◎ 關(guān)松梅，楊吉祥，柴瓏瓏，王 品

（青島元信檢測(cè)技術(shù)有限公司，山東 青島 266000）

我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展呈現(xiàn)出穩(wěn)步向前推進(jìn)的態(tài)勢(shì)，在此背景下，我國(guó)畜牧行業(yè)發(fā)展迅速，人們對(duì)畜牧產(chǎn)品的需求也在不斷提升[1]。在畜牧養(yǎng)殖過(guò)程中，獸藥的合理應(yīng)用對(duì)保障動(dòng)物源性食品安全具有重要作用。在畜牧養(yǎng)殖過(guò)程中，獸藥使用不合理的現(xiàn)象層出不窮，獸藥的濫用易使畜牧產(chǎn)品遭受嚴(yán)重污染，藥物經(jīng)代謝進(jìn)入動(dòng)物源性食品中，之后可通過(guò)食物鏈在人體蓄積，不僅能使人體產(chǎn)生抗藥性、引起過(guò)敏反應(yīng)、影響腸道內(nèi)菌群，還能導(dǎo)致中毒等不良反應(yīng)。使用獸藥不合理、濫用獸藥等問(wèn)題嚴(yán)重威脅畜禽產(chǎn)品食用者的生命健康[2-6]。因此，動(dòng)物源性食品中的獸藥殘留引起了廣泛關(guān)注。

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對(duì)食品安全性的要求越來(lái)越高。動(dòng)物源性食品是人們餐桌上的必需品，檢測(cè)獸藥殘留是保障動(dòng)物源性食品安全的必要手段。目前，我國(guó)在畜牧養(yǎng)殖方面有近百種獸藥在投入使用，使用較多的獸藥有四環(huán)素類[7-8]、β-受體激動(dòng)劑類[9]、磺胺類[10-12]、喹諾酮類、硝基咪唑類和氯霉素類等，主要使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)[13-15]。這些獸藥殘留大部分都有相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，但每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大都只檢測(cè)其中的一類或者一類中的幾種獸藥殘留。這無(wú)疑大大增加了檢測(cè)工作的難度，因此建立及優(yōu)化能同時(shí)檢測(cè)多種獸藥殘留的方法將會(huì)極大提升日常檢測(cè)工作的質(zhì)量和效率，對(duì)降低人力、物力及時(shí)間成本大有益處。

選取豬肉、雞肉、雞蛋、牛肉、蝦、淡水魚和海水魚等7 種基質(zhì)，通過(guò)多獸藥殘留凈化柱凈化提取，經(jīng)過(guò)高效液相色譜質(zhì)譜儀檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)多種獸藥殘留同時(shí)提取、同時(shí)上機(jī)檢測(cè)，可彌補(bǔ)常規(guī)檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)，具備高效、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可用于快速篩查高風(fēng)險(xiǎn)樣品，為我國(guó)動(dòng)物源性食品安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

6470B-1290 型高效液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品；電子天平，卓精公司產(chǎn)品；CPA225D 型分析天平，sartorius 公司產(chǎn)品；FM-40 低速離心機(jī)，蜀科儀器公司產(chǎn)品；多管渦旋混合振蕩器，MIULAB 公司產(chǎn)品；KQ-500DB 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 材料與試劑

甲醇：色譜純，默克公司產(chǎn)品；乙腈：色譜純，莫克公司產(chǎn)品；甲酸：色譜純，科密歐試劑公司產(chǎn)品；水：娃哈哈純凈水。

標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺類和喹諾酮類混合標(biāo)準(zhǔn)品，北京壇墨公司產(chǎn)品，純度為95%；β 受體激動(dòng)劑混合標(biāo)準(zhǔn)品，北京壇墨公司產(chǎn)品，純度為97%；四環(huán)素類混合標(biāo)準(zhǔn)品，北京壇墨公司產(chǎn)品，純度為95%；氯霉素類緩和標(biāo)準(zhǔn)品，北京壇墨公司產(chǎn)品，純度為97%；硝基咪唑類標(biāo)準(zhǔn)品、沙丁胺醇-D3、萊克多巴胺-D6、克倫特羅-D9、氯霉素-D5 均購(gòu)于北京壇墨公司或北京曼哈格公司，純度均大于95%。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 液相條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse C18柱（2.1 mm 50 mm，1.8 μm）；流速：0.300 mL·min-1；進(jìn)樣量：2.0 μL；柱溫：30 ℃。流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A）和乙腈（B），梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子模式（ESI+、ESI-）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；氣流速：3 mL·min-1；離子源溫度：300 ℃；霧化氣、鞘氣為普通氮?dú)?，碰撞氣為高純氮?dú)猓褂们罢{(diào)節(jié)各氣體流量使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測(cè)要求。定性、定量離子及對(duì)應(yīng)的碎裂電壓和碰撞能量?jī)?yōu)化到最佳參數(shù)。質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品的前處理

準(zhǔn)確稱取豬肉、雞肉、雞蛋、海水魚、海水蝦、淡水魚和牛肉5.0 g（精確至0.01 g）于50 mL 具塞離心管中，加入同位素內(nèi)標(biāo)和84%乙腈水溶液6.00 mL（含2%甲酸），渦旋10 min，超聲提取30 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r·min-1離心5min，上清液全部過(guò)多獸殘凈化柱，渦旋10 min，4 000r·min-1離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm 濾膜，供高效液相色譜質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

