梁景文，朱國柱，羅澤君，姜學(xué)涯，苑婷婷

(深圳凱吉星農(nóng)產(chǎn)品檢測認(rèn)證有限公司，廣東 深圳 518000)

引 言

甲拌磷是上世紀(jì)50年代由美國氰胺公司開發(fā)研制的一種高效有機磷殺蟲劑，因其高性價比特性而被廣泛用于害蟲防治方面[1]。在自然條件下，甲拌磷經(jīng)過氧化反應(yīng)會代謝為甲拌磷砜和甲拌磷亞砜[2]。由于甲拌磷及其代謝物的高毒性，對人體傷害大，已被國家禁用，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第536號[3]自2022年9月1日起，撤銷甲拌磷原藥及制劑產(chǎn)品的農(nóng)藥登記，禁止生產(chǎn)。目前我國農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)GB 2763[4]規(guī)定肉類中甲拌磷的限量為0.02 mg/kg，其檢測方法參照GB/T 23210[5]規(guī)定的方法測定，而GB/T 23210適用于牛奶和奶粉中農(nóng)藥的測定，并不適用于肉類中農(nóng)藥的測定。因此針對營養(yǎng)豐富備受人們喜愛的牛肉這一食用農(nóng)產(chǎn)品，建立一種甲拌磷及其代謝物殘留量的檢測分析方法具有重要的實際應(yīng)用價值。

目前檢測甲拌磷及其代謝物的主要方法有：熒光光度法[6]、氣相色譜法[7]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、液相色譜法[9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]等。其中熒光光度法、氣相色譜法和液相色譜法存在基質(zhì)干擾較大，靈敏度低等缺點，氣相色譜-質(zhì)譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法存在前處理繁瑣，檢測時間較長等缺點。目前我國尚未發(fā)布有關(guān)牛肉中甲拌磷及其代謝物檢測方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，因而急需建立一種實用且快速檢測牛肉中甲拌磷及其代謝物的分析方法，滿足食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的限量規(guī)定以及行業(yè)的訴求。本研究采用QuEChERS技術(shù)同時結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，開發(fā)一種適用于牛肉中甲拌磷及其代謝物的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料 AB SCIEX QUAD 5500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀；離心機；Millipore Q純水機；MS 3 basic旋渦振蕩器；移液槍；QuEChERS鹽包、QuEChERS凈化管、0.22 μm有機濾膜；牛肉樣品。

甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜(純度≥98%)；甲醇、乙腈(色譜純)；甲酸、乙酸(分析純)；乙酸銨(分析純)。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別準(zhǔn)確稱取甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜各10.0 mg，用甲醇溶解并稀釋至100 mL，搖勻，制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，-18℃避光保存，有效期3個月。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：分別準(zhǔn)確吸取甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液各1 mL，用甲醇稀釋至10 mL，搖勻，制成10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，再次準(zhǔn)確吸取10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液1 mL，用甲醇稀釋至10 mL，搖勻，制成1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，0℃～4℃避光保存，有效期1個月。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取10、20、50、100、200 μL上述1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用甲醇稀釋至 1 mL，得到質(zhì)量濃度分別為10、20、50、100、200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，臨用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理 稱取10 g(精確至0.01 g)制備好的試樣置于50 mL離心管中，加入20 mL 含1%乙酸的乙腈溶液提取分離，-18℃冷凍放置20 min；加入QuEChERS鹽包迅速振搖至不發(fā)熱，5 000 r/min離心2 min。取上層液6 mL至15 mL 的QuEChERS凈化管中，渦旋3 min；5 000 r/min離心2 min，上清液供分析。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3(2.1 mm×150 mm，3 μm)，柱溫：40℃；流動相A：10 mmol/L乙酸銨(加0.1%甲酸)溶液；流動相B：甲醇；流速：0.3 mL/min；進樣體積：5.0 μL；梯度洗脫程序(表1)。

表1 梯度洗脫程序

1.2.4 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)；掃描模式：正離子模式；電離電壓：5 500 V；霧化溫度：550℃；噴霧氣：50 psi；輔助加熱氣：50 psi；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)；甲拌磷及其代謝物定性定量離子對及去簇電壓、碰撞能量(表2)。

表2 甲拌磷及其代謝物定性定量離子對及去簇電壓、碰撞能量

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器工作條件的選擇

2.1.1 色譜條件 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中多農(nóng)殘時常用含無機酸的無機鹽溶液和甲醇溶液作為流動相[11]，經(jīng)過多次試驗，選擇的流動相見1.2.3節(jié)，在此條件下，甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜均能得到有效分離，且色譜峰峰形良好。

2.1.2 質(zhì)譜條件 甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜屬于磷酸酯類小分子農(nóng)藥，分子量為260.38、276.37、292.38，因此本試驗采用傳統(tǒng)的小分子質(zhì)譜離子對優(yōu)化方法電離其碎片離子對。通過優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量，得到甲拌磷及其代謝物響應(yīng)最佳的一對離子對用于定性定量分析(表2)，其中甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜的母離子均帶單電荷。

2.2 前處理條件的選擇

2.2.1 萃取溶劑的優(yōu)化 由于牛肉中含有豐富的蛋白質(zhì)，在進行上機檢測前需要去除蛋白，而甲拌磷及其代謝物的極性較強，易溶于甲醇、乙腈等有機溶劑，同時有機溶劑具有使牛肉中的蛋白質(zhì)變性發(fā)生沉淀的效果[12]，因此本試驗考察甲醇和乙腈作提取試劑進行分析。結(jié)果表明：當(dāng)選擇乙腈作為提取試劑，待測牛肉中蛋白質(zhì)去除的效果較好，但是甲拌磷及其代謝物的提取效率不高，而當(dāng)選擇含有1%乙酸的乙腈溶液作為提取試劑時，不僅牛肉蛋白質(zhì)去除效果較好，且提取效率>75%，這是因為甲拌磷及其代謝物在酸性條件下穩(wěn)定不易分解。因此本試驗選擇含有1%乙酸的乙腈溶液作為提取試劑。

2.2.2 凈化方法的優(yōu)化 QuEChERS樣品前處理方法，具有操作簡便、處理速度快且溶劑消耗量少等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境和土壤污染物檢測中[13，14]。因此本試驗采用高效的QuEChERS萃取鹽包及凈化管，通過簡單的離心操作，將甲拌磷及其代謝物與牛肉樣品中的干擾組分(如脂肪酸、色素、脂類等)分離。QuEChERS萃取鹽包中MgSO4用于除去樣品中的水分，其他緩沖鹽可調(diào)節(jié)樣品溶液pH值，確保對堿性敏感的農(nóng)藥也有較好的回收率。由于加入萃取鹽包后會放出大量熱，導(dǎo)致甲拌磷及其代謝物分解，因此需在-18℃冷凍放置20 min后再加入鹽包迅速振搖至不發(fā)熱，這樣可以確保提高甲拌磷及其代謝物的回收率。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng) 分別用空白樣品溶液和含1%乙酸的乙腈溶液配制的10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以各標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值與1的差值作為基質(zhì)效應(yīng)值[15]，以考察基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果(表3)。

表3 甲拌磷及其代謝物的基質(zhì)效應(yīng)

表4 甲拌磷及其代謝物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

由表3可知：牛肉基質(zhì)對甲拌磷及其代謝物存在較強的基質(zhì)抑制效應(yīng)，為了降低基質(zhì)的影響，試驗采用基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 線性范圍、檢出限和定量限 準(zhǔn)確移取1 μg/mL適量甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加到10.00 g空白樣品中，濃度為10、20、50、100、200 ng/mL的各系列空白添加試料，在上述液相色譜和質(zhì)譜條件下測定，以峰面積為縱坐標(biāo)Y，化合物濃度為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。研究結(jié)果表明，甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜在質(zhì)量濃度 10～200 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r為 0.998 8～0.999 5，檢出限為 3 ng/mL，定量限為10 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)色譜圖(圖1)。

圖1 甲拌磷及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

2.3.3 回收率和精密度 選取空白樣品，分別添加 3 個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度水平制備 6 個平行樣品進行添加回收率，在添加濃度范圍內(nèi)，甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜的回收率為77.2%～93.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 1.8%～6.2%，能夠滿足檢測方法的要求，結(jié)果(表5)。

表5 精密度和回收試驗結(jié)果(n=6)

2.4 實際樣品測定 采用本研究建立的方法檢測深圳農(nóng)貿(mào)市場購買的20個牛肉樣品，其中甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜均未檢出。

3 結(jié)論

本研究建立了QuEChERS技術(shù)同時結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛肉中甲拌磷及其代謝物殘留的分析方法，甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜在質(zhì)量濃度 10～200 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為 3 ng/mL，定量限為 10 ng/mL。本方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，能夠滿足國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的牛肉中甲拌磷及其代謝物殘留限量的檢測要求。