◎ 付 輝，張美娟，王幸幸，覃冬梅，王炳志，楊星星

（1.深圳市易瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東 深圳 518101；2.深圳市通量檢測科技有限公司，廣東 深圳 518038）

多效唑（Paclobutrazol，PBZ）是一種可提高作物產(chǎn)量的植物生長調(diào)節(jié)劑。三唑酮（Triadimefon，TIN）是一種效率高、有毒、殘留量低、效果持久的三唑類殺菌劑。三唑醇（Triadimenol，TIL）是具有一定毒性殺菌劑，適用于防治麥類黑穗病、白粉病、銹病以及玉米、高粱等的絲黑穗病。目前常用的農(nóng)藥殘留檢測方法主要有液相色譜、氣相色譜、液相色譜-質(zhì)譜光譜分析和氣相色譜-質(zhì)譜。但這些技術(shù)需要昂貴的實驗室儀器、訓練有素的操作人員和特定的實驗室環(huán)境。因此，建立一種簡單、靈敏且有效的農(nóng)產(chǎn)品中三唑類農(nóng)藥的檢測方法迫在眉睫。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

XYZ3020 三維劃膜噴金儀（杭州峰航科技有限公司）、DA-72AUTO 全自動切條機（BIODOT 有限公司）、智能數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司），相關(guān)抗原和抗體由深圳市易瑞生物技術(shù)股份有限公司自制。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備標記材料

稱取100 mL 一級水于圓底燒瓶，置于磁力攪拌水浴鍋中（100 ℃，700 r·min-1）攪拌加熱至約100 ℃[1]。加入4 mL 1%氯金酸溶液，加熱攪拌直至二次沸騰，迅速將4.6 mL 1%檸檬酸三鈉加入沸騰后的溶液，8 min 后停止反應，攪拌至室溫，轉(zhuǎn)入干燥房中于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標記最適pH 值篩選

膠體金pH 的調(diào)節(jié)采用K2CO3溶液進行，用1 μg·mL-1的K2CO3溶液將6 mL 金標溶液的pH 分別調(diào)成6、7、8 和9，放置一段時間后添加100 μL 的10%牛血清蛋白溶液，離心后取上清進行吸光度測定來確定最佳pH 值[2]。

1.2.3 最適抗體標記濃度篩選

分別配制濃度為3 μg·mL-1和4 μg·mL-1的3 種抗體，與1 mL 制備好的金溶液振蕩混勻，加入10%牛血清蛋白溶液共100 μL 進行封閉，靜置1 min 后，離心30 min（12 000 r·min-1），棄上清后將沉淀用保存液重懸保存[3]。

1.2.4 抗原、二抗最適濃度篩選

T 線抗原濃度分別設(shè)置為1.2 mg·mL-1、0.9 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1和0.3 mg·mL-1，C 線二抗?jié)舛仁冀K固定為1.2 mg·mL-1，將不同濃度的抗原和二抗進行膠體金試紙條檢測，最終確定最佳組合[4]。

1.2.5 制備膠體金標記抗體蛋白

用K2CO3溶液將膠體金調(diào)節(jié)至合適的pH 值，加入抗體，混勻后室溫下靜置反應10 min 標記。加入適量10%牛血清蛋白溶液對膠體金上未結(jié)合抗體的位點進行封閉，混勻30 s 后室溫下靜置反應15 min。封閉后離心15 min（4 ℃，12 000 r·min-1），棄去上清并加入一定體積的金子保護劑與金標復溶液進行重懸，得金標抗體溶液（濕金），并以一定體積分裝于酶標微孔中，冷凍干燥后得到金標抗體（干金）。

1.2.6 制備試紙條

膠體金免疫層析試紙條由聚氯乙烯（Polyvinyl Chloride，PVC）底板、樣品墊、硝酸纖維膜（Nitrocellulose Filter Membrane，NC 膜）和吸水墊組成。其中，NC 膜貼在PVC 底板的中部，用劃膜儀將經(jīng)過抗原稀釋液稀釋后的包被抗原和二抗噴涂固定在NC 膜上分別作為T 線與C 線，于37 ℃烘箱中過夜烘干[5]。樣品墊經(jīng)過樣品墊處理液浸泡處理后于37 ℃過夜烘干，裁切后貼在底板的下端，覆蓋NC 膜1 ～2 mm。吸水墊裁切后貼在底板的上端，覆蓋NC 膜1 ～2 mm。最后用切條機切成4 mm 寬的試紙條，與干燥劑一起密封裝入鋁箔袋中，室溫干燥保存，備用。

1.2.7 試紙條實用性檢測

樣品經(jīng)過前處理后，吸取上層清液直接用試紙條進行樣品檢測。

1.2.8 試紙條特異性檢測

取9 種PBZ、TIN 及TIL 結(jié)構(gòu)類似物烯效唑、已唑醇、戊唑醇、腈菌唑、烯唑醇、雙苯三唑醇、氟硅唑、丙環(huán)唑和苯醚甲環(huán)唑，每個樣品測量3 次，觀察是否與金標抗體有反應。

