鼠心功能恢復(fù)。

綜上所述，TGF-β/Smads信號(hào)通路活化可激活機(jī)體炎癥反應(yīng)系統(tǒng)，促使心肌纖維化，加快心室重構(gòu)，導(dǎo)致心力衰竭。養(yǎng)心通脈方可通過(guò)抑制TGF-β/Smads信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，有效降低心肌纖維化程度，改善CHF血瘀證模型大鼠的炎癥損傷，緩解心力衰竭病情進(jìn)展并促使心功能恢復(fù)。本研究將為CHF臨床中醫(yī)藥防治提供較好的參考意義和科學(xué)依據(jù)。

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（本文編輯? 周? 旦）