將磺胺類和喹諾酮類混合標(biāo)準(zhǔn)品、四環(huán)素類混合標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成1 000 ng·mL-1；β 受體激動(dòng)劑混合標(biāo)準(zhǔn)品、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品、硝基咪唑類標(biāo)準(zhǔn)品、沙丁胺醇-D3、萊克多巴胺-D6、克倫特羅-D9、氯霉素-D5均配制成100 ng·mL-1。將豬肉、雞肉、牛肉、雞蛋、蝦、淡水魚和海水魚等基質(zhì)經(jīng)上述前處理過(guò)程提取后，配制成基質(zhì)混合標(biāo)曲，其中磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類配制成5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1，β受體激動(dòng)劑類、氯霉素類、硝基咪唑類配制成0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和10.0 ng·mL-1，內(nèi)標(biāo)加入10 μL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取試劑的選擇

提取試劑對(duì)多種獸藥殘留的回收率、目標(biāo)峰出現(xiàn)時(shí)間以及峰形都有重要影響。日常檢測(cè)獸藥殘留的數(shù)據(jù)顯示，常用的提取試劑為甲醇或乙腈，經(jīng)查閱文獻(xiàn)了解到甲醇會(huì)提取過(guò)多的脂肪，降低大多數(shù)獸藥殘留的回收率，而乙腈溶解性好、滲透強(qiáng)，能夠沉淀蛋白并且不會(huì)提取過(guò)多脂肪，乙腈作為提取試劑的加標(biāo)回收率較高[16]。但是蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中會(huì)凝結(jié)成團(tuán)，在提取試劑中加入適量的純水，可減少乙腈比例以及減慢均質(zhì)成團(tuán)現(xiàn)象。多數(shù)待測(cè)物中含有堿性基團(tuán)，甲酸為其提供酸性環(huán)境，與堿性基團(tuán)形成有機(jī)鹽，可進(jìn)一步提高回收率[17-18]。因此選擇70%、84%、90%乙腈水進(jìn)行提取，結(jié)果顯示84%乙腈水回收率最高。選擇84%乙腈水含0.2%甲酸、1%甲酸、2%甲酸，結(jié)果顯示84%乙腈水溶液（含2%甲酸）整體回收率在60%～120%。

2.2 凈化柱

不同基質(zhì)的多獸藥殘留檢測(cè)多采用固相萃取柱，但該凈化操作較為復(fù)雜，且時(shí)間較長(zhǎng)，本方法采用一種新的多獸藥殘留凈化柱，簡(jiǎn)單方便易操作。將不同基質(zhì)的樣品用84%乙腈水（含2%甲酸）提取過(guò)濾后直接用高效液相色譜質(zhì)譜儀檢測(cè)和用84%乙腈水（含2%甲酸）提取過(guò)濾后過(guò)多獸藥殘留凈化柱再用高效液相色譜質(zhì)譜儀檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不經(jīng)過(guò)凈化柱的雞蛋中的氯霉素基本無(wú)回收，牛肉中β 受體激動(dòng)劑類基本無(wú)回收，經(jīng)過(guò)凈化柱凈化后，所有基質(zhì)的整體回收率均在60%～120%。凈化柱可去掉大部分雜質(zhì)，改善目標(biāo)峰的峰形，提高回收率。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

采用LC-MS/MS 分析樣品，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果的準(zhǔn)確性有著極大的影響?；|(zhì)效應(yīng)是指在樣品測(cè)定過(guò)程中，基質(zhì)存在導(dǎo)致目標(biāo)物響應(yīng)產(chǎn)生變化的現(xiàn)象[19]。為檢測(cè)基質(zhì)效應(yīng)的影響，分別采用空白基質(zhì)曲線及相應(yīng)含量溶劑曲線，在相同的儀器條件下，比較空白基質(zhì)曲線和溶劑曲線目標(biāo)化合物的離子強(qiáng)度進(jìn)而評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)[19]。結(jié)果顯示，所有基質(zhì)中除了環(huán)丙沙星、恩諾沙星、磺胺甲惡唑和磺胺甲基咪定為基質(zhì)增強(qiáng)外，其余均為基質(zhì)抑制，所以該方法采用基質(zhì)標(biāo)曲和內(nèi)標(biāo)定量的方法來(lái)對(duì)抗基質(zhì)效應(yīng)。氯霉素、克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺添加內(nèi)標(biāo)，所有化合物均采用基質(zhì)標(biāo)曲進(jìn)行定量，可有效降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.4 檢出限、定量限及準(zhǔn)確度的測(cè)定

在空白豬肉、雞肉、牛肉、蝦、淡水魚、雞蛋和海水魚中分別做標(biāo)準(zhǔn)中定量限的1 倍、2 倍、10 倍加標(biāo)，每個(gè)水平做6 個(gè)平行樣品，按照上述前處理方法和液相質(zhì)譜條件進(jìn)行提取凈化和上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果表明各化合物的定量限均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，加標(biāo)回收率均在70%～120%，相對(duì)偏差RSD 均小于10%，證明本方法的準(zhǔn)確性良好。檢出限、定量限見表3。

表3 檢出限、定量限表

3 結(jié)論

建立了高效液相色譜質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)35 種獸藥殘留的方法，該方法較現(xiàn)在發(fā)布實(shí)施的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)具有更簡(jiǎn)單、高效的特點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)檢測(cè)多種獸藥殘留，可縮短檢測(cè)周期，可用于食品檢測(cè)領(lǐng)域的快速篩查，為食品安全保駕護(hù)航。