2 結(jié)果與分析

2.1 試紙條的條件優(yōu)化

2.1.1 鑒定標記材料質(zhì)量

本次研發(fā)中所自主制備的膠體金溶液呈紫紅色，透明且澄清，無沉淀和絮狀物，自主研發(fā)的金溶液質(zhì)量好，其顆粒大小均一。

2.1.2 確定最適pH 值

隨著pH 值的提高，通過圖1 可知，當膠體金溶液的pH 值為8 時，陰性的T/C 比例最高，且陽性的T/C 最低，表明該濃度K2CO3下陰性的表現(xiàn)得更穩(wěn)定，故確定pH=8 為PBZ、TIN 及TIL 的最適pH 值。

圖1 pH 值對膠體金的影響圖

2.1.3 確定最適抗體標記濃度

由表1 可知，PBZ 的抗體標記濃度為3 μg·mL-1時，濃度在3 ng·mL-1的標準品，T 線顯色不明顯，所以在3 ng·mL-1的標準品濃度下無法檢出；當抗體濃度達到4 μg·mL-1，標準品濃度為3 ng·mL-1時，T 線不顯色，則PBZ 可以檢出，所以PBZ 的最適標記濃度為4 μg·mL-1，則PBZ 可選擇最優(yōu)抗體濃度為4 μg·mL-1，3 ng·mL-1為其最低檢出限，同理可得，TIN 及TIL的最適抗體濃度標記分別為3 μg·mL-1、4 μg·mL-1，3 ng·mL-1及 6 ng·mL-1分別為TIN 和TIL 的最低檢出限。綜上，本實驗PBZ 及TIL 的最優(yōu)抗體濃度為4 μg·mL-1，TIN 最優(yōu)抗體濃度為3 μg·mL-1。

表1 3 種抗體濃度試紙條的T 線、C 線顯色統(tǒng)計表

2.1.4 抗原、二抗最適濃度篩選

隨著抗原濃度的增加，標準線顯色效果顯著變?nèi)?；陰性試紙條的T 線顯色信號隨著抗原濃度的降低而升高，當抗原濃度為0.2 mg·mL-1時，表現(xiàn)出可接受的顯色強度和最高的抑制率。因此，選擇0.2 mg·mL-1作為檢測線最佳抗原濃度；當紙條T 線濃度為0.2 mg·mL-1，C 線為1.2 mg·mL-1時，沒有假陰出現(xiàn)，靈敏度好，故確定該條件為最適本實驗條件。

2.2 樣品前處理優(yōu)化

在陶瓷的勻漿中加入9 g 樣品（芹菜或韭菜）、乙腈5 mL、硫酸鎂3 g 進行混合。將所得混合溶液加入大離心管中，劇烈搖晃一段時間，離心5 min（4 200 r·min-1）。取上清液在室溫中氮吹至十分干燥。重懸在鹽溶液中，得到芹菜或韭菜樣品提取物用于試紙條檢測樣品溶液。

2.3 樣品檢測

移取樣品液于小型酶標孔中，吹打、靜置后全部轉(zhuǎn)移至新的微孔，在加樣后開始計時，3 min 反應結(jié)束后判讀，超過15 min 為無效判讀。對樣品進行前處理后檢測，樣品重復檢測3 次。圖2 為PBZ、TIN 及TIL 的樣品檢測結(jié)果。

圖2 PBZ（左一）、TIN（中間）及TIL（右一）的樣品檢測結(jié)果圖

由圖2 可知，隨著待測樣品加標品濃度的提升，T 線由強變?nèi)酰揖? ng·mL-1濃度，陽性T 線弱于陰性，達到檢出標準，故待測樣品加標品濃度分別為5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1均能檢出，達到了《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763 2021）中三唑酮、三唑醇和多效唑在果蔬中的最低檢測要求，為以后研發(fā)此類農(nóng)藥膠體金產(chǎn)品提供了前瞻性研究。

2.4 特異性檢測

本研究選取9 種結(jié)構(gòu)類似物烯效唑、已唑醇、戊唑醇、腈菌唑、烯唑醇、雙苯三唑醇、氟硅唑、丙環(huán)唑和苯醚甲環(huán)唑，分別添加200 ng·mL-1標準品進行檢測，如圖3 結(jié)果顯示T 線均顯色且顏色較深，說明這幾個藥物與抗體沒有交叉反應。

圖3 特異性檢測圖（標準品濃度為200 ng·mL-1）

3 結(jié)論

建立了一種用于農(nóng)產(chǎn)品中PBZ、TIN 及TIL 的檢測。采用快速、廉價、有效的QuEChERS 方法對樣品進行預處理前處理優(yōu)化，研發(fā)了檢測PBZ、TIN及TIL 的試紙條，該試紙條成本更低，特異性好，檢測后3 ～8 min 就能夠進行視覺檢測，符合《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763 2021）的相關(guān)要求，因此非常適合在大批量的現(xiàn)場快速篩查中推廣使用。