郭少華 毛會(huì)麗 劉征權(quán) 付美媛 趙平原 馬文博 李旭東 關(guān)建義

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 新鄉(xiāng) 453003）

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）屬于弧菌科氣單胞菌屬，是一種條件致病菌，同時(shí)也是細(xì)菌性敗血癥的主要病原體，廣泛存在于世界各地的各種環(huán)境中，如淡水、土壤和水產(chǎn)養(yǎng)殖設(shè)施等，是常見(jiàn)的人-獸-魚(yú)共患病病原菌，其不僅能感染草魚(yú)（Ctenopharyngodon idella）、鰱魚(yú)（Hypophthalmichthys molitrix）、羅非魚(yú)（Oreochromis mossambicus）等多種重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，而且還會(huì)感染人類，引起腹瀉、食物中毒及敗血癥等多種疾?。?-5]。由于我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖密度高、過(guò)度投喂、環(huán)境污染等因素，嗜水氣單胞菌引起的細(xì)菌性敗血癥已成為養(yǎng)殖行業(yè)的主要問(wèn)題［6-7]。本實(shí)驗(yàn)室在河南新鄉(xiāng)某漁場(chǎng)，從自然患病的麥穗魚(yú)（Pseudorasbora parva）體內(nèi)分離出一株嗜水氣單胞菌，命名為XDMG［8], 并對(duì)其開(kāi)展了初步研究。結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌XDMG對(duì)健康鯽魚(yú)（Carassius auratus）的半數(shù)致死濃度（median lethal dose，LD50）為 1.5×105CFU/mL［9]；回歸感染試驗(yàn)顯示，嗜水氣單胞菌XDMG導(dǎo)致銀鯽臀鰭、腹鰭、胸鰭的基部及殖泄孔處均出現(xiàn)充血現(xiàn)象, 與細(xì)菌性敗血癥癥狀一致，感染嗜水氣單胞菌XDMG后，發(fā)病迅速，存活時(shí)間短，說(shuō)明嗜水氣單胞菌XDMG具有較強(qiáng)的致病性［8]。

本研究對(duì)嗜水氣單胞菌XDMG進(jìn)行了全基因組測(cè)序、基因注釋及分析，與4株親緣關(guān)系較近的嗜水氣單胞菌［10-13]進(jìn)行基因組的比較分析，為嗜水氣單胞菌基因與蛋白質(zhì)功能的研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為嗜水氣單胞菌基因工程疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用菌株嗜水氣單胞菌XDMG來(lái)源于自然患病瀕死的麥穗魚(yú)體內(nèi)，現(xiàn)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏號(hào)為CCTCC NO: M2013566）。選用LB液體培養(yǎng)基對(duì)該菌株進(jìn)行培養(yǎng)（每 1000 mL含有NaCl 10 g，胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，pH 為 7.2），加入20 g瓊脂即為L(zhǎng)B固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 嗜水氣單胞菌XDMG全基因組測(cè)序、拼接組裝 將嗜水氣單胞菌XDMG在LB固體平板上劃線分離純化后，挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，在28℃，180 r/mim的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，12 h后取1 mL菌液（1%）接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16 h之后，采用DNA提取試劑盒提取嗜水氣單胞菌XDMG基因組DNA。將提取得到DNA送至上海美吉生物科技有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序。利用軟件Newbler［14]對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，經(jīng)過(guò)組裝后，對(duì)于基因組上仍然存在的缺口，通過(guò)設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物對(duì)缺口處的基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物通過(guò)Sanger法進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)SeqMan［15]與已有的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，最終得到完整的基因組序列。

1.2.2 基因功能注釋分析 利用Glimmer［16]（http://ccb.jhu.edu/software/glimmer/index.shtml）對(duì)基因組序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框（open reading frame, ORF）的預(yù)測(cè)。通過(guò)序列比對(duì)工具（basic local alignment search tool, BLAST）在NCBI非冗余蛋白（NR）、注釋蛋白質(zhì)序列（Swiss-Prot, https://web.expasy.org/docs/swissprot_guideline.html）數(shù)據(jù)庫(kù)［17]、蛋白質(zhì)家族（Pfam,http://pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)［18]、京都基因和基因組百科全書(shū)［19]（KEGG, http://www.genome.jp/kegg/）、基因本體（GO, http://www.geneontology.org/）、碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)［20]（CAZy, http://www.cazy.org/）、毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)［21]（VFDB, http://www.mgc.ac.cn/VFs/）、綜合的抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)［22]（CARD, http://arpcard.Mcmaster.ca）、病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫(kù)［23]（PHI）對(duì)ORF翻譯的氨基酸進(jìn)行注釋。蛋白質(zhì)同源群（COG）通過(guò)EggNOG［24]（http://eggnog.embl.de/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋，在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分類數(shù)據(jù)庫(kù)［25-26]（TCDB，http://www.tcdb.org/）進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分析，使用Tmhmm軟件［27]（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）獲得基因組中跨膜蛋白相關(guān)的基因，利用 tRNAscan-SE v2.0［28]軟件（http://trna.ucsc.edu/software/）和Barrnap軟件（https://github.com/tseemann/barrnap）分別對(duì)基因組進(jìn)行tRNA 與rRNA 的預(yù)測(cè)。使用Tandem Repeats Finder軟件［29]進(jìn)行串聯(lián)重復(fù)序列預(yù)測(cè)，可以得到重復(fù)序列的位置、重復(fù)次數(shù)、核酸組成等信息。利用IslandViewer［30]進(jìn)行基因組島預(yù)測(cè)。利用Minced［31]進(jìn)行CRISPRCas預(yù)測(cè)。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育和基因組比較 基于保守單拷貝的看家基因采用MEGA 6.0軟件選擇NJ（neighborjoining）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。用DNAMAN軟件進(jìn)行核酸及氨基酸序列差異性分析。

2 結(jié)果

2.1 嗜水氣單胞菌XDMG基因組拼接

嗜水氣單胞菌XDMG經(jīng)全基因組測(cè)序共獲得5355 403個(gè)有效反應(yīng)，基因組覆蓋度為98.27%。經(jīng)過(guò)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控和序列組裝之后, 共計(jì)獲得重疊群（contigs）47個(gè)，共形成47個(gè)基因組骨架（scaffolds）（表 1）。

2.2 嗜水氣單胞菌XDMG基因組的特性

嗜水氣單胞菌XDMG基因組是大小為4992 026 bp的環(huán)狀染色體（圖1），GC含量為60.84%, 該基因組包含了4935個(gè)編碼基因。在嗜水氣單胞菌XDMG中共發(fā)現(xiàn)99個(gè)tRNA 序列，轉(zhuǎn)運(yùn)20種氨基酸，每種氨基酸至少對(duì)應(yīng)1個(gè)tRNA基因，其中異亮氨酸對(duì)應(yīng)的tRNA數(shù)最高，在嗜水氣單胞菌XDMG的基因組中12個(gè)tRNA在轉(zhuǎn)運(yùn)異亮氨酸。同時(shí)也找到3個(gè)rRNA 序列，23S rRNA、16S rRNA 和5S rRNA各1個(gè)。

圖1 嗜水氣單胞菌XDMG全基因組的圓形圖譜Fig. 1 Circular mapping of the whole genome of A. hydrophila XDMG

基于31個(gè)看家基因（DnaG，F(xiàn)rr，InfC，NusA，Pgk，PyrG，RplA，RplB，RplC，RplD，RplE，RplF，RplK，RplL，RplM，RplN，RplP，RplS，RplT，RpmA，RpoB，RpsB，RpsC，RpsE，RpsI，RpsJ，RpsK，RpsM，RpsS，SmpB，Tsf）利用MEGA 6.0軟件對(duì)XDMG和19株在種屬水平上最接近的菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析（圖2）。通過(guò)樹(shù)狀圖發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌XDMG與國(guó)內(nèi)株嗜水氣單胞菌J-1和美國(guó)來(lái)源的嗜水氣單胞菌AL09_71具有較近的親緣關(guān)系。因此，本研究將嗜水氣單胞菌XDMG基因組與其他4株親緣關(guān)系的嗜水氣單胞菌基因組的一般特征進(jìn)行了比較分析（表2）。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌XDMG的rRNA與tRNA的數(shù)量明顯低于其他4個(gè)菌株。

圖2 基于31個(gè)看家基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree constructed based on 31 housekeeping gene sequences

串聯(lián)重復(fù)序列是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的組成部分，在進(jìn)化、遺傳和變異中具有不同的功能作用，例如核酸堿基的錯(cuò)配修復(fù)和損傷修復(fù)，并且它在基因表達(dá)、染色體構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面也發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在嗜水氣單胞菌XDMG中共有101條串聯(lián)重復(fù)序列，重復(fù)序列的總長(zhǎng)度占全基因組的0.5%。

