饒紫環(huán) 謝志雄

（武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430000）

木質(zhì)纖維素是自然界中含量最豐富的有機物，主要由木質(zhì)素、纖維素和半纖維素組成。木質(zhì)纖維素的生物處理一直被認為是解決化石燃料短缺問題的有效方法，也是未來新能源開發(fā)的趨勢。木質(zhì)纖維素的生物處理通常使用降解木質(zhì)纖維素的酶，包括木質(zhì)素酶、纖維素酶和半纖維素酶。其中纖維素酶主要應(yīng)用于造紙業(yè)、洗滌劑、食品、工業(yè)生產(chǎn)酒精等領(lǐng)域［1-2]，約占全球工業(yè)酶需求的8%［3]。針對不同的產(chǎn)業(yè)和目的，采用的纖維素酶種類也不同。盡管目前關(guān)于纖維素酶的研究不斷取得進展，酶產(chǎn)品的成本仍然居高不下。篩選新型纖維素酶對相關(guān)工業(yè)的發(fā)展有著至關(guān)重要的作用。

纖維素酶根據(jù)作用位點，可以大致分為外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等［4]。外切葡聚糖酶主要作用于纖維素結(jié)晶區(qū)，終產(chǎn)物可以是葡萄糖或者纖維二糖。內(nèi)切葡聚糖酶主要作用于纖維素?zé)o定形區(qū)，隨機切割產(chǎn)生新的末端，產(chǎn)物是一些不定長度的寡糖。β-葡萄糖苷酶更傾向作用于非還原端，水解纖維糊精和纖維二糖產(chǎn)生葡萄糖。纖維素酶主要來源于纖維素降解菌株。其中真菌是研究最多的一類纖維素降解微生物。一般認為真菌的纖維素分解能力和酶活性普遍高于細菌，然而真菌的高酶活可能是源于其較強的蛋白分泌能力［5]，若具體到單酶的活性，細菌產(chǎn)生的酶可能會更適用于工業(yè)生產(chǎn)［4]。同時由于真菌酶系更為復(fù)雜，在純化單酶時面臨更多的技術(shù)問題。因此近年來相關(guān)研究更多集中于得到具有降解能力的細菌［1]。適應(yīng)極端環(huán)境的細菌，如嗜熱、耐堿等方向尤為受到關(guān)注。然而日常工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動更多的是在常溫下進行，常溫纖維素降解菌株有著更廣闊的應(yīng)用前景。不斷篩選鑒定發(fā)現(xiàn)新型常溫纖維素降解菌株對充實相關(guān)微生物資源有著重要意義，也為新型纖維素酶的研發(fā)提供了更多的思路。

Olivibacter屬最早發(fā)現(xiàn)于2007年［6]，模式菌株為 Olivibacter sitiensis AW-6T，因在橄欖油廢料中分離得到而得名。該屬的典型特征為棒狀，革蘭氏染色陰性。Olivibacter屬內(nèi)迄今為止已有10個已鑒定的新種，其中Olivibacter jilunii 14-2AT于2013年從DDT污染土壤中分離得到［5]。

由于纖維素降解菌株主要富集在纖維素豐富的環(huán)境中，因此本研究從園林堆肥中選取分離基質(zhì)，設(shè)計篩選培養(yǎng)基，得到常溫下的纖維素降解菌株。根據(jù)分子鑒定，該菌株屬于Olivibacter屬，為該屬內(nèi)首次報道的具有纖維素降解能力的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

園林堆肥樣品：香樟（Cinnamomum camphora）落葉、法國梧桐（Platanus orientalis L.）落葉和杏鮑菇（Pleurotus eryngii）培養(yǎng)物等堆肥。

CMC-Na（羧甲基纖維素鈉）培養(yǎng)基：氯化鈉6.0 g/L，硫酸銨2.0 g/L，無水氯化鈣0.1 g/L，七水合硫酸鎂0.1 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，CMC-Na 10.0 g/L。

纖維素酶底物：10.0 g/L羧甲基纖維素鈉溶于pH 5.0檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化及纖維素降解能力檢測 從堆肥中取樣，按10倍梯度稀釋涂布于CMC-Na平板，每個稀釋度進行3個平行。37℃恒溫培養(yǎng)3 d后挑取單菌落。于CMC-Na平板上進行平板劃線純化。連續(xù)5代培養(yǎng)純化后，挑取單菌落接種于CMCNa液態(tài)培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3 d，取培養(yǎng)上清滴在CMC-Na平板上，37℃恒溫培養(yǎng)5 d后用剛果紅染色液初步檢測纖維素酶活。同時，取0.5 cm × 2 cm的濾紙條滅菌烘干后加入CMC-Na液態(tài)培養(yǎng)基中，接入菌液，置于37℃培養(yǎng)10 d后，根據(jù)濾紙降解程度初步確定菌株的降解能力。經(jīng)過上述兩次初步篩選，選取降解性能優(yōu)良的菌株進行下一步分析。

