譚嬌娜,楊澤華

1.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院,山西太原 030001;2.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院檢驗科,山西太原 030001;

急性肺栓塞(APE)是以各種栓子阻塞肺動脈或其分支為發(fā)病原因的一組疾病或臨床綜合征的總稱,發(fā)病率和病死率較高,是繼急性心肌梗死和腦卒中之后心血管死亡的第三大常見原因,給家庭和國家?guī)砹顺林氐募膊∝摀鶾1]。目前,確診APE的金標準為多層螺旋CT肺動脈造影(CTPA),但存在費用昂貴和一定程度的不便捷性[2]。線粒體DNA(mtDNA)是來自線粒體雙鏈分子的小DNA片段,正常生理情況下,mtDNA被包裹在線粒體的雙層膜結構中,故這些分子在健康人的外周血中以非常低的水平循環(huán),當組織出現(xiàn)氧化應激或者缺氧等損傷時,組織內(nèi)線粒體雙層膜結構遭到破壞,mtDNA便從凋亡、壞死的細胞中釋放入血,導致外周血游離mtDNA水平增加[3]。本研究旨在探討血漿游離mtDNA的變化,分析其與APE患者病情嚴重程度、臨床常用指標間的相關性,并探討其對APE的診斷價值,從而為APE的臨床診治提供幫助。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2021年3月至2022年12月就診于山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院(以下簡稱本院)呼吸與危重癥醫(yī)學科90例首次經(jīng)CTPA確診的APE患者作為研究對象。(1)納入標準:①APE的診斷符合APE指南[4];②發(fā)病到入院時間小于24 h;③入組前未經(jīng)抗凝或溶栓治療;④臨床資料完整。(2)排除標準:①年齡<18歲;②患者住院時間不滿48 h;③臨床資料不完整;④處于終末期心臟或腎衰竭;⑤合并可能與血漿mtDNA水平升高相關的疾病(腫瘤、多發(fā)性創(chuàng)傷、腦卒中、嚴重膿毒癥或感染性休克、急性心肌梗死、心臟驟停)等;⑥存在免疫功能低下或免疫缺陷、免疫抑制。按照歐洲心臟病學會(ESC)和歐洲呼吸學會(ERS)共同制定的《急性肺栓塞診斷和治療指南》[4],根據(jù)APE患者的血流動力學指標、臨床癥狀、肺栓塞風險評分(PESI)、肺栓塞嚴重指數(shù)簡化版(sPESI)評分、是否存在右心功能不全和心臟生物標志物異常,將90例患者分為低危組、中危組、高危組[4],每組30例。選取同期年齡匹配的健康體檢者30例作為健康組。所有研究對象或其家屬簽署知情同意書,本研究符合醫(yī)學倫理學標準,并通過了本院倫理委員會的批準(批件號KYLL-2023-027)。

1.2儀器與試劑 使用儀器主要包括美國QuantStudioTM5實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀、全自動血常規(guī)分析儀(日本Sysmex XN-20)、全自動凝血分析儀(日本Sysmex CS5100)、全自動化學發(fā)光儀(中國萬泰生物Caris200)、不同型號離心機、各種規(guī)格移液器等。使用試劑盒主要包括實時熒光定量PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)、寡核苷酸引物(大連寶生物工程有限公司)、DNA提取試劑盒(中國OmegaBio-Tek公司,SE Blood DNA Kit 50)。使用Oligo 6.0設計特異性引物,根據(jù)所設計引物的堿基序列合成引物(由大連寶生物工程有限公司完成)。寡核苷酸引物序列為16SrRNA F:5′-ACTTTGCAAGGAGAGCCAAA-3′;16SrRNA R:5′-TGGACAACCAGCTATCACCA-3′。

1.3方法

1.3.1臨床資料收集 收集患者性別、年齡、出入院時間、入院診斷、既往基礎疾病,嚴格記錄患者心率、呼吸、血壓、脈搏、體溫、動脈血氧飽和度(SaO2)等一般資料,記錄患者的超聲心動圖、CTPA檢查結果,同時觀察患者治療過程中有無心臟驟停、梗阻性休克、持續(xù)性低血壓等血流動力學不穩(wěn)定狀況。

1.3.2血漿游離mtDNA提取 采集所有研究對象入院第1天未經(jīng)治療的肘靜脈血5 mL,經(jīng)乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝(紫管),將所有標本于30 min內(nèi)經(jīng)3 000×g離心10 min,吸取上清液200 μL于高壓滅菌的EP管中;再將上清液于高速離心機室溫18 000×g離心10 min,輕輕吸取上清液150 μL于新的EP管中,—80 ℃冰箱凍存,用于血漿游離mtDNA檢測。嚴格按照DNA提取試劑盒說明書提取mtDNA。