2.3 基因功能注釋

嗜水氣單胞菌XDMG基因序列中預(yù)測(cè)到了4061個(gè)編碼基因具有COG功能分類，有COG注釋的基因占所有基因的82.29%。嗜水氣單胞菌XDMG中編碼序列COG功能注釋（圖3），基因注釋結(jié)果共有21類，其中S（功能未知）的數(shù)量有1219個(gè)基因，數(shù)量最多占30.02%；A（RNA加工和修飾）與B（染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)）的數(shù)量最少，每種分別有1個(gè)基因；E（氨基酸的運(yùn)輸和代謝）有331個(gè)基因，占8.15%；K（轉(zhuǎn)錄）有274個(gè)基因，占6.75%；C（能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化）有256個(gè)基因，占6.30%；P（無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝）有249個(gè)基因，占6.13%；T（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制）有231個(gè)基因，占5.69%；G（碳水化合物運(yùn)輸和代謝）有212個(gè)基因，占5.22%；M（細(xì)胞壁/膜/膜生物合成）有204個(gè)基因，占5.02%；J（翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生）有188個(gè)基因，占4.63%；L（復(fù)制、重組和修復(fù)）有186個(gè)基因，占4.58%；O（翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶）有155個(gè)基因，占3.82%；H（輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝）有122個(gè)基因，占3.00%；U（細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸）有102個(gè)基因，占2.51%；在COG功能注釋中，有1219個(gè)編碼基因的基因功能未知，說(shuō)明在該基因組中還有許多基因功能需要去挖掘。

圖3 嗜水氣單胞菌XDMG在COG數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋Fig. 3 Functional annotation of A. hydrophila XDMG in COG Database

嗜水氣單胞菌XDMG編碼蛋白的序列中有3228個(gè)編碼序列在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋（圖4）。占總編碼序列的65.41%，基因差異性表達(dá)主要分布在3大類41個(gè)亞功能中：生物過(guò)程，包括19個(gè)亞功能；細(xì)胞成分，包括11個(gè)亞功能；分子功能，包括11個(gè)亞功能。有2574個(gè)編碼序列被注釋到生物過(guò)程類中，其中大部分參與代謝過(guò)程，細(xì)胞過(guò)程，單一生物過(guò)程。有1663個(gè)編碼序列被注釋到細(xì)胞組成類中，其中占比最多的是細(xì)胞、細(xì)胞部分、膜。有2662個(gè)編碼序列被注釋到分子功能類中，其中被注釋到催化活性、結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)活性亞功能中編碼序列最多。

圖4 嗜水氣單胞菌XDMG的GO注釋分布Fig. 4 GO annotation distribution for A. hydrophila XDMG

嗜水氣單胞菌XDMG編碼蛋白的序列中有2663個(gè)編碼序列在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋，分為6大類（圖5），即1797個(gè)基因被注釋到代謝；391個(gè)基因被注釋到環(huán)境信息處理；300個(gè)基因被注釋到細(xì)胞過(guò)程；231個(gè)基因被注釋到遺傳信息處理；166個(gè)基因被注釋到人類疾病；65個(gè)基因被注釋到生物系統(tǒng)，如圖所示。通過(guò)對(duì)KEGG信號(hào)通路層次分析發(fā)現(xiàn)，代謝中的碳水化合物代謝包含基因最多，共391個(gè)基因；并發(fā)現(xiàn)有166個(gè)基因被注釋到人類疾病，分別為：癌癥概述（22個(gè)基因）、細(xì)菌傳染?。?1個(gè)基因）、心血管疾病（9個(gè)基因）、內(nèi)分泌和代謝疾?。?0個(gè)基因）、寄生蟲(chóng)傳染?。?個(gè)基因）、神經(jīng)退行性疾?。?4個(gè)基因）、特定類型癌癥（3個(gè)基因）、耐藥性抗腫瘤（12個(gè)基因）、抗微生物藥物（59個(gè)基因）、免疫疾?。?個(gè)基因）。

圖5 嗜水氣單胞菌XDMG的KEGG標(biāo)注分布Fig. 5 KEGG labeling distribution for A. hydrophila XDMG

2.4 基因島

通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，在嗜水氣單胞菌XDMG中共發(fā)現(xiàn)14個(gè)基因島（表3），長(zhǎng)度在10-15 kb之間的基因島數(shù)量最多，占35.71%，最大的基因島長(zhǎng)度為25.03 kb。全部基因島共涉及255個(gè)基因，具有明確生物學(xué)意義的基因有113個(gè)基因，其中涉及基因最多的基因島，共涉及34個(gè)基因，具有明確生物學(xué)意義的基因有2個(gè)基因，涉及明確生物學(xué)意義的基因最多的基因島，共涉及25個(gè)基因，其中有16個(gè)具有明確生物學(xué)意義，具體情況如表。同時(shí)這些基因涉及的多種功能，與蛋白質(zhì)編碼與轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)修復(fù)、酶合成、DNA修復(fù)、能量系統(tǒng)等均有密切的聯(lián)系。

2.5 毒力基因及耐藥基因分析

在嗜水氣單胞菌XDMG中共鑒定出527個(gè)毒力基因（表4），其中有256個(gè)毒力基因有明確的分類，分別為防御性毒力因子（34個(gè)基因）、攻擊性毒力因子（158個(gè)基因）、非特異性毒力因子（54個(gè)基因）、毒力相關(guān)基因的調(diào)控（10個(gè)基因）。

在嗜水氣單胞菌XDMG中存在279個(gè)耐藥基因，分為35類（表5），其中外排泵賦予抗生素耐藥性的基因最多，包含179個(gè)基因，酚類耐藥性基因、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性基因、利奈唑胺耐藥基因、林可酰胺耐藥基因、呋喃妥因耐藥基因、參與抗生素自身耐藥的基因最少，都只有1個(gè)相關(guān)基因。

在5株嗜水氣單胞菌中都存在II型分泌系統(tǒng)（表6）。而III型分泌系統(tǒng)僅存在于嗜水氣單胞菌J-1中，在其他4株嗜水氣單胞菌中都不存在。在嗜水氣單胞菌XDMG中發(fā)現(xiàn)多個(gè)T6SS的效應(yīng)因子，包括一個(gè)脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-精氨酸重復(fù)序列（PAAR，gene4949），兩個(gè)溶血素共調(diào)控蛋白（Hcp，gene3839，gene4717），3種纈氨酸-甘氨酸重復(fù)序列G（VgrG，gene3035，gene3409，gene4971）。在嗜水氣單胞菌AL09-71中只存在VgrG，缺失PAAR與Hcp。

在嗜水氣單胞菌XDMG中存在3個(gè)極性鞭毛基因簇（gene0132-gene0147、gene0124-gene0126、gene2719-gene2744），5個(gè)IV型菌毛基因（gene0576-gene0580、gene2243-gene2246、gene2293-gene2497、gene2478、gene3398）與一個(gè)I型菌毛基因（gene1946-gene1951），這些基因也存在于其他4株菌中，但是在這5株菌中均不存在與側(cè)鞭毛相關(guān)的基因。

在嗜水氣單胞菌XDMG中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞興奮性腸毒素基因（Alt，gene4667）、細(xì)胞毒素基因（Ast，gene4528）、氣溶素（Aer，gene2040）、溶血素（HlyA，gene3120）、耐熱性的溶血素（gene0601）和溶血素III（gene4993），毒素基因均可在其他4株嗜水氣單胞菌中找到相關(guān)基因。在嗜水氣單胞菌XDMG中有大量編碼胞外酶的基因，并且這些基因具有明顯保守性。此外，嗜水氣單胞菌XDMG菌株中檢測(cè)到了RTX毒素的相關(guān)基因RtxA（gene2749）與RtxC（gene2750），在J-1、AL09_71、AH10和ATCC_7966中同樣存在RTX毒素激活基因RtxA和RtxC。

在嗜水氣單胞菌XDMG基因中參與合成Amonabactin的基因位于一個(gè)簇（gene1421-gene1427）內(nèi)，從而使得嗜水氣單胞菌XDMG在感染宿主時(shí)能夠獲取足夠的鐵元素用于生長(zhǎng)所需。在嗜水氣單胞菌XDMG和其他4株嗜水氣單胞菌的基因中都存在鐵鉻鐵攝?。╣ene3527-gene3530）、鐵攝取調(diào)節(jié)劑（gene3139）。

在嗜水氣單胞菌XDMG的染色體中存在16個(gè)β-內(nèi)酰胺抗性基因，包括AmpC（gene0493）、AmpS（gene4846）和CphA（gene1713），并且存在編碼多黏菌素B（ArnA，gene3680）、耐有機(jī)氫過(guò)氧化物（gene2546-gene2549）、多藥耐藥蛋白（DsbA，gene2156）、肽類抗生素耐藥蛋白（gene3921）和磷霉素抗性蛋白（gene2177、gene2683、gene3268）的基因。在XDMG中有179個(gè)外排泵賦予耐藥性基因，其中包括Smr（gene2646）、Mfs（gene1077、gene1529、gene3362、gene4896）、Dmt（gene1039）、Rnd（gene0290、gene4352）與ABC超家族（gene4866）。

嗜水氣單胞菌中群體感應(yīng)（quorum sensing,QS）系統(tǒng)分為3類，分別為自體誘導(dǎo)物信號(hào)分子-1（AI-1）、自體誘導(dǎo)物信號(hào)分子-2（AI-2）與自體誘導(dǎo)物信號(hào)分子-3（AI-3）。在嗜水氣單胞菌XDMG基因組中發(fā)現(xiàn)編碼AhyR蛋白（gene1912）與AhyI蛋白（gene1913）是AI-1 QS系統(tǒng)的調(diào)控基因。在XDMG基因組存在編碼MetK（gene0484）、SAM甲基轉(zhuǎn)移酶（gene1399）、LuxS（gene1756）、MetH（gene2048）、MtnN（gene3349）及MetE（gene3532）的基因，LuxS基因是AI-2 QS系統(tǒng)中的重要基因。同時(shí)在其基因組中也存在AI-3 QS系統(tǒng)的調(diào)控基因QseB（gene0610）與QseC（gene0611），通過(guò)對(duì)嗜水氣單胞菌XDMG基因組的分析，在嗜水氣單胞菌XDMG基因組中發(fā)現(xiàn)AI-1、AI-2和AI-3 三種QS系統(tǒng)。

為了更加清楚5株嗜水氣單胞菌在致病因素方面的差異，以嗜水氣單胞菌XDMG作為參考菌株，與嗜水氣單胞菌J-1、嗜水氣單胞菌AL09_71、嗜水氣單胞菌AH10和嗜水氣單胞菌ATCC_7966進(jìn)行核苷酸水平與氨基酸水平的序列對(duì)比，主要比對(duì)Hly、Aer、Ast、Alt、AhyI和AhyR六個(gè)致病相關(guān)基因。結(jié)果表明嗜水氣單胞菌XDMG與4株嗜水氣單胞菌在核苷酸水平上均高度保守（表7）。嗜水氣單胞菌XDMG與嗜水氣單胞菌AL09_71在6個(gè)致病相關(guān)基因序列上同源性均達(dá)到了100%；與國(guó)內(nèi)株嗜水氣單胞菌 J-1相比同源性均在99%以上；與嗜水氣單胞菌ATCC_7966和嗜水氣單胞菌AH10相比同源性均在97%以上，存在缺失、插入和替換現(xiàn)象。在氨基酸水平上，以嗜水氣單胞菌XDMG作為參考菌株，5株嗜水氣單胞菌在各致病相關(guān)基因編碼的氨基酸序列上也高度保守，5株嗜水氣單胞菌Hly與AhyI編碼的氨基酸序列的保守程度均達(dá)到100%；嗜水氣單胞菌AL09_71與嗜水氣單胞菌XDMG在Hly、Aer、Ast、Alt、AhyI和AhyR編碼的氨基酸序列上均具有100%的保守性；嗜水氣單胞菌 J-1 除基因AhyR外，Hly、Aer、Ast、Alt和AhyI編碼的氨基酸序列與嗜水氣單胞菌XDMG各基因編碼的氨基酸序列均具有99%以上的保守性；嗜水氣單胞菌ATCC_7966和嗜水氣單胞菌AH10與嗜水氣單胞菌XDMG在Hly、Aer、Ast、Alt、AhyI和AhyR編碼的氨基酸序列上保守性均高于97%（表8）。

在嗜水氣單胞菌XDMG中發(fā)現(xiàn)了12個(gè)外膜蛋白，分別是3個(gè)OmpA（gene2333、gene2864、gene3980）、2個(gè)OmpAI（gene2059、gene2862）、OmpAII（gene2863）、OmpC（gene4897）、OmpK（gene3024）、OmpN（gene0081）、OmpU（gene2094）、OmpW（gene4572）和Omp26La（gene3292）。為了更加清楚5種嗜水氣單胞菌在外膜蛋白因素方面的差異，以嗜水氣單胞菌XDMG作為參考菌株，以上述12個(gè)外膜蛋白與嗜水氣單胞菌J-1、嗜水氣單胞菌AL09_71、嗜水氣單胞菌AH10和嗜水氣單胞菌ATCC_7966進(jìn)行核苷酸水平與氨基酸水平的序列對(duì)比。結(jié)果表明嗜水氣單胞菌XDMG與嗜水氣單胞菌AL09_71、嗜水氣單胞菌ATCC_7966和國(guó)內(nèi)株嗜水氣單胞菌J-1和嗜水氣單胞菌AH10無(wú)論是在核苷酸水平還是氨基酸水平序列均高度保守。嗜水氣單胞菌XDMG與嗜水氣單胞菌AL09_71在核苷酸水平和氨基酸水平上均達(dá)到了100%（表9）。國(guó)內(nèi)株嗜水氣單胞菌J-1 除基因OmpN外，其他外膜蛋白基因序列及各外膜蛋白基因編碼的氨基酸序列與嗜水氣單胞菌XDMG外膜蛋白基因序列和各外膜蛋白基因編碼的氨基酸序列保守性均達(dá)到100%（表10）。嗜水氣單胞菌AH10與嗜水氣單胞菌XDMG相比缺少OmpAI（gene2059）和Omp26La（gene3292），嗜水氣單胞菌ATCC_7966與嗜水氣單胞菌XDMG相比缺少OmpC（gene4897）和OmpAI（gene2059），除此之外，其他外膜蛋白基因序列與XDMG的外膜蛋白基因序列同源性均在94%以上，且嗜水氣單胞菌ATCC_7966和嗜水氣單胞菌AH10各外膜蛋白基因編碼的氨基酸序列與XDMG各外膜蛋白基因編碼的氨基酸序列保守程度均高于94%。

表1 嗜水氣單胞菌 XDMG基因組骨架數(shù)據(jù)Table 1 Aeromonas hydrophila XDMG genome backbone data

表2 五株嗜水氣單胞菌基因組的一般特征Table 2 General characteristics of the five Aeromonas hydrophila genomes

表3 嗜水氣單胞菌 XDMG的基因組島長(zhǎng)度分布Table 3 Distribution of genomic island lengths in A. hydrophila XDMG

表4 嗜水氣單胞菌 XDMG的毒力基因的分類情況Table 4 Classification of virulence genes in A. hydrophila XDMG

表5 嗜水氣單胞菌 XDMG的耐藥基因的分類情況Table 5 Classification of resistance genes in A. hydrophila XDMG

表6 五株嗜水氣單胞菌毒力基因的分布情況Table 6 Distribution of virulence genes in 5 strains of A. hydrophila

表7 以嗜水氣單胞菌XDMG為參考菌株各菌株毒力基因序列的同源性Table 7 Homology of virulence gene sequence of each stra-in using A. hydrophila XDMG as a reference strain/%

表8 以嗜水氣單胞菌XDMG為參考菌株各菌株毒力基因編碼氨基酸序列的保守性Table 8 Conservation of amino acid sequences encoded by virulence genes of each strain using A. hydrophila XDMG as a reference strain/%

表9 以嗜水氣單胞菌XDMG為參考菌株各菌株外膜蛋白基因序列的同源性Table 9 Homology of outer membrane protein gene sequences of each strain using A. hydrophila XDMG as a reference strain/%

表10 以嗜水氣單胞菌XDMG為參考菌株各菌株外膜蛋白基因編碼氨基酸序列的保守性Table 10 Conservation of amino acid sequence encoded by outer membrane protein gene of each strain using A. hydrophila XDMG as a reference strain/%

本研究對(duì)5株嗜水氣單胞菌的O-抗原基因簇進(jìn)行了比較分析發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌XDMG與AL09_71的O-抗原血清型為OX 1型，嗜水氣單胞菌AH10的O-抗原血清型為OX 5型，嗜水氣單胞菌ATCC_7966的O-抗原血清型為OX 6型，嗜水氣單胞菌J-1的O-抗原血清型為O 33型（圖6）。每種類型的O-抗原基因簇在基因的組成及結(jié)構(gòu)上都存在差距，在嗜水氣單胞菌XDMG、AL09_71與ATCC_7966的O-抗原基因簇的組成中有合成GDP-甘露糖所必需的ManA、ManB與ManC基因，在嗜水氣單胞菌J-1和AH10的O-抗原基因簇中不存在這3個(gè)基因。此外嗜水氣單胞菌XDMG與AL09_71的O-抗原基因簇中含有合成Dtdp-糖-3-乙酰氨基-3,6-二脫氧- D-半乳糖所必需的FdtA、FdtB與FdtC基因。此外每種類型的O-抗原基因簇中都含有RmlA、RmlB、RmLC與RmlD基因。以嗜水氣單胞菌XDMG作為參考菌株，對(duì)RmlA、RmlB、RmLC與RmlD基因的核苷酸序列及氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌XDMG與嗜水氣單胞菌AL09_71的4個(gè)基因無(wú)論是在核酸水平還是在氨基酸水平其同源性達(dá)到100%，嗜水氣單胞菌XDMG與嗜水氣單胞菌J-1、AH10和ATCC_7966的RmlB基因在核苷酸水平與氨基酸水平上同源性達(dá)到了80%以上，其他基因無(wú)論是在核苷酸水平上還是在氨基酸水平上其同源性均不足65%（表11-12）。

圖6 本研究嗜水氣單胞菌的O-抗原基因簇Fig. 6 O-antigen gene cluster of A. hydrophila in this study

表12 以嗜水氣單胞菌XDMG為參考菌株各菌株O-抗原基因簇相同基因編碼氨基酸序列的保守性Table 12 Conservation of amino acid sequences encoded by the same gene of O-antigen gene cluster of each strain using A. hydrophila XDMG as the reference strain/%

3 討論

隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，全基因組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物病原菌的鑒定與分析，可通過(guò)基因組的比較分析了解病原菌的遺傳進(jìn)化關(guān)系、致病機(jī)制等，為病原菌的鑒別分類、耐藥性的檢測(cè)、防病策略的制定以及疫苗開(kāi)發(fā)提供有價(jià)值的參考依據(jù)［32-33]。為了了解嗜水氣單胞菌XDMG的基因組結(jié)構(gòu)、功能及其進(jìn)化關(guān)系，本研究對(duì)其進(jìn)行全基因測(cè)序及基因組的比較分析。

嗜水氣單胞菌XDMG測(cè)序結(jié)果顯示，其基因組大小為4.99 Mb，GC含量為60.84%，該基因組包含了4935個(gè)編碼基因，有4061個(gè)編碼基因序列在COG數(shù)據(jù)庫(kù)中得到功能注釋，基因功能注釋占比最多是S（基因功能未知），說(shuō)明在該基因組中還有許多基因功能需要去挖掘。通過(guò)GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋表明，嗜水氣單胞菌XDMG的蛋白功能主要集中在生物過(guò)程的代謝過(guò)程與分子功能的催化活性中。KEGG注釋表明，嗜水氣單胞菌XDMG擁有豐富且完整的代謝途徑，可以使生物體自身不斷進(jìn)行物質(zhì)與能量交換，維持自身活動(dòng)必需物質(zhì)和對(duì)外界環(huán)境及時(shí)作出反應(yīng)，增強(qiáng)病原菌的環(huán)境適應(yīng)性。

如今已經(jīng)清楚嗜水氣單胞菌可以分泌大量可降解和產(chǎn)毒的胞外蛋白，并且嗜水氣單胞菌具有多種分泌機(jī)制，包括I型、II型、III型和VI型分泌系統(tǒng)［34-37]。其中II型分泌系統(tǒng)介導(dǎo)宿主黏附和侵襲、宿主細(xì)胞破壞和組織壞死等一系列致病過(guò)程［38]。VI型分泌系統(tǒng)［39]是一種運(yùn)輸系統(tǒng)，將蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)桨?，與其他毒性決定因素密切相關(guān)，同時(shí)VI型分泌系統(tǒng)自身也是嗜水氣單胞菌重要的毒力因子之一。Ⅱ型與VI型分泌系統(tǒng)嗜水氣單胞菌的致病性中發(fā)揮了重要的作用［40]，本研究發(fā)現(xiàn)在Ⅱ型分泌系統(tǒng)存在于5株嗜水氣單胞菌中，VI型分泌系統(tǒng)存在于4株嗜水氣單胞菌，在嗜水氣單胞菌AL09-71中只存在VI型分泌系統(tǒng)效應(yīng)因子的VgrG，缺失PAAR與Hcp。5株嗜水氣單胞菌中均不存在III型分泌系統(tǒng)。雖然在嗜水氣單胞菌XDMG中不存在III型分泌系統(tǒng)，但是存在與AI-1（AhyI，AhyR）、AI-2（LuxS）和AI-3（QseB、QseC）QS系統(tǒng)相關(guān)的基因，并且QseB與QseC基因序列中存在4 bp的重復(fù)序列ATGA與Khajanchi等［41]發(fā)現(xiàn)的一樣，表明嗜水氣單胞菌XDMG中可能存在AI-1、AI-2和AI-3三種QS系統(tǒng)。群體感應(yīng)是細(xì)菌一種通信系統(tǒng)，涉及分泌和檢測(cè)特定信號(hào)分子，以調(diào)節(jié)基因表達(dá)和多種生理變化［42-44]，并且QS系統(tǒng)在嗜水氣單胞菌致病性中起著重要的作用［42]。嗜水氣單胞菌中存在多種毒力因子，每種因子均發(fā)揮著不同的作用。鞭毛與菌毛是重要的黏附因子，它們?cè)谑人畾鈫伟肭峙c定植宿主的過(guò)程中起著尤為重要作用［45-46]。根據(jù)現(xiàn)有的報(bào)道表明，分泌酶和毒素與嗜水氣單胞菌致病的主要因素之一［39,47]。鐵元素也是嗜水氣單胞菌在宿主中生存所必需的重要元素之一，它對(duì)嗜水氣單胞菌的毒力具有重要的作用［48-49]。Amonabactin是眾所周知的酚類鐵載體，并廣泛存在于氣單胞菌中［50]，它能使嗜水氣單胞菌XDMG在感染宿主時(shí)能夠獲取足夠的鐵元素用于生長(zhǎng)所需。本研究對(duì)5株嗜水氣單胞菌的毒力因子進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌的毒力基因具有保守性和一致性，包括分泌系統(tǒng)、鞭毛、黏附因子、毒素、酶、群體感應(yīng)和鐵獲取等基因。Jin等［39]對(duì)嗜水氣單胞菌HX-3進(jìn)行全基因組測(cè)序，在毒力因子分析結(jié)果中同樣發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌的毒力基因具有保守性和一致性，并且表明II型與VI型分泌系統(tǒng)在嗜水氣單胞菌的致病性中發(fā)揮著重要作用，III型分泌系統(tǒng)對(duì)嗜水氣單胞菌HX-3和其他菌株的毒力貢獻(xiàn)較小。同時(shí)嗜水氣單胞菌的耐藥性也是一個(gè)不得忽視的重點(diǎn)，嗜水氣單胞菌的耐藥性阻礙疾病的治療，對(duì)人類健康的具有潛在威脅［51-52]。本研究對(duì)5株嗜水氣單胞菌的耐藥基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌的耐藥基因同樣具有一致性。

本研究發(fā)現(xiàn)在嗜水氣單胞菌XDMG基因組中存在細(xì)胞興奮性腸毒素基因（Alt）、細(xì)胞毒素基因（Ast）、細(xì)胞毒性腸毒素基因（Act）、溶血素（HlyA）、耐熱性的溶血素和溶血素，這些基因與嗜水氣單胞菌的致病性有密切的關(guān)系［12]。對(duì)比5株嗜水氣單胞菌Alt、Ast、Hly、Aer、AhyI與AhyR基因的核酸與氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是基因序列還是氨基酸序列均具有較高的保守性，表明嗜水氣單胞菌的主要致病基因在遺傳過(guò)程中發(fā)生變異的概率比較小。在張國(guó)亮等［12]通過(guò)對(duì)嗜水氣單胞菌AH10進(jìn)行全基因組測(cè)序及比較分析中也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

外膜蛋白（outer membrane protein，Omp）也是嗜水氣單胞菌重要的毒力因子之一，它們?cè)陴じ胶吞颖芩拗鞣烙鶛C(jī)制方面發(fā)揮著重要作用［53-54]。此外，外膜蛋白可在宿主受到相應(yīng)毒力菌株的攻擊時(shí)提供保護(hù)［55]。由于其數(shù)量豐富，以及細(xì)菌外膜上的暴露區(qū)域，宿主很容易將其識(shí)別為外來(lái)顆粒，并導(dǎo)致產(chǎn)生免疫反應(yīng)［53]。在眾多研究中，外膜蛋白一直被認(rèn)為是潛在的候選疫苗［56-58]，其具有較好免疫原性。例如Yadav等［56]將重組的嗜水氣單胞菌外膜蛋白OmpC免疫露斯塔野鯪發(fā)現(xiàn)， OmpC免疫魚(yú)的血清中銅藍(lán)蛋白水平、髓過(guò)氧化物酶和抗蛋白酶活性在瞬時(shí)和瞬時(shí)方式中顯著增加，并且凝集和溶血活性滴度增加，相對(duì)存活率為66.02%。本研究對(duì)嗜水氣單胞菌的外膜蛋白進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌J-1外膜蛋白OmpN（gene0081）基因不表達(dá)蛋白；嗜水氣單胞菌AH-10缺失了外膜蛋白OmpAI（gene 2059）與 Omp26La（gene3292）；嗜水氣單胞菌ATCC_7966缺失了外膜蛋白OmpAI（gene 2059）與OmpC（gene4897），同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其余外膜蛋白無(wú)論是基因序列還是氨基酸序列均具有較高的保守性，表明嗜水氣單胞菌XDMG具有更加全面的外膜蛋白，采用嗜水氣單胞菌XDMG的外膜蛋白研制基因工程疫苗，其應(yīng)用范圍更加廣泛。

O-抗原對(duì)宿主-病原體相互作用極其重要，因?yàn)樗鼈冊(cè)陴じ?、?xì)胞識(shí)別和生物膜形成中起著關(guān)鍵作用［59-60]。通過(guò)對(duì)5株嗜水氣單胞菌的O-抗原基因簇比較分析發(fā)現(xiàn)，在嗜水氣單胞菌XDMG、AL09_71與 ATCC_7966的O-抗原基因簇的組成中有合成GDP-甘露糖所必需的ManA、ManB與ManC基因，在嗜水氣單胞菌J-1和AH10的O-抗原基因簇中不存在這3個(gè)基因。此外嗜水氣單胞菌XDMG與AL09_71的O-抗原基因簇中含有合成Dtdp-糖-3-乙酰氨基- 3,6-二脫氧- D-半乳糖所必需的FdtA、FdtB與FdtC基因。雖然每種類型的O-抗原基因簇中都含有RmlA、RmlB、RmLC與RmlD基因，但是其同源性不高。O-抗原基因簇部分的可變化學(xué)結(jié)構(gòu)決定了單個(gè)細(xì)菌菌株的免疫特異性，O-抗原基因簇在結(jié)構(gòu)上的差異十分重要，這有助于了解嗜水氣單胞菌的免疫特異性［61]。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)嗜水氣單胞菌XDMG基因組進(jìn)行較為全面的基因組注釋，有利于了解嗜水氣單胞菌基因組的結(jié)構(gòu)、功能及進(jìn)化關(guān)系。對(duì)嗜水氣單胞菌XDMG與4株嗜水氣單胞菌進(jìn)行基因組的比較分析，有利于了解不同區(qū)域的嗜水氣單胞菌在毒力因子、外膜蛋白與O-抗原基因簇等方面的差異，為尋找出不同區(qū)域的嗜水氣單胞菌共同的免疫保護(hù)抗原功能基因奠定基礎(chǔ)，也為下一步研制嗜水氣單胞菌XDMG基因工程疫苗提供理論支持。