1.2.2 菌株的16S rRNA基因序列比對分析 挑取單菌落利用PCR［7]擴增16S rRNA基因序列，將PCR產(chǎn)物送交天一輝遠公司測序后獲得16S rRNA基因序列信息，在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和EZBioCloud（https://www.ezbiocloud.net/）上分別進行比對，確定菌株所屬種屬。根據(jù)NCBI的16S rRNA基因序列比對結(jié)果，下載相近序列后，利用MEGA-X用非加權(quán)組平均法（unweighted pairgroup method with arithmetic means, UPGMA）構(gòu)建進化樹［8-9]。利用PAUP* 4.0a169［10]構(gòu)建最大簡約樹（maximum parsimony tree, MP-tree）。

1.2.3 菌株基因組比較分析 將分離的菌株送生工生物公司進行全基因組測序。相近種屬的基因組序列在NCBI上獲得。利用EZBioCloud（https://www.ezbiocloud.net/）計算OrthoANIu，在JSpeciesWS（https://jspecies.ribohost.com/jspeciesws/）上計算ANIb和ANIm；利用Genome-to-Genome Distance Calculator 3.0（https://ggdc.dsmz.de/ggdc.php）計算DDH；利用Mauve進行共線性比對［11]；用BRIG進行GC值比對，并利用BRIG的基因位置標(biāo)注功能特別標(biāo)注纖維素酶相關(guān)基因［12]。

1.2.4 生理生化特征檢測 檢測菌株18B和O.jilunii 14-2AT的生長溫度、生長pH、NaCl耐受、糖酵解、硝酸鹽還原、氧化酶和β-半乳糖苷酶活性等生理生化指標(biāo)。VP測試采用Barritt法。將菌株平板劃線法接種于MacConkey平板，37℃培養(yǎng)3 d連續(xù)觀察菌落形態(tài)和顏色［13]。

1.2.5 纖維素酶活的測定 酶活單位：1 min催化底物羧甲基纖維素鈉生成1 μmol還原糖的酶量即為1 U。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照Miller的方法［14]，使用Cytation3酶標(biāo)儀測定540 nm吸光度。將菌株按照0.5%（V/V）的比例接種于CMC液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)，不同時間取培養(yǎng)液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾得到粗酶液。將粗酶液100 μL與底物900 μL混合后，對照組立即沸水浴5 min，然后冰?。粚嶒灲M在50℃水浴鍋中反應(yīng)20 min。隨后向?qū)φ战M和實驗組中同時添加2.0 mL DNS，沸水浴5 min后，冷卻至室溫，吸取反應(yīng)液200 μL，加入96孔酶標(biāo)板中，使用Cytation3酶標(biāo)儀測定540 nm吸光度。將所得吸光度代入公式：

（k：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；t：反應(yīng)時間）計算酶活。

1.2.6 纖維素酶相關(guān)基因異源表達及檢測 根據(jù)全基因組測序的基因注釋，結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)分析，定位菌株纖維素酶相關(guān)基因，并對其中酶活潛力最大的蛋白基因克隆進pET26b質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Escherichia coli BL21中。利用IPTG進行誘導(dǎo)表達。檢測異源表達蛋白纖維素降解活性。

2 結(jié)果

2.1 菌株的篩選及16S rRNA 序列進化分析

在CMC-Na平板上共純化得到纖維素降解細菌17株，根據(jù)濾紙降解能力（圖1-A）和剛果紅褪色圈直徑（圖1-B）確定編號為18B的菌株降解能力最為突出。

圖1 菌株18B纖維素降解能力檢測Fig. 1 Detection of cellulose degradation ability of strain 18B

通過PCR擴增獲得菌株18B的16S rRNA基因序列（1387 bp）及NCBI和EZBioCloud比對發(fā)現(xiàn)，與其相似度在97.00%以上的細菌有2株。菌株18B的16S rRNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對結(jié)果最相近的分別為O. jilunii 14-2AT（99.35%）和Olivibacter oleidegradans TBF2/20.2T（99.28%）。在EZBiocloud數(shù)據(jù)庫中比對結(jié)果最相近的為O.oleidegradans TBF2/20.2T（99.42%）和O. jilunii 14-2AT（99.13%）。利用MEGA-X構(gòu)建進化樹，其中UPGMA進化樹見圖2，與菌株18B親緣關(guān)系最接近的是O. jilunii 14-2AT和O. oleidegradans TBF2/20.2T兩菌株。利用PAUP構(gòu)建的MP進化樹（圖3），一致性指數(shù)（consistency index, CI）值為0.553，保留指數(shù)（retention index, RI）值為0.689，重縮放一致性指數(shù)（rescaled consistency index, RC）值為0.381，非同源相似性指數(shù)（homoplasy index, HI）值為0.447。MP進化樹與UPGMA進化樹相似，表明結(jié)果可信，提示菌株18B屬于Olivibacter屬。