1.3.3其他臨床常用指標檢測 采集所有受試者5 mL未經(jīng)抗凝或溶栓治療的肘靜脈血于紫管(含EDTA-K2抗凝劑)中,使用日本Sysmex XN-20全自動血常規(guī)分析儀進行血常規(guī)檢測;同時采集5 mL肘靜脈血于淡藍管(含枸櫞酸鈉抗凝劑)中,使用日本Sysmex CS5100全自動凝血分析儀并采用免疫比濁法進行D-二聚體(D-D)、纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(FDP)檢測;另外采集5 mL肘靜脈血于金黃色管(含促凝劑)中,采用中國萬泰生物Caris200全自動發(fā)光儀(磁微粒法)進行心肌肌鈣蛋白T(cTnT)和N末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)檢測。所有試劑均使用原裝配套試劑,操作嚴格按照試劑說明書及相關標準操作規(guī)程進行。

1.4標準曲線的制備 通過分光光度計測定并計算得到質粒的濃度為2.05×1012copies/mL,用滅菌去離子水依次倍比稀釋,得到濃度分別為2.05×1012、2.05×1011、2.05×1010、2.05×109、2.05×108、2.05×107copies/mL的6個標準品,使用美國QuantStudioTM5 PCR 儀制備標準曲線。PCR反應體系為10 μL,95 ℃預變性10 s,95 ℃變性5 s,58 ℃退火8 s,72 ℃延伸10 s,共40個循環(huán)。標準曲線回歸方程為Y=—3.772X+55.079(R2=0.995),其中X為模板拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)值,Y為Ct值。

2 結 果

2.1各組基線資料比較 各組年齡、性別比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);高危組住院天數(shù)明顯多于低危組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),高危組心率明顯快于低危組與健康組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高危組、中危組和低危組SaO2均低于健康組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高危組的收縮壓(SBP)明顯低于中危組、低危組和健康組,高危組的舒張壓(DBP)明顯低于低危組和健康組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組基線資料比較[n/n或M(QR)]

2.2各組血常規(guī)及其他臨床常用指標比較 各組紅細胞體積分布寬度(RDW)、血小板計數(shù)(PLT)水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);高危組白細胞計數(shù)(WBC)、D-D、FDP、cTnT水平明顯高于中危組、低危組和健康組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高危組紅細胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(Hb)水平明顯低于健康組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高危組NT-proBNP水平明顯高于低危組和健康組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2、3。

表2 各組血常規(guī)及其他臨床常用指標比較[M(QR)]

表3 各組D-D、FDP、cTnT、NT-proBNP水平比較[M(QR)]

2.3各組血漿游離mtDNA水平比較 實時熒光定量PCR結果顯示,高危組、中危組、低危組、健康組的血漿游離mtDNA水平分別為10 097 (6 889)、2 983(3 327)、813(529)、272(199) copies/mL。血漿游離mtDNA水平在高危組、中危組、低危組和健康組依次降低,兩兩比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

2.4APE患者血漿游離mtDNA水平與其他臨床常用指標之間的相關性 雙變量Spearman秩相關分析結果顯示,APE患者入院第1天血漿游離mtDNA水平與WBC、D-D、FDP、cTnT、NT-proBNP呈正相關(r=0.304、P=0.004;r=0.446、P<0.001;r=0.532、P<0.001;r=0.673、P<0.001;r=0.666、P<0.001),與RBC、Hb、RDW、PLT無相關性(r=—0.037、P=0.733;r=—0.181、P=0.087;r=0.087、P=0.412;r=—0.084、P=0.429)。

2.5血漿游離mtDNA水平及其他臨床常用指標對APE的診斷效能 血漿游離mtDNA診斷APE的曲線下面積(AUC)為0.955,cut-off值為557 copies/mL,其靈敏度為91%,特異度為90%。見表4。

表4 不同生物學指標對APE的診斷效能

3 討 論

縱向研究顯示,APE的發(fā)病率逐年升高,可能成為威脅人類健康的重要疾病之一[5-6]。APE患者的病情嚴重程度各不相同,表現(xiàn)為從輕微癥狀到右心功能障礙甚至心源性休克。已有研究表明,不同危險分層的患者預后截然不同,高危組患者病死率較高,預后差,因此早期識別死亡風險較高的亞組有助于根據(jù)疾病的嚴重程度盡早給予抗凝和溶栓等精準的治療和重癥護理支持,從而降低病死率[7-8]。肺栓塞的發(fā)病機制涉及多個環(huán)節(jié),大多數(shù)學者認為內(nèi)皮損傷和炎癥在肺栓塞的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn),APE患者的肺組織內(nèi)易出現(xiàn)氧化應激、氧自由基的增加和缺血再灌注損傷[9]。mtDNA是位于線粒體基質中的一個小基因組,對氧化磷酸化(OXPHOS)極為重要。mtDNA在線粒體基因中的個數(shù)被稱為mtDNA的拷貝數(shù)。人體大多數(shù)細胞包含103～104copies mtDNA并保持相對穩(wěn)定,這對于維持體內(nèi)平衡非常重要[10]。研究認為循環(huán)mtDNA水平是嚴重創(chuàng)傷后全身炎癥反應和肺損傷的潛在生物標志物[11-12]。迄今為止,mtDNA已用于腫瘤[13]、心腦血管疾病[14]、炎癥[15]、燒傷[16]等多種危重疾病的研究[17],但mtDNA在APE發(fā)病過程中的作用在我國目前研究較少,深入研究mtDNA在APE發(fā)生和發(fā)展過程中的水平變化及具體作用,不僅可以為尋求新的治療靶點奠定基礎,而且有望成為一種新的生物學標志物用于APE的診斷。

