何宇航 胡濤 吳震，3 賀煜，3 程安春，3 陳舜，3

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院禽病防治研究中心，成都 611130 ；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)研究所，成都 611130；3. 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130）

黃熱病毒（yellow fever virus, YFV）屬于黃病毒科（Flavivirdae）黃病毒屬（Flavivirus），該類屬成員還包括昆津病毒（Kunjin virus, KUNV）、坦布蘇病毒（Tembusu virus, TMUV）、登革熱病毒（Dengue virus, DENV）和日本腦炎病毒等。與其他黃病毒屬成員一樣，YFV為單股正鏈RNA病毒，基因組全長11 kb左右，擁有一個開放閱讀框（open reading frame, ORF）。ORF編碼一個多聚蛋白，包括3種結(jié)構(gòu)蛋白：衣殼蛋白（capsid protein, C protein）、前膜蛋白（premembrane, prM protein）和囊膜蛋白（envelope protein, E protein），以及7個非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural protein）： NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。在ORF兩側(cè)為兩個高度結(jié)構(gòu)化的非編碼區(qū)（untranslated region, UTR）5' UTR 和3' UTR，包含病毒RNA合成以及影響病毒翻譯和復(fù)制所必要的順式作用元件［1]。YFV有兩種野生毒株，包括Asibi毒株和法國噬內(nèi)臟病毒，其中YFV17D是由 Asibi毒株在猴子、小鼠和雞細胞培養(yǎng)物中進行了 176 次傳代而來，其保留了病毒的免疫原性，失去了噬內(nèi)臟性、噬神經(jīng)性毒性和在蚊子體內(nèi)傳播能力［2-4]。

亞基因復(fù)制子系統(tǒng)作為反向遺傳學(xué)的重要組成部分，與感染性克隆一樣能作為研究病毒強有力的工具。黃病毒亞基因復(fù)制子是保留了全部的非結(jié)構(gòu)蛋白和非編碼區(qū)的順式作用元件，刪除了部分結(jié)構(gòu)蛋白基因的一種缺陷型基因組，它能夠在宿主細胞內(nèi)自行完成翻譯和復(fù)制［5]。將報告基因引入以代替缺失的結(jié)構(gòu)蛋白基因區(qū)域，并通過對報告基因表達的蛋白進行檢測，可以更加容易監(jiān)測亞基因復(fù)制子在細胞中的復(fù)制情況［6-8]。在復(fù)制子基礎(chǔ)上，通過攜帶編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白（C、prM、E）的重組質(zhì)粒來提供缺失的結(jié)構(gòu)蛋白，與可以自我復(fù)制的病毒亞基因組產(chǎn)生打包復(fù)制子基因組的假病毒顆粒，其在結(jié)構(gòu)上近似于野生型病毒，具有與野生病毒相似的進入、翻譯和復(fù)制的過程［9-11]。但由于這種病毒樣顆粒所包含的基因仍然缺乏必需的結(jié)構(gòu)蛋白基因，無法再次包裝成成熟的病毒顆粒，故而這種病毒樣顆粒無法從宿主細胞中釋放啟動新一輪的感染，因此稱之為單輪感染病毒顆粒（single round infectious virus particles, SRIPs）［12]。這種通過反式包裝出的SRIPs已經(jīng)在TMUV、DENV、KUNV和寨卡病毒上實現(xiàn)應(yīng)用［13-16]。

本研究利用反向遺傳學(xué)技術(shù)成功分別構(gòu)建攜帶3種不同報告基因（Nluc、oxGFP和mCherry）的YFV17D復(fù)制子。通過檢測Nluc螢光素酶蛋白、oxGFP和mCherry熒光蛋白在細胞中的表達和對病毒雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA）染色觀察，監(jiān)控YFV17D復(fù)制子在BHK-21細胞中翻譯和復(fù)制。將表達結(jié)構(gòu)蛋白的包裝質(zhì)粒（pcDNA3.1-C28prME和pcDNA3.1-CprME）與復(fù)制子共同轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞中，收集上清再次感染BHK-21細胞，通過檢測細胞內(nèi)的Nluc活性和oxGFP、mCherry蛋白表達來監(jiān)控SRIPs 的產(chǎn)生而成功建立YFV17D的假病毒包裝系統(tǒng)。構(gòu)建攜帶報告基因的YFV17D復(fù)制子，可以幫助深入了解YFV基因組翻譯和復(fù)制的調(diào)控機制。同時，基于復(fù)制子的 SRIPs系統(tǒng)為研究病毒吸附、進入和組裝，以及病毒與宿主相互作用提供了有力的工具。

1 材料與方法

1.1 材料

乳倉鼠腎細胞BHK-21由本實驗室保存、攜帶報告基因的單拷貝pCC1-YFV17D-rep復(fù)制子質(zhì)粒（愛沙尼亞塔爾圖大學(xué)Andrews Merits教授惠贈）、大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α、Sure菌株、低拷貝質(zhì)粒pACYC177和真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1均由本實驗室保存；高保真 KOD OneTMPCR Master Mix購于東洋紡生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶購于NEB公司；同源重組酶購于莫納生物科技有限公司；核酸脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購于翌圣生物科技股份有限公司；NanoLuc螢光素酶檢測試劑盒購于Promega公司；鼠抗dsRNA J2 抗體購于SCICONS公司；FITC熒光和TRITC熒光標(biāo)記羊抗鼠lgG購于Abcam公司；DAPI購于北京酷來搏科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 報告復(fù)制子和包裝質(zhì)粒構(gòu)建 使用重疊延伸PCR技術(shù)和同源重組策略來構(gòu)建YFV17D報告復(fù)制子。在pACYC177載體中選擇2個限制性內(nèi)切酶位點SgrA I和BstE II，在YFV17D復(fù)制子基因組中選擇Kpn I、Nhe I和Xho I 3個限制性內(nèi)切酶位點，用于之后的酶切連接。使用TMUV感染性克隆質(zhì)粒pACNR CQW1-intron擴增巨細胞病毒（Cytomegalovirus, CMV）啟動子、丁型肝炎核酶（Hepatitis D ribozyme, HDVr）和猴空泡病毒40（Simian virus 40, SV40）多聚腺苷酸（polyadenylation, poly）尾信號序列。將CMV與“5' UTR-Kpn I”片段融合成P1片段，其中P1片段覆蓋“SgrAI-CMV-5' UTR -Kpn I”之間的基因序列；片段P2覆蓋“Kpn I-Nhe I”之間的基因序列；片段P3覆蓋“Nhe I-Xho I”之間的基因序列；將HDVr和SV40 poly（A）與“Xho I-3' UTR”融合成完整P4片段，覆蓋“Xho I-BstE II”之間的基因序列。接著，將P1片段與線性化的pACYC177載體同源重組，形成P1片段的亞克隆質(zhì)粒pACYC-P1，隨后利用Kpn I、Nhe I和Xho I限制性內(nèi)切酶將P1-P4全部片段按順序連接在pACYC177載體上，最終完成帶有3種不同報告基因的YFV17D復(fù)制子質(zhì)粒的構(gòu)建，分別命名為：pACYC-YFV17D-Nluc-rep、pACYC-YFV17D-mCherry-rep和 pACYC-YFV17D-oxGFP-rep以及pACYC-YFV17D-Nluc-rep-ΔGDD、pACYC-YFV17D-mCherry-rep-GDD-AAA和 pACYCYFV17D-oxGFP-rep-GDD-AAA。

包裝質(zhì)粒 pcDNA3.1-CprME質(zhì)粒由上海生工生物工程有限公司合成。pcDNA3.1-C28prME以pcDNA3.1-CprME質(zhì)粒為模板，保留 C蛋白末端28個氨基酸，擴增C28prME基因，與經(jīng)過Hind III和ApI I限制性內(nèi)切酶酶切后的pCDNA3.1（+）線性載體連接。

1.2.2 報告復(fù)制子和包裝系統(tǒng)的工作驗證 將BHK-21細胞接種至24孔板，待細胞達到70%-90%匯合度時，按照翌圣核酸脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染YFV17D報告復(fù)制子，轉(zhuǎn)染6 h后更換含1%胎牛血清的培養(yǎng)基，然后在37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

YFV17D報告復(fù)制子和包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至接種BHK-21細胞的6孔板中，轉(zhuǎn)染后6 h更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清。將BHK-21細胞接種至24孔板，待細胞長到70%左右密度，棄去培養(yǎng)基，將收集的上清滴加至每孔中，孵育48 h后檢測。

1.2.3 NanoLuc螢光素酶活性的檢測 使用NanoLuc螢光素酶檢測試劑盒，收集轉(zhuǎn)染YFV17D-Nanolucrep后不同時間點的BHK-21細胞和孵育含SRIPs上清的BHK-21細胞。使用Glo Lysis Buffer裂解BHK-21細胞，添加至96孔板中，Nano-Glo底物和Nano-Glo assay buffer按1∶49比例混合獲得Nano Glo反應(yīng)物，與96孔板中細胞裂解樣品混合，在微孔板發(fā)光檢測儀中檢測樣品。

1.2.4 熒光蛋白的檢測 從24孔板中收集轉(zhuǎn)染YFV17D-oxGFP-rep、YFV17D-mCherry-rep后不同時間點的細胞爬片和孵育含SRIPs上清的BHK-21細胞爬片。收集的爬片使用4%多聚甲醛固定，經(jīng)PBST洗滌后，使用0.25%Triton-PBS 在4℃透化1 h，PBST洗滌；細胞核經(jīng)DAPI復(fù)染；最后滴加甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 間接免疫熒光試驗（indirect immunofluorescence assay, IFA） 從24孔板中收集轉(zhuǎn)染3種報告復(fù)制子質(zhì)粒的不同時間點的細胞爬片。爬片使用4%多聚甲醛固定，經(jīng)PBST洗滌后，使用 0.25% Triton-PBS 在4℃透化1 h，PBST洗滌；加入5% BSA在37℃封閉1 h，使用PBST洗滌；用鼠抗dsRNA J2 抗體作為一抗，分別以FITC熒光標(biāo)記羊抗鼠lgG和TRITC熒光標(biāo)記羊抗鼠lgG作為二抗孵育，細胞核使用DAPI復(fù)染；最后滴加甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 YFV17D報告復(fù)制子的構(gòu)建

以分別攜帶NanoLuc、mCherry、oxGFP報告基因的YFV17D復(fù)制子pCC1-YFV17D-rep為模板。在實驗室現(xiàn)有質(zhì)粒pACYC177的基礎(chǔ)上，通過SgrA II和BstE II限制性內(nèi)切酶酶切，獲得pACYC177線性載體。CMV啟動子、HDVr和SV40 poly（A）序列由本實驗室現(xiàn)有的TMUV感染性克隆質(zhì)粒pACNR CQW1-intron上擴增。以pCC1-YFV17D-rep為模板，擴增覆蓋YFV17D復(fù)制子全部亞基因組的4個片段，分別命名為P1、P2、P3 和P4。利用同源重組酶將4個亞基因片段與pACYC177線性載體連接，獲得完整的YFV17D復(fù)制子質(zhì)粒。由CMV驅(qū)動的基因組可以在細胞內(nèi)直接起始轉(zhuǎn)錄，基因組下游添加的HDVr切割轉(zhuǎn)錄本，產(chǎn)生真實的3' 末端［17]，同時，SV40 poly（A）的添加提供了轉(zhuǎn)錄終止信號［18]。為了證明報告基因的表達是由于亞基因復(fù)制子復(fù)制和翻譯的結(jié)果，將YFV17D NS5基因進行突變，將RNA 依賴的 RNA 聚合酶結(jié)構(gòu)域的 GDD 基序缺失（ΔGDD）或突變成丙氨酸（GDD-AAA）（圖1），構(gòu)建具有復(fù)制缺陷的YFV17D復(fù)制子，作為陰性對照。

2.2 YFV17D報告復(fù)制子特性的驗證

將復(fù)制子質(zhì)粒YFV17D-Nluc-rep和YF17D-Nlucrep-ΔGDD轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞中，分別在轉(zhuǎn)染后的4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h收集細胞樣，并檢測Nluc螢光素酶活性。從轉(zhuǎn)染后的4-48 h，野生型復(fù)制子的Nluc螢光素酶活性持續(xù)增加，并且在48 h到達最大值；而復(fù)制缺陷型復(fù)制子在轉(zhuǎn)染細胞后，從24-72 h螢光素酶活性逐漸下降。比較野生型復(fù)制子和復(fù)制缺陷型復(fù)制子Nluc表達水平發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染后的48-72 h，兩者Nluc水平表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)顯著性差異（圖2-A）。以上表明，完成首輪翻譯后，缺陷型復(fù)制子不能再持續(xù)表達Nluc；而野生型復(fù)制子在轉(zhuǎn)染至細胞后螢光素酶活性在持續(xù)增加，說明野生型復(fù)制子能夠正常復(fù)制，Nluc的表達增加是依賴復(fù)制子在細胞內(nèi)持續(xù)復(fù)制而增加的。

圖2 YFV17D報告復(fù)制子在BHK-21細胞中的熒光蛋白表達Fig. 2 Fluorescent protein expression of the YFV17D reporter replicon in BHK-21 cells

轉(zhuǎn)染攜帶mCherry和oxGFP熒光蛋白的YFV17D復(fù)制子至BHK-21細胞后，從轉(zhuǎn)染后36-72 h，野生型復(fù)制子中的紅色和綠色熒光持續(xù)增加，而復(fù)制缺陷型復(fù)制子沒有可見熒光出現(xiàn)，兩者之間呈現(xiàn)明顯的差異（圖2-B），這同樣說明，熒光蛋白的持續(xù)表達需要復(fù)制子在細胞內(nèi)持續(xù)復(fù)制。以上通過對不同的熒光蛋白表達的檢測結(jié)果說明，我們所構(gòu)建的YFV17D報告復(fù)制子能夠在BHK-21細胞內(nèi)正常地完成翻譯和復(fù)制。

2.3 YFV17D復(fù)制子dsRNA的檢測

被黃病毒感染的細胞中能檢測到3種重要的RNA，包括病毒粒子RNA、雙鏈RNA和復(fù)制中間體RNA［19]。在黃病毒基因組復(fù)制過程中，是以病毒正鏈RNA基因組為模板復(fù)制產(chǎn)生互補的負(fù)鏈RNA，再以合成的負(fù)鏈RNA為模板合成大量正鏈RNA［20]。由于負(fù)鏈RNA在整個病毒基因組復(fù)制過程中僅作為復(fù)制正鏈基因組的模板，且多存在于雙鏈RNA的復(fù)制型和部分雙鏈的復(fù)制中間體中，所以通過對dsRNA染色，可以進一步驗證YFV17D復(fù)制子在細胞內(nèi)的復(fù)制。將3種YFV17D報告復(fù)制子分別轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，隨著轉(zhuǎn)染時間的增加，3種野生型報告復(fù)制子產(chǎn)生的dsRNA也逐漸增加，這說明復(fù)制子在細胞內(nèi)發(fā)生復(fù)制。相反，NS5突變的復(fù)制缺陷型復(fù)制子由于RNA依賴的RNA聚合酶結(jié)構(gòu)的缺陷，使RNA的復(fù)制受損，無法觀察到 dsRNA的產(chǎn)生（圖3-A-C）。以上結(jié)果說明，本研究構(gòu)建的YFV17D報告復(fù)制子在BHK-21細胞中具有完成自身復(fù)制的能力。

圖3 YFV17D復(fù)制子在BHK-21細胞中的RNA復(fù)制情況Fig. 3 RNA replication of YFV17D replicon in BHK-21 cells

2.4 YFV17D SRIPs的產(chǎn)生和驗證

由于復(fù)制子基因組中除了包含能夠?qū)崿F(xiàn)自身翻譯和復(fù)制所需的基因元件外，缺失了大部分結(jié)構(gòu)蛋白基因，而這些基因的缺失使復(fù)制子不能自主包裝成具有感染能力的病毒顆粒。我們構(gòu)建了表達缺失YFV17D結(jié)構(gòu)蛋白的兩種包裝質(zhì)粒pcDNA3.1-C28prME和pcDNA3.1-CprME（圖4-A），并和YFV17D報告復(fù)制子質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞中，其中將只轉(zhuǎn)染報告復(fù)制子而不轉(zhuǎn)染包裝質(zhì)粒設(shè)置為對照組。在轉(zhuǎn)染后48 h，收集細胞上清，并再次感染BHK-21細胞，在上清孵育48 h以后檢測相應(yīng)熒光蛋白的表達水平（圖4-B）。結(jié)果顯示，兩種包裝質(zhì)粒pcDNA3.1-C28prME和pcDNA3.1-CprME均可有效打包YFV17D-Nluc-rep復(fù)制子RNA，表現(xiàn)為熒光素酶活性顯著高于對照組（圖4-C）；同時，兩種包裝質(zhì)粒pcDNA3.1-C28prME和pcDNA3.1-CprME均可有效打包YFV17D-oxGFP-rep和YFV17D-mCherry-rep復(fù)制子RNA，表現(xiàn)為對以IFA檢測到第二輪感染細胞中的綠色和紅色熒光蛋白表達（圖4-D）。以上結(jié)果表明，在共轉(zhuǎn)染體系中，由包裝質(zhì)粒提供的prM和E兩種結(jié)構(gòu)蛋白可打包亞基因組YFV17D復(fù)制子RNA，形成具有單輪感染能力的病毒樣顆粒釋放到上清。

圖4 YFV17D包裝系統(tǒng)的建立Fig. 4 Establishment of the YFV17D packaging system

3 討論

本研究以改造單拷貝質(zhì)粒pCC1-YFV17D-rep為起點，旨在避免該復(fù)制子質(zhì)粒以原核啟動子SP6驅(qū)動起始轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染繁瑣的操作。在設(shè)計上，我們使用CMV真核啟動子替代原核啟動子SP6，其能直接將基因組以DNA形式轉(zhuǎn)染至細胞并開始轉(zhuǎn)錄翻譯。黃病毒cDNA在大腸桿菌宿主中極不穩(wěn)定，潛在的原核啟動子使基因組產(chǎn)生針對大腸桿菌的毒性蛋白，使其很難在大腸桿菌中穩(wěn)定傳代［21]。針對這樣的原核毒性，已經(jīng)有設(shè)計多種策略來應(yīng)對，包括使用極低拷貝數(shù)質(zhì)粒、多片段系統(tǒng)、體外連接方法、插入內(nèi)含子以及用于質(zhì)粒繁殖的酵母作為替代宿主菌［22-28]。原有的單拷貝質(zhì)粒載體pCC1雖然能極大程度減少原核毒性，但是由于質(zhì)?？截悢?shù)過低，使獲取足量的質(zhì)粒用于下游實驗成為問題。因此，根據(jù)本實驗室在構(gòu)建TMUV復(fù)制子以及感染性克?。?,29]的前期經(jīng)驗，我們選用低拷貝質(zhì)粒作為載體，既能穩(wěn)定YFV17D基因組，又能得到一定量的質(zhì)粒拷貝數(shù)完成下游實驗。

在構(gòu)建YFV17D復(fù)制子的策略上，我們保留了完整的C蛋白和全部非結(jié)構(gòu)蛋白，刪除了prM蛋白和E蛋白的絕大部分。此外，E基因的C端序列保留了34個氨基酸，用于編碼下游NS1蛋白的信號序列，信號序列的保留能保證NS1蛋白的正確加工以及非結(jié)構(gòu)蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的正確轉(zhuǎn)運［6,30]。此外，構(gòu)建表達缺失的結(jié)構(gòu)蛋白（prM和E）的質(zhì)粒作為包裝質(zhì)粒（pcDNA3.1-CprME和pcDNA3.1-C28prME）以包裝目的復(fù)制子，其中，pcDNA3.1-C28prME保留C蛋白的C端28個密碼子（C28），作為 prM 蛋白易位進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的信號序列； pcDNA3.1-CprME表達YFV17D的全部結(jié)構(gòu)蛋白。雖然，我們設(shè)計的兩種包裝質(zhì)粒都成功打包了復(fù)制子基因組，但是兩種包裝質(zhì)粒呈現(xiàn)出不同的包裝效率。從結(jié)果來看，無論是檢測Nluc活性，還是檢測熒光蛋白的表達，CprME包裝效率都明顯高于C28prME。Roby等［31]構(gòu)建的KUNV亞基因復(fù)制子刪除了KUNV C蛋白第18-100位密碼子，保留了完整的prM、E蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，并在同一質(zhì)粒中使用兩個CMV啟動子分別表達KUNV的完整C蛋白和復(fù)制子亞基因組。在轉(zhuǎn)染細胞后能夠產(chǎn)生低水平的SRIPs。但通過使用EF1α啟動子替換驅(qū)動C蛋白的CMV啟動子時，不僅能表達出更高水平的C蛋白，而且同時還能顯著提高SRIPs的產(chǎn)生［32]。這解釋了不同包裝質(zhì)粒對YFV17D不同的包裝效率。在共轉(zhuǎn)染體系中，在YFV17D復(fù)制子基因組表達完整C蛋白的同時，包裝質(zhì)粒CprME比C28prME能額外提供完整C蛋白，使整個體系的C蛋白表達的量增加，更多的C蛋白與prM蛋白能更多地打包復(fù)制子基因組，從而提高包裝效率。

4 結(jié)論

本研究利用反向遺傳學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建攜帶報告基因的YFV17D復(fù)制子，通過與表達YFV17D結(jié)構(gòu)蛋白的真核表達質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞，成功包裝出具有單輪感染能力的假病毒顆粒。