圖2 基于16S rRNA序列構(gòu)建的非加權(quán)組平均法進化樹（以Albibacterium bauzanense BZ42為外群）Fig. 2 UPGMA-tree based on 16S rRNA (Albibacterium bauzanense BZ42 used as the outgroup)

圖3 基于16S rRNA序列構(gòu)建最大簡約樹（以Albibacterium bauzanense BZ42為外群）Fig. 3 MP-tree based on 16S rRNA (Albibacterium bauzanense BZ42 used as the outgroup)

2.2 菌株18B的基因組比較分析

為進一步鑒定菌株18B，對其進行全基因組測序及比對分析。全基因組測序的結(jié)果表明菌株18B的基因組長度為5976 778 bp，利用 EZBiocloud和JSpeciesWS的ANI（average nucleotide identity）計算結(jié)果顯示18B和O. jilunii 14-2AT的相似度均在95%以上，不符合新種界定的范圍。EZBiocloud上計算OrthoANIu（orthologous average nucleotide identity），結(jié)果顯示18B與O. jilunii 14-2AT的ANI為98.42%。在JSpeciesWS上，以O(shè). jilunii 14-2AT的基因組作為參考序列，ANIb為97.58%，ANIm為98.85%。在Genome-to-Genome Distance Calculator 3.0計算菌株18B和O. jilunii 14-2AT的DDH（DNA-DNA hybridization），參考結(jié)果為87.60%。根據(jù)以上結(jié)果，可確定18B屬于O. jilunii。對18B和O. jilunii 14-2AT進行進一步的比對分析。圖4展示的共線性結(jié)果可知，18B與O. jilunii 14-2AT之間存在著一定的進化關(guān)系。圖5展示的為BRIG繪制Olivibacter屬內(nèi)的基因組比對結(jié)果，參考序列為18B，由圖可知18B與該屬內(nèi)的其他菌株之間存在著一定的進化距離，部分小片段上相似度較低。

圖4 菌株18B和O. jilunii 14-2AT的全基因組共線性比對Fig. 4 Genome-wide covariance alignment of strain 18B and O. jilunii 14-2AT

圖5 Olivibacter屬內(nèi)基因組比對Fig. 5 Genome alignment within the genus Olivibacter

2.3 生理生化檢測分析

對菌株18B和O. jilunii 14-2AT進行常見生理生化特征比較實驗，發(fā)現(xiàn)菌株18B與O. jilunii 14-2AT在生長溫度、氧化酶和糖酵解等方面存在差異（表1）。

表1 18B和O. jilunii 14-2AT常見生理生化特征比對Table 1 Comparison of common physiological and biochemical characteristics between 18B and O. jilunii 14-2AT

2.4 菌株18B產(chǎn)纖維素酶活分析

在LB中轉(zhuǎn)接一代后，菌株18B產(chǎn)纖維素酶活有明顯的下降，表明菌株18B在營養(yǎng)豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)存在嚴重的產(chǎn)酶退化現(xiàn)象，但是在僅含羧甲基纖維素鈉的培養(yǎng)環(huán)境中，菌株18B的退化不明顯（圖6）。同時，未測得O. jilunii 14-2AT的纖維素酶活。

圖6 18B纖維素酶活隨培養(yǎng)時間變化Fig. 6 Variation of 18B cellulase activity with incubation time

2.5 菌株18B纖維素酶合成相關(guān)基因分析

因為該屬內(nèi)的菌株未有關(guān)于纖維素降解能力的報道。根據(jù)全基因組測序的注釋結(jié)果，對菌株18B纖維素酶合成相關(guān)基因進行分析，共得到纖維素酶合成相關(guān)基因7個（圖4），選擇其中標(biāo)記為纖維素內(nèi)切酶的基因序列，使用NCBI蛋白比對功能確定相關(guān)基因具有纖維素酶活性位點。最后確定4個最優(yōu)潛力的纖維素酶合成相關(guān)基因。這4個基因分別編碼蛋白為內(nèi)切葡聚糖酶D前體（endoglucanase D precursor, celD），標(biāo)記為D；內(nèi)切葡聚糖酶Z前體（endoglucanase Z precursor, celZ），標(biāo)記為Z；纖維素酶M（cellulase M），標(biāo)記為M；純內(nèi)切葡聚糖酶（putative endoglucanase），標(biāo)記為P。圖7顯示異源表達后菌液中的基因檢測結(jié)果，表明誘導(dǎo)表達后的菌液中攜帶有目的基因。圖8展示的是蛋白質(zhì)的檢測，表明各基因在該條件下誘導(dǎo)表達成功。D蛋白和P蛋白主要存在于上清中，Z蛋白和M蛋白沉淀中含量更高。同時測得酶活，D蛋白酶活為3.17 U/L，Z蛋白酶活為2.37 U/L，M蛋白酶活為2.57 U/L，P蛋白酶活為1.98 U/L。