本研究對所有受試者肘靜脈血采用實時熒光定量PCR進行檢測,結果顯示,APE患者血漿游離mtDNA水平與疾病危險分層關系密切,隨著疾病危險分層進展血漿游離mtDNA水平逐漸升高。血漿游離mtDNA水平在高危組、中危組、低危組和健康組依次降低,兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。ARNALICH等[18]在一項前瞻性隊列研究中發(fā)現(xiàn),高危組APE患者mtDNA和核DNA(nDNA)水平明顯高于非高危組APE患者,并且mtDNA是APE患者死亡的獨立預測因子。線粒體作為OXPHOS反應中心,可產(chǎn)生大量的氧自由基,并通過細胞凋亡的內(nèi)在途徑導致細胞死亡。由于mtDNA缺乏組蛋白的保護,修復能力有限,因此mtDNA判斷氧化損傷的敏感性約為nDNA的50倍[19]。已有研究表明,APE發(fā)生時,由于肺動脈發(fā)生栓塞,其支配的肺組織由于血流中斷或血流受阻而發(fā)生壞死及肺梗死,從而引起大面積的組織缺氧,進而降低線粒體氧的可用性,不僅導致患者SaO2下降,且導致ATP快速耗盡[20]。此時全身再灌注損傷可能引發(fā)類似嚴重敗血癥的全身炎癥反應,導致線粒體的雙層膜受損,mtDNA從受損的細胞中釋放,從而檢測到APE患者血漿游離mtDNA水平增加。

FDP是纖維蛋白(原)降解碎片的總稱,其中D-D是最常見、最簡單的纖維蛋白降解產(chǎn)物,其水平升高表明機體處于血液高凝狀態(tài)和繼發(fā)性纖溶系統(tǒng)亢進,在評價血栓性疾病方面具有重要價值[21]。國外研究發(fā)現(xiàn),高危組APE患者血栓負荷程度與D-D水平呈正相關,血栓負荷越重,D-D水平越高[22]。GEISSENBERGER等[23]研究發(fā)現(xiàn),APE患者血漿D-D水平越高,越容易發(fā)生低血壓、休克、心肌肌鈣蛋白升高、心功能受損等表現(xiàn),故認為D-D水平可能與APE的嚴重程度有關。血漿cTnT和NT-proBNP水平升高與右心室功能障礙相關,已有研究證明上述兩項指標對APE患者的危險分層及預后具有重要的價值[24]。在一項大型回顧性隊列研究中發(fā)現(xiàn),APE患者入院時WBC水平與30 d內(nèi)病死率有關,當APE患者入院WBC>9.8×109/L時,APE患者30 d內(nèi)病死率最高,因此WBC升高,APE患者預后較差[25];LIU等[26]研究發(fā)現(xiàn)WBC水平是中危APE患者住院期間不良結局的獨立危險因素。本研究發(fā)現(xiàn),高危組血漿中cTnT、NT-proBNP、D-D、FDP、WBC水平明顯高于低危組和健康組,但在診斷APE時,mtDNA的靈敏度高于cTnT、NT-proBNP、D-D、FDP、WBC、cTnT+NT-proBNP。同時本研究還發(fā)現(xiàn)APE患者血漿游離mtDNA水平與WBC、D-D、FDP、cTnT、NT-proBNP呈正相關(r=0.304、0.446、0.532、0.673、0.666,P<0.05),這一結果表明血漿游離mtDNA水平同WBC、D-D、FDP、cTnT、NT-proBNP一樣與APE疾病密切相關。采用ROC曲線評估m(xù)tDNA和臨床常用指標對APE的診斷價值,結果顯示血漿游離mtDNA診斷APE的AUC為0.955,cut-off值為557 copies/mL,其靈敏度為91%,特異度為90%;在APE診斷方面,血漿mtDNA顯示出比其他臨床常用指標更好的辨別力。因此,mtDNA在診斷APE時,具有較高的靈敏度與特異度,可以成為APE診斷的一種新型生物標志物。

當然,本研究仍存在不足之處。本研究為單中心研究,樣本量較少,可能存在偏倚等誤差,需要在今后的實驗中進行多中心、大樣本量研究;血漿mtDNA的過度積累部分原因可能歸因于清除能力降低,但目前其清除機制尚不清楚,還需要進一步的研究來了解腎功能和肝功能受損患者血漿游離mtDNA降低的機制。隨著分子生物學的不斷發(fā)展,新型冠狀病毒感染疫情加速了基層PCR實驗室的建成,經(jīng)過對PCR技術人員的大量培訓,PCR技術更加成熟。因此,有望將mtDNA作為一項常規(guī)生物學指標,對疾病做出精準的評估。

綜上所述,APE患者血漿游離mtDNA水平升高,并與疾病危險分層嚴重程度有關;血漿游離mtDNA水平檢測有助于診斷APE,mtDNA也可作為預測APE病情嚴重程度的一種標志物。