圖7 誘導(dǎo)表達后基因檢測Fig. 7 Gene amplification after induction of expression

圖8 纖維素酶基因誘導(dǎo)表達蛋白檢測Fig. 8 Protein assay of cellulase gene induced expression

3 討論

3.1 菌株18B屬于O. jilunii

根據(jù)16S rRNA基因序列、全基因組序列和生理生化特征比對，確定菌株18B屬于O. jilunii。其中，菌株18B與O. jilunii 14-2AT的基因組長度差距較大。同時，通過共線性分析可知，菌株18B與O. jilunii 14-2AT存在大區(qū)段的重排和缺失。在生理生化特征上，菌株18B和O. jilunii 14-2AT的主要區(qū)別在于生長溫度、氧化酶、糖酵解以及纖維素降解。由于堆肥發(fā)酵存在高溫時期［15]，菌株18B的生長溫度和最適溫度較O. jilunii 14-2AT有向高溫區(qū)段偏移的趨勢。這是一種環(huán)境適應(yīng)性的表現(xiàn)。綜合以上證據(jù)，可以判斷菌株18B與O. jilunii的模式菌株存在一定差別，可定為新的生理株，補充了國內(nèi)該屬的種質(zhì)資源。

3.2 菌株18B的纖維素降解能力

菌株18B的主要纖維素酶系為內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，根據(jù)幾個相關(guān)基因的異源表達結(jié)果，可知這些基因具有一定的活性。但是相比于全菌的纖維素酶活性，相關(guān)基因的纖維素酶活性較低。可能是由以下兩個原因?qū)е?。其一，異源表達載體采用T7啟動子，非強啟動子，蛋白表達量有限。其二，菌株18B具有調(diào)節(jié)纖維素酶基因和運送相關(guān)蛋白酶的通路，可增強相關(guān)基因的表達并將蛋白酶高效運輸出細胞，以提高培養(yǎng)環(huán)境中羧甲基纖維素的利用效率。在內(nèi)切葡聚糖酶D前體的上游，有外膜蛋白組裝因子BAMB前體（outer membrane protein assembly factor BamB precursor），后者具有組裝和運輸外膜蛋白的功能［16]。同時，通過全基因組測序篩選出菌株18B具有半纖維素酶系相關(guān)基因16個，而半纖維素酶可協(xié)同促進纖維素酶發(fā)揮作用［17]。

3.3 菌株18B的應(yīng)用前景良好

作為Olivibacter屬內(nèi)首次報道具有纖維素酶活性的菌株，菌株18B的應(yīng)用前景也較為廣泛。細菌所產(chǎn)的纖維素大多附著于細胞外膜［18-19]，而菌株18B的纖維素酶活在去除細菌的培養(yǎng)上清中亦可檢測到，表明菌株18B可產(chǎn)生胞外纖維素酶，這一點有利于后續(xù)工業(yè)化的利用。在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到后期（＞14 d），可通過酸性重鉻酸鉀檢測到培養(yǎng)上清中含有酒精，且16S rRNA測序無雙峰，表明該培養(yǎng)環(huán)境無污染。暗示菌株18B在纖維素發(fā)酵產(chǎn)乙醇的工業(yè)方面亦可有應(yīng)用。在pH 5.0和pH 7.0的反應(yīng)條件下，均可檢測到菌株18B培養(yǎng)上清的纖維素酶活，表明該菌株所產(chǎn)纖維素酶系的應(yīng)用環(huán)境廣，在中性和偏酸性環(huán)境下均可發(fā)揮降解能力。細菌纖維素酶廣泛應(yīng)用于洗滌劑領(lǐng)域，以提高洗滌劑的去污能力并保持織物表面光滑度［20]。以往研究關(guān)于適用于洗滌產(chǎn)品的纖維素酶更多集中于堿性環(huán)境，近年來，一些酸性洗滌劑的推廣給耐酸性細菌纖維素酶提供了更多的應(yīng)用方向。而菌株18B的適應(yīng)性和酶活力表明在該方向上它有優(yōu)良的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

菌株18B屬于O. jilunii，是不同于模式菌株的一株生理株，主要區(qū)別在于生長溫度和纖維素酶活性。菌株18B具有能合成纖維素酶的基因，主要為內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶。